CN104106468B - 一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：(1)取五指毛桃叶片作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导得到丛生芽；(3)将所述丛生芽置于MS繁殖培养基中进行繁殖；(4)将丛生芽切成单芽置于1/2MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；(5)取完整的带根苗进行炼苗后移植到按质量比为泥炭土:珍珠岩＝1:1的基质中，在该基质中生长一个月后移栽大田。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量五指毛桃的优质种苗，有效解决了五指毛桃的规模化育苗问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
五指毛桃，又名五爪龙、五指牛奶、土北芪等，来源于桑科植物粗叶榕Ficus hirta Vahl.的干燥根，为华南地区习用的中药材。五指毛桃味辛、甘，性平，有健脾补肺、利湿舒筋之功，用于脾虚浮肿、食少无力、肺痨咳嗽、盗汗、风湿痹痛、产后无乳等症，是抗痨丸、喘息丸、复方川贝止咳糖浆、滋肾宁神丸、脑萎缩丸、宫炎平胶囊、宫炎平分散片、妇炎净片等多种中成药的重要原料。
五指毛桃随着市场需求量的不断增加，自然繁殖缓慢，加上滥采乱挖，致使野生资源面临枯竭。为确保五指毛桃资源的可持续利用，发展家种是唯一途径。据此，通过现代生物技术对其进行组织培养快繁技术进行了研究，试图获得大量优质的种苗，为五指毛桃生产提供种源，以满足生产上的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法，它能够快速繁殖出大量适合移栽的优良五指毛桃种苗。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取五指毛桃叶片作为外植体，依次用5％洗洁精水溶液浸泡5-10min、线状自来水冲洗10-15min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到外植体，所述无菌水为经高压灭菌的蒸馏水，
(2)叶片分化获得丛生芽诱导培养：将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养30天，叶片分化后获得丛生芽，其中MS培养基中含0.5-1.5mg/L的6-BA、0.1-0.5mg/L的NAA、0.1-0.5mg/L的2,4-D、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(3)丛生芽繁殖培养：将步骤(2)中得到的丛生芽置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养40天得到健壮植株，其中MS繁殖培养基中含0.1-0.5mg/L的IAA、0.1-0.5mg/L的KT、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(4)无菌苗生根培养：将步骤(2)中得到的丛生芽切成单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养40天得到带根的完整植株，其中1/2MS生根培养基中含0.5-1.5mg/L的IBA、0.1-0.5mg/L的NAA、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(5)炼苗与移栽：步骤(4)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到按质量比为泥炭土:珍珠岩＝1:1的基质中，在该基质中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率为75％。
本发明的突出优点在于：
(1)通过生物技术对五指毛桃进行组织培养快速繁殖，在短时间内培育出大量可供大田栽培的五指毛桃幼苗，显著提高了五指毛桃种苗的繁殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
(2)在MS繁殖培养基中添加0.1-0.5mg/L的激动素KT可促进丛生芽的分化；添加浓度为0.1-0.5mg/L的生长激素吲哚-3-乙酸IAA可促进丛生芽的生长；
在1/2MS生根培养基上组合使用浓度为0.5-1.5mg/L的吲哚丁酸IBA和0.1-0.5mg/L的生长素萘乙酸NAA，可获得带根的完整植株，这些植株经炼苗后可直接移栽到泥炭土+珍珠岩(1:1)的基质。
(3)采用本发明所述的培养方法，得到的单芽增殖系数达到5-8倍，获得的组培苗生根率达到100％，每株平均带6-8个根，移栽泥炭土+珍珠岩(1:1)的基质中活率在94％以上；快速、便捷、高效地进行五指毛桃组织培养，实现五指毛桃组培种苗的规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取五指毛桃叶片作为外植体，依次用5％洗洁精水溶液浸泡5-15min、线状自来水冲洗10-20min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水，
(2)叶片分化获得丛生芽诱导培养：将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养30天，叶片分化后获得丛生芽，其中MS培养基中添加不同浓度的6-BA、NAA和2,4-D(表1)，30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，数据分析发现，6-BA对五指毛桃丛生芽诱导具有极显著影响，NAA对五指毛桃丛生芽诱导具有显著影响，2,4-D对丛生芽的诱导影响不显著。根据丛芽数确定的最适培养基激素浓度为1.0mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA和0.5mg/L的2,4-D。
表1五指毛桃初代诱导培养基筛选结果
表2初代诱导培养基筛选方差分析
Note:F1-0.01(2,2)＝99.0F1-0.05(2,2)＝19.0F1-0.1(2,2)＝9.0
(3)丛生芽繁殖培养：将步骤(2)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养40天得到健壮植株，其中MS繁殖培养基中分别含1.0mg/L的6-BA和不同浓度的IAA和KT(表3)、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。观察发现，对苗的质量有影响，当IAA浓度为0.3mg/L时芽苗为翠绿色，长势快，质量最好，有利于后期诱导生根。KT对五指毛桃试管苗丛生芽的影响显著，根据芽增殖倍数和生长情况确定的最适培养基激素浓度为1.0mg/L的6-BA、0.3mg/L的IAA和0.3mg/L的KT。
表3不同激素水平对五指毛桃丛生芽壮苗效果的影响
注：芽增殖倍数＝(40天后芽数－接种时芽数)/接种时芽数
(4)无菌苗生根培养：将步骤(2)中得到的丛生芽切成单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20天，其中1/2MS生根培养基中分别含不同浓度的的IBA和IAA(表3)、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；观察发现，生根率和平均生根数都主要受IBA浓度的影响，添加低浓度的NAA有利于提高生根率和平均生根数。培养基中添加1.0mg/L的IBA和0.3mg/L的NAA效果最好，生根率为100％，生根数达到7根以上。
表4不同激素水平对五指毛桃组培苗生根效果的影响
(5)炼苗与移栽：步骤(4)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到按质量比为泥炭土:珍珠岩＝1:1的基质中，在该基质中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率为75％。
Claims (1)
1.一种五指毛桃组织培养快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取五指毛桃叶片作为外植体，依次用5％洗洁精水溶液浸泡5-10min、线状自来水冲洗10-15min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸吸去表面水分，得到消毒后的外植体，所述无菌水为经高压灭菌的蒸馏水，
(2)叶片分化获得丛生芽诱导培养：将步骤(1)得到消毒后的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养30天，叶片分化后获得丛生芽，其中MS培养基中添加0.5-1.5mg/L的6-BA、0.1-0.5mg/L的NAA、0.1-0.5mg/L的2,4-D、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(3)丛生芽繁殖培养：将步骤(2)中得到的丛生芽置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养40天得到健壮植株，其中MS繁殖培养基中添加0.1-0.5mg/L的IAA、0.1-0.5mg/L的KT、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(4)无菌苗生根培养：将步骤(3)中得到的丛生芽切成单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养40天得到带根的完整植株，其中1/2MS生根培养基中添加0.5-1.5mg/L的IBA、0.1-0.5mg/L的NAA、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(5)炼苗与移栽：步骤(4)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到按质量比为泥炭土:珍珠岩＝1:1的基质中，在该基质中生长一个月后移栽大田。
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