CN102204512B - 细叶百合的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种细叶百合的组织培养方法，采用细叶百合的鳞茎作为外植体，外植体取自中层鳞片部位，切成条状，灭菌处理后，在培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，白天自然光照，夜间补光4小时/天的培养条件下，依次接种到由MS、1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、5mg/LVc组成的初代诱导培养基，由MS、0.2mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA组成的继代增殖培养基，由1/2MS、0.5mg/L IBA组成的生根培养基，由1/2MS、0.5mg/L IBA、附加2％白糖组成的结球培养基上进行培育，该培养方法可以短时间内获得室内大规模繁殖的细叶百合组培苗，生产率高，具有潜在的生态效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种细叶百合的组织培养及再生体系的建立，包括外植体的选择及灭菌，不同时期培养基的筛选，培养条件对培养物生长发育的影响，快速繁殖技术以及再生体系的建立等内容。
背景技术
细叶百合(Lilium pumilum)又名山丹花，是百合科百合属多年生鳞茎类花卉。株秆高30-40厘米，茎上生叶，细长纤弱，狭长如松叶。花下垂，春末夏初开放，花瓣向外反卷，色鲜红，通常无斑点，有时近基部有少数斑点，有光泽，具清香，甚美丽。花期6-8月，果期8-9月。生山坡草地或林缘。分布于中国黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南、山东、山西、内蒙古、陕西、宁夏、甘肃、青海等省区。
细叶百合株形秀丽，是我国东北、华北、西北地区著名的野生花卉，宜成片种植于疏林下、草坪中。而且由于其生性强健、耐寒耐旱，在北方干旱、半干旱地区自然降水的条件下即可正常生长，是百合属中分布最广、纬度偏北的一种，非常符合北方干旱地区城市园林绿化、美化发展的需要，应用前景十分广阔。但是由于其自然繁殖系数很低，且存在自然退化问题，加之人为过度采挖和自然因素的影响，使其成为稀有濒危植物。目前常见的人工繁殖细叶百合的方法，主要是采用分植小鳞茎、播种法及鳞片扦插法，不但繁殖数量有限，还极易导致病害感染和品质退化。
在百合的优良品种快速繁殖、脱毒复壮、新品种培育以及应用生物技术进行分子育种中，组织培养都是比较适宜的方法。组织培养法繁殖取材方便，不受自然条件的限制，可以不断进行大量繁殖，是细叶百合引种栽培、快速繁殖、脱毒复壮以及新品种培育的最有效方法，可以在短期内获得大量小苗，解决了栽培中种源较少的问题，为细叶百合今后的研究以及规模化、产业化开发利用提供了理论依据。因此，深入开展细叶百合组织培养研究已成为科研工作者亟待进行的工作之一。
百合的组织培养始于20世纪50年代，自1957年Robb首次用百合鳞片进行组织培养获得成功后，百合离体繁殖技术日益成熟，在优良品种的快速繁殖、新品种培育以及种质资源保存等方面发展较快。迄今为止，国内外组织培养成功的百合种及品种已超过数百个，但多见于报道的是用于鲜切花生产的栽培品种，对中国野生百合的组织培养研究较少。总结近20年来的文献数据，仅十余种野生百合组织培养成功，有关细叶百合的更是屈指可数。
CN1460409(03135142.5)公开了一种兰州百合的快速繁殖方法，选取兰州百合鳞片、叶和根的切段，采用外植体消毒后接入含不同植物激素的培养基，诱导产生芽，继代培养后移入生根培养基，当试管苗高约3-5厘米时移栽入种植练苗基质，鳞片不定芽的诱导和快繁培养基为MS，BA 2mg/L、NAA 0.2mg/L，根、叶诱导和繁殖培养基为MS，BA 2mg/L、NAA0.4mg/L，试管苗生根培养基为1/2MS，NAA 0.3mg/L，温度27±2℃，光照强度2000Lx，光照时间12hour/day，pH为5.8。CN101156552(200710066339.1)公开了一种东方百合组织培养脱毒的方法，选择健康的百合鳞片分切后诱导出不定芽，将不定芽转接到生长培养基上，变温培养30天后，切取茎尖移植到生长培养基中继续变温培养30～60天后，便可得到所需的无毒株系。本发明脱毒效果显著，效率高，一般品种可达到90％～100％。其操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。
但上述培养基和方法并不适用于细叶百合，本发明系统地研究了细叶百合组培中不同阶段的最佳培养基，最适的培养条件及培养方式；在利用试管小鳞茎剥离扩繁及种子再生培养方面具有独特的创新；为细叶百合再生体系的建立提供了科技支撑，解决了细叶百合繁殖速度慢的难题，为实现抗旱景观绿化新理念增添了品种并具有较强的实用性，为实现细叶百合鳞茎的工厂化生产奠定了可靠的基础。
发明内容
本发明的目的是利用植物组织培养方法，短时间内获得室内大规模繁殖的细叶百合组培苗，以形成下厂化、规模化、产业化生产，并克服传统鳞茎繁殖倍数低，速度慢，易病害感染和品质退化的缺点，可常年提供组培苗的新的繁殖方法。
本发明选取了细叶百合的鳞片为外植体，研究包括外植体的选择及灭菌、不同时期培养基的筛选、培养条件对培养物生长发育的影响，、快速繁殖技术以及再生体系的建立等内容。
在本发明的实施方案中，包含一种细叶百合(Lilium pumilum)的组织培养方法，其特征在于它由以下步骤组成：
步骤1：采用细叶百合的鳞茎作为外植体，对其进行灭菌处理，用于不定芽的诱导；再利用试管再生小鳞茎作为外植体，直接接入进行诱导。
步骤2：将外植体接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Vc5mg/L的初代诱导培养基上，诱导出细叶百合鳞片不定芽；
步骤3：将步骤2分化出的长约1-3cm的鳞片不定芽取出，接种于MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L的继代增殖培养基上，增殖出大量细叶百合组培苗；
步骤4：将步骤3分化出的长约3-4cm的细叶百合组培苗，接种于1/2MS+IBA 0.5mg/L的生根培养基上，直接进行诱导生根；
步骤5：将步骤4分化出的细叶百合生根苗，接种于1/2MS+IBA 0.5mg/L+食用白糖2％的结球培养基中，诱导进行结球。
各步骤的培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。
在本发明实施方案中，在本领域技术人员公知范围内，NAA、6-BA、IBA、Vc分别是萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、吲哚丁酸、维生素C的简称。
在本发明的实施方案中，进一步根据细叶百合鳞茎的不同部位的诱导分化率不同，通过实验表明鳞片分化能力(分化频率和速度)为外部＞内部，诱导率依次为外层＞中层＞内层。而且，同一鳞片不同部位诱导分化率也存在明显差异，诱导率顺序为下部＞中部＞上部，即鳞片基部分化能力最强，中部次之，上部最差。又由于外层鳞片机械损伤程度高，病虫害影响严重，鳞片含菌量高，接种后污染严重，而内层鳞片边缘易形成愈伤组织，获得的苗长势较弱，中层鳞片的芽诱导率及接种后芽的生长情况都最好，污染率低。此外，当切块小于1cm2时几乎不产生分化。
因此，本发明明确提出细叶百合进行组织培养时的最佳外植体为中层鳞片，其诱导率及接种后芽的生长势最好，是初代进行芽诱导培养的最佳外植体。还提出纵向分割的鳞片，将鳞片切成条块，使每条都带有基部组织，每条均可诱导分化出芽，其诱导率均可达90％以上，这样就使每片鳞片的诱导分化率成倍的提高了。
在本发明实施方案中，利用试管再生小鳞茎是一个有效提高初代培养诱导分化率的手段。试管小鳞茎的再生诱导率可达80％以上，污染率几乎为零，而且由原初鳞片组培后得到的试管小鳞茎的鳞片的分化能力＞原初培养鳞片的分化能力。这样，既节省了野生资源，又简化了外植体的灭菌程序，提高了诱导分化率，是加快繁殖的主要方法。
同时，在本发明实施方案中，接种细叶百合时以不同方式插入培养基后的诱导率也不同：鳞片背面插入＞基部斜插＞腹面插入，说明接种操作时鳞片的放置方法和与培养基的接触部位也影响其诱导能力，而近轴面更易诱导芽产生。
本发明还包括了外植体表面杀菌剂及灭菌方法的选择，对不同种类消毒剂，相同种类消毒剂的不同浓度、不同处理时间和方法进行对比，改变了常规对鳞片外植体在流水中冲洗的处理方法，提出在采样及整个处理过程中注意控制水分，成功的控制了初代诱导培养阶段的污染问题，大大降低了污染率，提高了诱导成功率。在前处理过程中尽量减少自来水的冲洗和浸泡时间，除外层鳞片稍加冲洗去掉泥土外，中、内层鳞片一般不需要冲洗，同比常规在流水条件下将鳞片外植体冲洗和每个处理过程都用无菌水淋洗的情况，污染率下降30％-40％左右。
本发明还经过比较试验，筛选出细叶百合组培各个阶段最佳培养基：
a.初代诱导培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/+Vc 5mg/L是细叶百合鳞片最佳的初代诱导培养基，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达80％。
b.继代增殖培养基：MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，高浓度的6-BA对百合鳞茎增殖有抑制作用，浓度过高，可抑制芽的生长，随着6-BA浓度的增高，超过2.0mg/L时，丛生矮化明显，易产生玻璃化苗。
c.生根培养基：1/2MS+IBA 0.5mg/L，低盐浓度对细叶百合的生根有利，生根率达88.9％。生根时基部可新增带根的小鳞茎，平均可达3-4个。
d.结球培养基：1/2MS+IBA 0.5mg/L+白糖2％，细叶百合无论是在MS还是在1/2MS培养基中，糖含量增加对结球都有促进作用，相比较1/2MS+IBA 0.5mg/L+白糖2％更为理想，结球数量多，鳞茎较大，抱合程度高，在剥离和移植出苗率效果都最佳。
本发明具体实施方案中还包括细叶百合生根后的炼苗移栽和温室培养阶段：将在生根培养基中生长健壮，根长到1-2cm的试管苗进行炼苗移。首先进行2天的闭瓶炼苗，再进行2-3天的开瓶炼苗，然后转入温室栽植。移栽时小心地倒出试管苗，用清水冲洗根部残留培养基，用50ppm的IBA沾根8min后，栽入事先设计的4种基质中。结果表明，蛭石+羊粪+磷酸二铵作为栽培基质效果最佳，非常适合小苗根系的生长，移栽成活率可达80％以上。当组培苗长至3-4片真叶后，可移入假植圃假植或直接定植，在此段时期可适量施一些稀释的复合肥水。
具体实施方式
以下实施例进一步说明了本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1.细叶百合外植体的选取和操作方法对不定芽诱导的影响
1.材料与方法：外植体为细叶百合的鳞茎，种球采自内蒙古呼和浩特市周边山区，采集时间为春季将要出芽或刚出芽时，外植体取自细叶百合的中层鳞片部位。随后对外植体进行灭菌，处理步骤为：鳞片稍加冲洗去掉泥土→在超净台上放入无菌容器中→在每升滴加2-3滴“Tween-20”的洗涤剂溶液中浸泡60秒→转入75％的酒精中浸泡30秒→再用0.15％的升汞溶液处理20分钟→无菌水淋洗3-4次→无菌滤纸上吸干水分→直接接入预先配制好的培养基中。需注意的是每次处理的材料不宜过多，整个过程中要不断轻摇，并避免碰伤鳞片组织。实践证明，这种消毒效果较好，采用升汞溶液的效果也优于通常用的次氯酸钠溶液。利用试管再生小鳞茎，再生后诱导率高，平均可达80％以上。
2.外植体大小对细叶百合鳞片成活率及不定芽诱导的影响
将鳞片分成五组，分别切成0.5cm×0.5cm、1cm×1cm、半片、纵切的条状以及整片，其后接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Vc 5mg/L诱导培养基上，培养环境为：培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。第35天分别统计成活率和不定芽的诱导率，结果如表1所示。
具体统计公式为：
成活率＝(有生活力的外植体数/接种的外植体总数)×100％
初代芽诱导率＝(出芽的外植体数/接种的外植体总数)×100％
继代增殖倍数＝(诱导出的丛生芽数/接入单株芽的总数)×100％
生根率＝(分化根的外植体数/接种的外植体总数)×100％
表1外植体大小对细叶百合鳞片成活率及不定芽诱导的影响
3.鳞片部位对细叶百合不定芽定诱导的影响
将鳞片分为外层、中层和内层三组，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Vc 5mg/L诱导培养基上，培养环境为：培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。第30天分别统计不定芽的诱导率，结果如表2所示。
表2鳞片部位对细叶百合不定芽诱导的影响
实施例2.细叶百合组织培养各个阶段最佳培养基的筛选
1.激素浓度及其配比对细叶百合鳞片不定芽诱导的影响
鳞片接入诱导培养基中后，经3-7天大约40％的鳞片转变为紫红色，再经6-30天开始转为绿色并逐渐形成小突起，经15-45天，大约90％的鳞片转绿。转绿后30-55天在鳞片基部、中部或上部形成不定芽，但基部形成不定芽的情况较多，上部几乎不产生不定芽。
鳞片接入含不同植物激素与配比的MS培养基上，培养环境为：培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。第40天分别统计不定芽的诱导率，结果如表3所示，并为了防止外植体的褐变每升中加5mg的VC，达到了理想的效果。
表3激素浓度及其组合对细叶百合鳞片不定芽诱导的影响
2.激素浓度对细叶百合不定芽继代增殖的影响
将鳞片分化出的长约1-3cm鳞片不定芽取出，接种于含不同浓度的6-BA、NAA的MS培养基上，培养环境为：培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。第45天分别观察其增殖及生长情况，结果如表4所示。
表4激素浓度及其组合对细叶百合不定芽增殖的影响
3.盐浓度对细叶百合生根培养的影响
将分化出的长约3-4cm细叶百合组培苗，分别接种于MS和1/2MS培养基上，附加IBA0.5mg/L，培养环境为：培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。直接进行诱导生根第20天观察其生根情况，结果如表5所示。
表5无机盐浓度对组培苗生根的影响
4.糖浓度对细叶百合结球培养的影响
经过实验，细叶百合组培苗无论是在MS还是在1/2MS培养基中，糖含量增加时，对结球都有促进作用，相比较1/2MS+IBA 0.5mg/L+白糖2％更为理想，结球数量多，鳞茎较大，抱合程度高，在再次剥离和移植出苗时效果都是最佳的。
实施例3.细叶百合生根后的炼苗移栽和温室培养
将在生根培养基中生长健壮、根长到1-2cm的试管苗进行炼苗移栽，首先进行2天的闭瓶炼苗，再进行2-3天的开瓶炼苗，然后转入温室栽植。移栽时小心倒出试管苗，用清水冲洗净根部残留培养基，用50ppm的IBA沾根8min后，栽入事先设计的4种基质中。结果表明，蛭石+羊粪+磷酸二铵作为栽培基质效果最佳，非常适合小苗根系的生长，移栽成活率可达80％以上。当组培苗长至3-4片真叶后，可移入假植圃假植或直接定植，在此段时期可适量施一些稀释的复合肥水。
Claims (4)
1.一种细叶百合的组织培养方法，其特征在于它由以下步骤组成：
步骤1：采用细叶百合的鳞茎作为外植体，外植体取自细叶百合的中层鳞片部位，随后将其切成条状，对其进行灭菌处理，用于不定芽的诱导；再利用试管再生小鳞茎作为外植体，直接接入进行诱导；
步骤2：将外植体接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Vc5mg/L的初代诱导培养基上，诱导出细叶百合鳞片不定芽；
步骤3：将步骤2分化出的长1-3cm的鳞片不定芽取出，接种于MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L的继代增殖培养基上，增殖出大量细叶百合组培苗；
步骤4：将步骤3分化出的长3-4cm的细叶百合组培苗，接种于1/2MS+IBA 0.5mg/L的生根培养基上，直接进行诱导生根；
步骤5：将步骤4分化出的细叶百合生根苗，接种于1/2MS+IBA 0.5mg/L+2％的食用白糖的结球培养基中，诱导结球。
2.权利要求1所述的一种细叶百合的组织培养方法，其特征在于：各步骤的培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。
3.权利要求1所述的一种细叶百合的组织培养方法，其特征在于，步骤1的外植体的灭菌处理过程为：鳞片稍加冲洗去掉泥土，在超净台上放入无菌容器中，在每升滴加2-3滴“Tween-20”的洗涤剂溶液中浸泡60秒，转入75％的酒精中浸泡30秒，再用0.15％的升汞溶液处理20分钟，无菌水淋洗3-4次，最后无菌滤纸上吸干水分，直接接入预先配制好的培养基中。
4.权利要求1所述的一种细叶百合的组织培养方法，其特征在于：步骤2接种过程中，细叶百合外植体采用鳞片背面插入培养基。
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