CN109526746B - 一种白鹤芋叶柄组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白鹤芋叶柄组织培养方法，该方法为：以白鹤芋的叶柄为外植体，通过消毒清洗、愈伤组织培养、愈伤分化培养、生根培养获得白鹤芋。能够获得生长良好、生产成本低的白鹤芋，且生根培养在无糖培养基中，生根诱导率为100%，为工厂化生产节约成本提供技术支撑。

Description

一种白鹤芋叶柄组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种白鹤芋叶柄组织培养方法，属于白鹤芋叶柄组织培养技术领域。
背景技术
白鹤芋(学名：Spathiphyllum kochii)为天南星科白鹤芋属植物，别名：白掌、一帆风顺和苞叶芋；其深绿的叶片和洁白的佛焰苞显得格外清新优雅，是较好的观叶观花植物；还能吸收空气中的甲醛、氨气和苯 等有毒气体具有净化空气的功效，是适合室内养殖的花卉。然而现有的分株繁殖为常规繁殖方式，阻碍了优良品种的推广和新品种的开发。现有的技术也有主要围绕白鹤芋的顶芽和茎尖进行扩繁技术的研究，取得了很好的成果。但并未记载对白鹤芋叶柄的培养技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种白鹤芋叶柄组织培养方法，以解决上述现有技术中存在的问题。
本发明采取的技术方案为：一种白鹤芋叶柄组织培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)于早7点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株，母株为白鹤芋幼嫩叶柄；
(2)用棉球清理掉叶柄上的杂质，并对叶柄进行清洗消毒；
(3)经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段1/2 处切一小刀，深度为叶柄直径的1/3-1/2，以增加伤口的表面积利于愈伤组织的诱导，将叶柄接种至MS培养基中，该MS培养基添加6-BA、NAA、琼脂 6g/L和蔗糖30g/L，培养条件为暗培养，25±2℃；
(4)叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基以MS为基本培养基，添加6-BA、NAA琼脂6g/L和蔗糖30g/L，培养条件为光培养、光照时间12h/d、光照强度100％、培养温度 25±2℃；
(5)选取步骤(4)中生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基以1/2MS为基本培养基，培养基中添加激素IBA0.5mg/L，培养条件为：100％光照强度，16h/d。
优选的，上述步骤(2)中清洗消毒：加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75％酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次 0.1％HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍。
优选的，上述步骤(3)中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1mg/L、 0.5mg/L、6g/L和30g/L。
优选的，上述步骤(4)中愈伤分化培养基添加的6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为3.0mg/L、0.1mg/L、6g/L和30g/L。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明以白鹤芋的叶柄为外植体，通过消毒清洗、愈伤组织培养、愈伤分化培养、生根培养获得白鹤芋，能够获得生长良好、生产成本低的白鹤芋，愈伤组织培养的MS培养机中添加 6-BA1mg/L、NAA0.5mg/L、琼脂6g/L和蔗糖30g/L，能够让白鹤芋愈伤组织诱导率最高达86.67％，愈伤分化培养的培养基中添加6-BA3mg/L、 NAA0.1mg/L、琼脂6g/L和蔗糖30g/L，能够让白鹤芋愈伤分化芽数量能够达到31个，生根培养在无糖培养基中，丛生芽在10天左右分化出根原基，生根诱导率为100％，为工厂化生产节约成本提供技术支撑。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进行进一步介绍。
实施例1：一种白鹤芋叶柄组织培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)于早7点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株，母株为白鹤芋幼嫩叶柄；
(2)用棉球清理掉叶柄上的杂质，并对叶柄进行清洗消毒；
(3)经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段1/2 处切一小刀以增加伤口的表面积利于愈伤组织的诱导，将叶柄接种至MS培养基中，该MS培养基添加6-BA、NAA、琼脂6g/L和蔗糖30g/L，培养条件为暗培养，25±2℃；
(4)叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基以MS为基本培养基，添加6-BA、NAA琼脂6g/L和蔗糖30g/L，培养条件为光培养、光照时间12h/d、光照强度100％、培养温度 25±2℃；
(5)选取步骤(4)中生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基以1/2MS为基本培养基，培养基中添加激素IBA0.5mg/L，培养条件为：100％光照强度，16h/d。
优选的，上述步骤(2)中清洗消毒：加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75％酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次 0.1％HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍。
优选的，上述步骤(3)中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1mg/L、 0.5mg/L、6g/L和30g/L。
优选的，上述步骤(4)中愈伤分化培养基添加的6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为3.0mg/L、0.1mg/L、6g/L和30g/L。
为了进一步说明本发明的效果，进行如下实验：
试验材料与方法
1.1试验材料
试验材料在内蒙古赤峰市天鑫花卉繁育基地12号白鹤芋培育大棚于早7 点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株。试验材料为白鹤芋幼嫩叶柄，现采现用。
1.2试验方法
1.2.1材料的消毒方法
采集回实验室的材料用棉球清理掉叶柄上的杂质。加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75％酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次0.1％HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍。
1.2.2不同激素对叶柄愈伤组织的诱导
经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段1/2处切一小刀以增加伤口的表面积利于愈伤组织的诱导，将叶柄接种至MS培养基中，培养基中添加6-BA(1.0mg/L、2.0mg/L)、NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L)，共6个处理，每个处理60个外植体，每个处理附加琼脂6g/L、蔗糖30g/L。培养条件为暗培养，25±2℃。每隔7d观察一遍并记录叶柄愈伤组织诱导情况。
1.2.3叶柄愈伤组织的分化
叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，以MS为基本培养基设置6-BA(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L)和NAA(0.1mg/L、 0.2mg/L)6组激素水平；附加琼脂6g/L、蔗糖30g/L进行组合试验。培养条件为光培养、光照时间12h/d、光照强度100％、培养温度25±2℃。每隔7d 观察一次，记录愈伤分化情况。
1.2.4丛生芽的无糖生根培养
选取生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加0.5g/L的活性炭(1)空白试验：培养基中不添加激素和蔗糖；(2)无糖培养：培养基中无蔗糖有激素IBA0.5mg/L；(3)有糖培养：培养基中添加蔗糖30g/L激素IBA0.5mg/L。每个处理接种60个芽。培养条件为：100％光照强度，16h/d。30d后统计苗的根长、根数及生根数等。
2结果与分析
2.1 6-BA与NAA组合对叶柄愈伤组织诱导的影响
叶柄在初代培养基培养10d左右，在伤口处陆续膨大；30d左右愈伤组织呈小米状、排列紧密。愈伤在诱导前期，愈伤量较少(表1)，通过表1可看出，在同一6-BA浓度下，随着NAA浓度的升高而升高，且具有显著性差异 (P<0.05)；在同一NAA浓度下，6-BA浓度为1mg/L较2mg/L愈伤组织诱导率高。当6-BA浓度为1mg/L，NAA浓度为0.5mg/L时，愈伤组织诱导率最高达 86.67％，且愈伤量较多。所以选取MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L为适宜叶柄愈伤组织诱导培养基。然而，愈伤组织需经过2次继代，才能获得大量的愈伤组织。
表1 6-BA与NAA组合对愈伤组织诱导的影响
Figure BDA0001929312050000051
Figure BDA0001929312050000061
2.2不同激素水平对愈伤组织分化的影响
叶柄愈伤组织转移至分化培养基中，前期愈伤组织分化芽较少，随着培养时间的增加愈伤组织不断分化，同时芽丛也不断的增殖。并且每组处理的分化芽均叶片翠绿，长势良好。从表2可以得出，在同一NAA浓度下，随着 6-BA浓度的增加，愈伤组织的芽丛分化数也随之增加；当6-BA浓度为3.0 mg/L，NAA浓度为0.1mg/L时，愈伤分化芽数量最高为31个。因此，选取 MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L为愈伤组织增殖分化培养基。
表2 6-BA与NAA组合对愈伤组织分化的影响
处理 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 接种愈伤数(个) 愈伤分化芽均数(株)
1 1.0 0.1 20 17
2 1.0 0.2 20 14
3 2.0 0.1 20 22
4 2.0 0.2 20 27
5 3.0 0.1 20 31
6 3.0 0.2 20 29
2.3无糖培养对丛生芽生根的影响
将芽丛切下成单株，接种至培养基中进行生根诱导，在CK处理中，丛生芽在第15天分化出根原基，在第30天，丛生芽生根率为93.3％，平均根数为 4.46条，平均根长为1.98cm，但叶片由原先的翠绿色变微黄色，但生长势良好；在有糖培养基中，丛生芽在第10天左右分化出根原基，且分化芽诱导率为100％，平均根数为5.97条，平均根长为2.38cm，叶片浓绿，生长良好；在无糖培养基中，丛生芽在10天左右分化出根原基，生根诱导率为100％，平均根数为5.5条，平均根长为2.44cm，叶片泛黄，生长良好。从数据可得，丛生芽的生根诱导率受生长素的影响，并且叶片的颜色深度与碳源有着密切的联系，但试管苗经过炼苗移栽后，从生长情况观察没有明显差异。可见，无糖生根诱导可为规模化生产，节约生产成本提供参考意见。
表3无糖培养对丛生芽生根的影响
Figure BDA0001929312050000071
3结论与讨论
试验以叶柄作为外植体，筛选出MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)+琼脂 (6g/L)+蔗糖(30g/L)为适宜愈伤组织培养基；而MS+6-BA(3mg/L) +NAA(0.1mg/L)+琼脂(6g/L)+蔗糖(30g/L)为愈伤分化培养基，分化芽数达30以上；然而丛生芽在无糖培养基中的生根诱导率为100％，且生长良好，在生产上可节约成本，所以选MS+IBA(0.5mg/L)不添加蔗糖的培养基作为丛生芽的生根培养基。
本试验在生根阶段研究无糖条件下对试管苗生根的影响，得出在适当外界条件下，培养基中不添加碳源丛生芽的生根率能达到100％且生长良好，为工厂化生产降低生产成本提供可靠的技术参考。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种白鹤芋叶柄组织培养方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）于早7点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株，母株为白鹤芋幼嫩叶柄；
（2）用棉球清理掉叶柄上的杂质，并对叶柄进行清洗消毒，清洗消毒：加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75%酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次0.1%HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍；
（3）经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段1/2处切一小刀，深度为叶柄直径的1/3-1/2，将叶柄接种至培养基MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L中诱导愈伤组织，培养条件为暗培养，25±2℃；
（4）叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基为MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，培养条件为光培养、光照时间12h/d、光照强度100%、培养温度25±2℃；（5）选取步骤（4）中生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg/L+0.5g/L AC，培养条件为：100%光照强度，16h/d。
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