CN101861833B - 凤尾兰花药组织培养的方法及专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凤尾兰花药组织培养的方法及其专用培养基。本发明提供的凤尾兰的愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：6-BA、KT、NAA、碳源和凝胶剂；其中6-BA的终浓度是4.5-5.5mg/L，KT的终浓度是0.2-0.4mg/L，NAA的终浓度是0.4-0.6mg/L。本发明的方法是将凤尾兰花药置于本发明的专用愈伤组织诱导培养基上培养得到愈伤组织后，转接到分化培养基上分化培养得到再生植株的。本发明的愈伤组织诱导培养基可有效地诱导凤尾兰花药分化出愈伤组织，凤尾兰花药愈伤组织的诱导率可达22.7％以上。本发明方法可为单倍体育种提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养和作物育种领域，特别涉及一种凤尾兰花药组织培养的方法及其专用培养基。
背景技术
凤尾兰又名菠萝花，为百合科丝兰属常绿灌木。原产北美，具有较高的观赏价值，被塞舌尔定为国花。中国长江流域各地普遍栽培，是庭院绿化的理想花木，且具有很高的环保价值，对二氧化硫、氯气等有很强的抗性，并且能吸收有害气体，是工矿污染区的绿化佳品(高尚，2005)。
庞仪等(庞仪，等.凤尾兰的组织培养[J].热带农业科学，2006，26(5)：24-27.)以风尾兰(Yucca gloriosa Linnaeus)的茎尖、幼嫩茎段及嫩叶为外植体进行组织培养。结果表明以嫩叶为外植体的愈伤组织诱导率最高，由茎段诱导的愈伤组织继代增殖最好，由茎尖诱导的愈伤组织诱导不定芽表现最佳。筛选出最佳初代培养基MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L；愈伤组织增殖培养基MS+6-BA 8.0mg/L+NAA 0.1mg/L；不定芽诱导培养基为MS+6-BA 5.0mg/L+KT 1.0mg/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA4.0mg/L+NAA 0.05mg/L+椰水100mL/L；生根培养基为1/2MS+NAA 0.2mg/L。
花药培养技术不但可以获得纯系育种材料，以利用杂种优势，缩短育种年限和提高育种效率；而且可以获得的纯合二倍体材料进行遗传变异规律研究，使育种有坚实的遗传理论依据，减少育种的盲目性。经检索国内外资料，未见关于凤尾兰花药培养及绿苗再生的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于凤尾兰花药诱导愈伤组织的专用培养基。
本发明提供的愈伤组织诱导培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：6-BA、KT、NAA、碳源和凝胶剂；
其中6-BA的终浓度是4.5-5.5mg/L，KT的终浓度是0.2-0.4mg/L，NAA的终浓度是0.4-0.6mg/L；
上述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。
表1.MS基本培养液的溶质
上述愈伤组织诱导培养基中6-BA的终浓度最好是5.0mg/L，KT的终浓度最好是0.3mg/L，NAA的终浓度最好是0.5mg/L。
本发明的另一目的是提供一种生产凤尾兰单倍体再生植株的方法。
本发明提供的生产凤尾兰单倍体再生植株的方法，包括以下步骤：
1)将凤尾兰的花药置于上述本发明的愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
2)将步骤1)中得到的愈伤组织转移到的分化培养基上进行分化培养，得到单倍体再生植株。
上述步骤2)中，分化培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、KT、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中6-BA的终浓度为5.5-6.5mg/L，KT的终浓度为1.5-2.5mg/L，NAA的终浓度为0.3-0.7mg/L；上述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。
该分化培养基中，优选6-BA的终浓度为6.0mg/L，KT的终浓度为2.0mg/L，NAA的终浓度为0.5mg/L。
在本发明的愈伤组织诱导培养基和分化培养基中凝胶剂均可以是琼脂、卡拉胶或Gelrite等，凝胶剂的用量以能达到培养基的硬度为基础，可根据需要适当调整其用量；若采用琼脂作为凝胶剂，其终浓度均可为5-10g/L，优选可为8.0g/L。培养基中碳源可以是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等，若为蔗糖，其终浓度均可为25-40g/L，优选可为30g/L。
本发明方法步骤1)中的花药是经过预处理得到的；所述预处理为：将凤尾兰的花蕾用自来水冲洗后，低温暗处理3天，然后75％(体积百分比)的酒精消毒约40秒，用无菌水冲洗至少一次，再用0.1％(质量百分比)升汞灭菌约6分钟，最后用无菌水冲洗至少一次。
本发明的愈伤组织诱导培养基可有效地诱导凤尾兰花药分化出愈伤组织，在本发明实施例1中，经过3次重复，凤尾兰花药愈伤组织的诱导率为22.7％、25.2％和32.0％。本发明方法中诱导的愈伤组织能有效地被分化为再生植株，在实施例1中愈伤组织的分化率可达到3.3％以上，不定芽的分化率达8.2％以上。
本发明方法为单倍体育种提供基础，可获得具有纯合遗传背景的后代植株(品系)，固定优良外源基因，固定属间杂种优势，从而可从中选择在育种目标上有重大突破的新品种、新品系，提高选择效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中单核靠边期小孢子。
图2为本发明实施例1形成初期的愈伤组织。
图3为本发明实施例1形成后期的愈伤组织。
图4为本发明实施例1愈伤组织分化形成的芽。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、凤尾兰单倍体植株的制备及统计观察
一、花药诱导愈伤组织的获得及其统计观察
1、花药的预处理
采集处于单核靠边期的金边凤尾兰(购自北京小营花卉市场)的花蕾，先用自来水冲洗3-5遍，在4℃低温下，暗处理3天，然后用75％(体积百分比)的酒精消毒40秒，用无菌水冲洗5次，再用0.1％(质量百分比)升汞灭菌6分钟，无菌水冲洗5次。
2、花药诱导愈伤组织的获得
将上述步骤1中预处理后的花蕾用镊子小心将花药(单核靠边期的花药小孢子如图1所示)接种到愈伤组织诱导培养基上，在25℃的条件下，先经过一周的暗培养，然后在温度为23℃，光照强度为2000Lx，光照时间12小时/天的条件下培养4个月，若有褐化现象可经过每40天继代培养一次，使接种的花药脱分化形成愈伤，得到愈伤组织(形成初期的愈伤组织如图2所示，形成后期的愈伤组织如图3所示)。
为获得所需足够数量的愈伤组织可对得到的愈伤组织进行继代培养。
上述的愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、KT、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中6-BA的终浓度是5.0mg/L，KT的终浓度是0.3mg/L，NAA的终浓度是0.5mg/L，碳源为蔗糖，蔗糖的终浓度是30g/L，凝胶剂为琼脂，琼脂的终浓度是8.0g/L；pH为5.9，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。
3、统计观察
实验重复3次，统计观察上述步骤2中愈伤组织的诱导情况，实验结果见下表2，从表2可以看出，愈伤组织的诱导率可达22.7％以上。
表2.愈伤组织的诱导率
| 重复次数 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ |
| 实验接种的培养皿(个) | 15 | 15 | 15 |
| 花药(枚) | 282 | 286 | 278 |
| 愈伤组织(块) | 64 | 72 | 89 |
| 诱导率(％) | 22.7％ | 25.2％ | 32.0％ |
二、单倍体再生植株的获得及统计观察
1、单倍体再生植株的获得
将上述步骤一中步骤2得到的愈伤组织转接到的分化培养基上，在23℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12小时/天的条件下，进行分化培养得到再生植株(愈伤组织分化形成的芽如图4所示)。
上述分化培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、KT、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中6-BA的终浓度为6.0mg/L，KT的终浓度为2.0mg/L，NAA的终浓度为0.5mg/L；碳源为蔗糖，蔗糖的终浓度是30g/L，凝胶剂为琼脂，琼脂的终浓度是8g/L；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，培养基的pH为5.9。
2、统计观察
实验重复3次，统计观察上述步骤1中再生分化的情况，实验结果见下表3，从表3可以看出，3次重复愈伤组织的分化率分别为3.3％、6.1％和5.5％，不定芽的分化率分别为8.3％、10.6％和8.2％。
表3.再生分化培养的分化率
3、检测分析
将上述步骤1中获得的再生植株进行倍性鉴定，采用流式细胞仪测定进行凤尾兰花药培养再生植株进行倍性构成的鉴定。
采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪(Flow cytometric)进行倍性检测，并用CellQuest(BD公司)软件获取数据，ModFit软件(Yerity Software House公司分析结果。
测定程序如下：
取植株(包括对照和再生植株，对照为非再生的上述步骤一中步骤1的金边凤尾兰，再生植株为本实施例步骤二中得到的再生植株)上层新鲜叶片0.5g，分别在2mL细胞裂解液中用锋利的刀片切碎、过滤、收集滤液，经800r/min离心5min后，用PI(Propidiumiodide碘化丙啶，50μg/mL)染液对细胞核DNA进行荧光标记，置于暗处30min后，用流体细胞仪进行植株倍性鉴定。
经检测结果如下：在被检测的9株再生植株中，成功检测出2株单倍体植株，1株四倍体植株，其余均为二倍体植株。
实施例2、植株倍性加倍
将上述实施例1所获得的检测为单倍体的2株单倍体金边凤尾兰植株用浓度为0.1％秋水仙素(质量百分比)处理24小时，即可获得纯合二倍体植株。
处理方法为：首先将0.1％秋水仙素过滤灭菌，然后用无菌的棉球蘸取适量的上述秋水仙素溶液，再将小棉球放在植株的生长点部位，处理24小时。
Claims (8)
1.一种凤尾兰的愈伤组织诱导培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：6-BA、KT、NAA、碳源和凝胶剂；
所述愈伤组织诱导培养基中6-BA的终浓度是4.5-5.5mg/L，KT的终浓度是0.2-0.4mg/L，NAA的终浓度是0.4-0.6mg/L；
所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质是如下终浓度的物质：1650mg/L的NH4NO3、1900mg/L的KNO3、170mg/L的KH2PO4、370mg/L的MgSO4·7H2O、440mg/L的CaCl2、37.3mg/L的FeSO4·4H2O、27.8mg/L的Na2EDTA、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、6.2mg/L的H3BO3、0.83mg/L的KI、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的CoCl2·6H2O、2.0mg/L的甘氨酸、0.4mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆素、0.5mg/L的烟酸以及100mg/L的肌醇。
2.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导培养基，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基中6-BA的终浓度是5.0mg/L，KT的终浓度是0.3mg/L，NAA的终浓度是0.5mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的愈伤组织诱导培养基，其特征在于：所述凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite；所述琼脂的终浓度是5-10g/L；
所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖；所述蔗糖的终浓度是25-40g/L。
4.根据权利要求3所述的愈伤组织诱导培养基，其特征在于：所述琼脂的终浓度是8.0g/L；所述蔗糖的终浓度是30g/L。
5.一种生产凤尾兰单倍体再生植株的方法，包括以下步骤：
1)将凤尾兰的花药置于权利要求1-4中任一所述的愈伤组织诱导培养基上培养，得到愈伤组织；
2)将步骤1)中得到的愈伤组织转移到分化培养基上进行分化培养，得到单倍体再生植株；所述分化培养基是在MS基本培养液中添加6-BA、KT、NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中6-BA的终浓度为5.5-6.5mg/L，KT的终浓度为1.5-2.5mg/L，NAA的终浓度为0.3-0.7mg/L；
所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质是如下终浓度的物质：1650mg/L的NH4NO3、1900mg/L的KNO3、170mg/L的KH2PO4、370mg/L的MgSO4·7H2O、440mg/L的CaCl2、37.3mg/L的FeSO4·4H2O、27.8mg/L的Na2EDTA、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、6.2mg/L的H3BO3、0.83mg/L的KI、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的CoCl2·6H2O、2.0mg/L的甘氨酸、0.4mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆素、0.5mg/L的烟酸以及100mg/L的肌醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述分化培养基中6-BA的终浓度为6.0mg/L，KT的终浓度为2.0mg/L，NAA的终浓度为0.5mg/L。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite；所述琼脂的终浓度是5-10g/L；
所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖；所述蔗糖的终浓度是25-40g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述琼脂的终浓度8.0g/L；所述蔗糖的终浓度是30g/L。
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