CN102939900A - 诱导ot型百合花药获得（双）单倍体植株的方法及其培养基 - Google Patents

诱导ot型百合花药获得（双）单倍体植株的方法及其培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种诱导OT型百合花药获得（双）单倍体植株的方法及其培养基，属于植物组织培养和花卉育种领域。首先将OT型百合的花蕾置于低温、黑暗条件下1~3天；然后将OT型百合的花药置于培养基上，经过热激处理，培养，最终得到单倍体或者双单倍体植株；所用的培养基为在B5培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和琼脂，得到的固体培养基，其中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度是1.5~2.5mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是1.5~2.5mg/l，蔗糖的浓度是60~100g/l，琼脂的浓度是10~15g/l。本发明为单倍体育种提供多种纯合的育种材料，提高了育种选择和育种效率。

Description

诱导OT型百合花药获得(双)单倍体植株的方法及其培养基
技术领域
本发明涉及一种诱导OT型百合花药获得（双）单倍体植株的方法及其培养基，通过OT百合花药培养得到再生单倍体或双单倍体（二倍体）植株，属于植物组织培养和花卉育种领域。
背景技术
单倍体是指具有配子染色体数的个体或组织，仅有一个染色体组所构成的个体称为单倍体，单倍体经过自然或人工加倍后即可得到双单倍体。单倍体、双单倍体材料在植物育种和遗传基础理论研究中都具有重要的意义，可用于分子标记选择和遗传图谱绘制，是转基因最佳的受体群体。在育种实践中，利用双单倍体育种技术不仅可以快速获得纯系，缩短育种周期，而且可以得到更多更广泛的变异，特别是隐性性状更容易得到表现，从而丰富育种基础材料的类型，加速育种进程。
目前获得单倍体的一种主要手段是离体花药培养获得单倍体再生植株。一般通过花药培养获得再生植株有二种发生方式，即胚状体发育途径（直接发育途径）和愈伤组织发育途径（间接发育途径）。第一种途径通常是由花药内部的小孢子直接发育而来，即由具有单套染色体的细胞发育而来，所得到的再生植株几乎全部为单倍体或双单倍体。第二种途径通常是由花药壁细胞直接发育得到愈伤组织，即由具有二套染色体的体细胞发育而来，所得到的再生植株大多与亲本具有相同的基因组成，所以这一途径通常是不希望出现的。
百合(Lilium spp.)为百合科百合属多年生球根花卉植物，是世界著名的商品花卉之一，在鲜切花市场占有十分重要的地位。近年来，OT型百合（东方百合与喇叭百合的杂交种）逐渐成为国内花卉市场上较为流行的百合类型。目前百合的新品种越来越多，对经济性状优良的品种的研究和利用逐渐成为百合育种工作的重点。百合杂交育种主要存在两个问题，一是育种周期长，从种子播种到开花要经历2-3年时间，生长周期长；二是种间杂交困难。百合杂交育种普遍存在不亲和性的问题，不仅受精困难，而且受精后很难获得种子，因此单倍体育种技术理论上可以成为百合育种的另一种主要手段。所以百合的单倍体育种技术研究具有重要的生产意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种诱导OT型百合花药获得（双）单倍体植株的培养基。本发明提供的诱导培养基用于获得OT型百合单倍体植株或双单倍体（二倍体）植株。
一种诱导OT型百合花药获得（双）单倍体植株的培养基，是在B5培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、蔗糖和琼脂，得到的固体培养基，其中，6-BA的终浓度是1.5~2.5mg/l，2,4-D的终浓度是1.5~2.5mg/l，蔗糖的终浓度是60~100g/l，琼脂的终浓度是10~15g/l。
优选的，6-BA的终浓度是2mg/l，2,4-D的终浓度是2mg/l，蔗糖的终浓度是90g/l，琼脂的终浓度是14g/l。
本发明培养基的完整配方（组成和终浓度）：
Figure BDA00002448643800021
本发明的另一目的是提供一种诱导OT型百合花药获得（双）单倍体植株的方法，采用上述诱导培养基获得OT型百合单倍体植株或双单倍体（二倍体）植株。
一种诱导OT型百合花药获得（双）单倍体植株的方法，包括以下步骤：
1）将OT型百合的花蕾置于低温、黑暗条件下1~3天；
2）将OT型百合的花药置于上述本发明的诱导培养基上，经过热激处理，培养，最终得到单倍体或者双单倍体（二倍体）植株。
步骤（1）中，低温为4~6℃，黑暗条件是指密闭、不透光的环境，以1天最好。
步骤（2）中，所述的花药先经过预处理，即将花蕾剥去萼片和花瓣，然后将花药用75%酒精浸泡45~60秒，之后用2.5wt%次氯酸钠溶液浸泡12~15分钟，最后用无菌去离子水冲洗。
将预处理后的花药放在诱导培养基上，然后对花药进行热激处理，所述的热激处理（胁迫处理）为将花药置于37℃及黑暗条件下放置7天，经过热激处理后，于25℃培养1~2个月。
本发明的（双）单倍体诱导培养基可以有效地诱导OT型百合花药分化和再生，不定芽发生率可高达60%。
本发明通过对OT型百合花药进行离体培养，诱导花药内部的小孢子发育为完整的单倍体或者双单倍体植株，为单倍体育种提供多种纯合的育种材料，创造了更多地新型种质，提高了选择和育种效率。
附图说明
图1为本发明由花药内部小孢子经体胚途径形成的不定芽。
图2为本发明将不定芽转移到成苗培养基后长大的成苗。
图3-1和图3-2分别为本发明获得的单倍体植株和二倍体植株的流式细胞仪检测结果。
图4为本发明再生植株根尖染色体计数（单倍体）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
一、OT型百合单倍体植株的诱导方法
1、取材
采集处于单核靠边期的OT型百合的花蕾，处于这个时期的花蕾形态特征为：花蕾呈绿色，包裹紧密，花药乳白色，略泛青；镜检可见绝大部分小孢子处在单核靠边期。基因型不同，蕾长不同，一般蕾长在2.5~3.5厘米之间。
2、花药的预处理
将采来的花蕾置于密闭容器内，置于4-6℃冰箱中1-2天。然后剥去萼片和花瓣，在超净工作台中，用75%酒精处理45~60秒，之后用2.5%次氯酸钠消毒12~15分钟，然后用无菌水冲洗3次，每次2分钟。
3、花药的胁迫处理
本实验采用的胁迫处理方式为热激处理，即将花药于37℃及黑暗条件下放置7天。
4、花药胚状体的获得
将预处理后的花药腹面向下平放在诱导培养基上，经过胁迫处理后，于25℃培养1-2个月。如图1所示为本发明由花药内部小孢子经体胚途径形成的不定芽（再生芽）。
上述的诱导培养基是在B5培养基中添加6-BA、2,4-D、蔗糖和琼脂得到的固体培养基：其中6-BA的终浓度是2mg/l，2,4-D的终浓度是2mg/l，蔗糖的终浓度是90g/l，琼脂的终浓度是14g/l；pH为6.0，B5基本培养基的溶剂是水。
表1 本发明采用的B5培养基的完整配方（不含蔗糖和琼脂）
  名称   化学式   终浓度mg/l
  大量元素
  硝酸钾   KNO3   2500
  硫酸铵   (NH4)2SO4   134
  磷酸二氢钠   KH2PO4   130.44
  硫酸镁   MgSO4   121.56
  无水氯化钙   CaCl2   113.23
  微量元素
  碘化钾   KI   0.75
  硼酸   H3BO3   3
  一水硫酸锰   MnSO4·H2O   10
  七水硫酸锌   ZnSO4·7H2O   2
  二水钼酸钠   Na2MoO4·2H2O   0.25
  五水硫酸铜   CuSO4·5H2O   0.025
  六水氯化钴   CoCl2·6H2O   0.025
  铁盐
  乙二胺四乙酸二钠   Na2-EDTA   37.3
  七水硫酸亚铁   FeSO4·7H2O   27.8
  有机成分
  肌醇  100
  盐酸硫胺素  VB1   10
  盐酸吡哆醇  VB6   1
  烟酸  VB5   1
在上述的B5培养基中添加6-BA、2,4-D、蔗糖和琼脂得到的本发明的培养基，见表2。
表2 本发明培养基的配方
  名称   化学式   终浓度mg/l
  硝酸钾   KNO3   2500
  硫酸铵   （NH4）2SO4   134
  磷酸二氢钠   KH2PO4   130.44
  硫酸镁   MgSO4   121.56
  无水氯化钙   CaCl2   113.23
  碘化钾   KI   0.75
  硼酸   H3BO3   3
  一水硫酸锰   MnSO4·H2O   10
  七水硫酸锌   ZnSO4·7H2O   2
  二水钼酸钠   Na2MoO4·2H2O   0.25
  五水硫酸铜   CuSO4·5H2O   0.025
  六水氯化钴   CoCl2·6H2O   0.025
  乙二胺四乙酸二钠   Na2-EDTA   37.3
  七水硫酸亚铁   FeSO4·7H2O   27.8
  肌醇   100
  盐酸硫胺素   VB1   10
  盐酸吡哆醇   VB6   1
  烟酸   VB5   1
  6-苄氨基腺嘌呤   6-BA   2
  2,4-二氯苯氧乙酸   2,4-D   2
  蔗糖   90000
  琼脂   14000
5、单倍体植株的获得
将在诱导培养中获得的长度大于1cm的再生芽转移到成苗（生根）培养基上，3-4周后幼芽长大成苗。如图2所示为本发明将不定芽转移到成苗培养基后长大的成苗。
上述的成苗培养基是在MS培养基中添加蔗糖和琼脂得到的固体培养基：其中蔗糖的终浓度是30g/l，琼脂的终浓度是7g/l；pH为5.8，MS培养基的溶剂是水。
表3 本发明采用的MS培养基的完整配方（不含蔗糖和琼脂）
  名称  化学式   终浓度mg/l
  大量元素
  硝酸钾  KNO3   1900
  硝酸铵  NH4NO3   1650
  磷酸二氢钾  KH2PO4   170
  硫酸镁  MgSO4·7H2O   370
  氯化钙  CaCl2·2H2O   440
  微量元素
  碘化钾  KI   0.83
  硼酸  H3BO3   6.2
  硫酸锰  MnSO4·4H2O   22.3
  硫酸锌  ZnSO4·7H2O   8.6
  钼酸钠  Na2MoO4·2H2O   0.25
  硫酸铜  CuSO4·5H2O   0.025
  氯化钴  CoCl2·6H2O   0.025
  铁盐
  乙二胺四乙酸二钠  Na2-EDTA   37.3
  硫酸亚铁  FeSO4·7H2O   27.8
  有机成分
  肌醇   100
  甘氨酸   2
  盐酸硫胺素  VB1   0.1
  盐酸吡哆醇  VB6   0.5
  烟酸  VB5   0.5
表4 本发明成苗培养基的完整配方
  名称  化学式   终浓度mg/l
  硝酸钾  KNO3   1900
  硝酸铵  NH4NO3   1650
  磷酸二氢钾  KH2PO4   170
  硫酸镁  MgSO4·7H2O   370
  氯化钙  CaCl2·2H2O   440
  碘化钾  KI   0.83
  硼酸  H3BO3   6.2
  硫酸锰  MnSO4·4H2O   22.3
  硫酸锌  ZnSO4·7H2O   8.6
  钼酸钠  Na2MoO4·2H2O   0.25
  硫酸铜  CuSO4·5H2O   0.025
  氯化钴  CoCl2·6H2O   0.025
  乙二胺四乙酸二钠  Na2-EDTA   37.3
  硫酸亚铁  FeSO4·7H2O   27.8
  肌醇   100
  甘氨酸   2
  盐酸硫胺素  VB1   0.1
  盐酸吡哆醇  VB6   0.5
  烟酸  VB5   0.5
  蔗糖   30000
  琼脂   7000
二、再生植株倍性的观察和检测
1、再生植株的倍性检测
将上述步骤5中获得的再生植株进行倍性鉴定。采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪（Flow cytometric）进行倍性检测，并用CellQuest（BD）软件获取数据，ModFit软件分析结果。
测定程序如下：
取亲本植株作为对照，花药再生植株为待测植株。分别取对照植株和待测植株组培苗的新鲜叶片各0.2克置于直径为6cm的培养皿中，分别加入2ml裂解液，用锋利的刀片切碎、100目细胞筛网过滤，收集滤液，经800r/min离心6min后，弃掉上清液，再分别加入200μlPI（Propidiumiodide，碘化丙啶，50μg/ml）染液对细胞核DNA进行荧光标记，置于黑暗条件下20分钟后，用流式细胞仪进行植株倍性鉴定。图3-1和图3-2分别为本发明获得的单倍体植株和二倍体植株的流式细胞仪检测结果。
检测结果如下：被检测的78株再生植株中有4株为单倍体，74株为二倍体。
2、再生植株的染色体计数
根据流式细胞仪检测结果，选取单倍体和二倍体再生植株各4株进行染色体计数。
具体步骤：截取再生植株（组培苗）根尖，放入1M盐酸溶液中，60℃水浴7min后制片观察。图4为本发明花药再生植株根尖染色体计数（单倍体，n=12）。
计数结果：单倍体植株主要含有12条染色体，但在个别细胞中也观察到了染色体数目增多的现象。二倍体植株含有24条染色体，和流式细胞仪检测结果一致。
本发明的（双）单倍体诱导培养基可以有效地诱导OT型百合花药分化和再生，不定芽发生率可高达60%。

Claims (8)

1.一种诱导OT百合花药获得单倍体或双单倍体植株的培养基，其特征在于：在B5培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和琼脂，得到固体培养基，其中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度是1.5~2.5mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是1.5~2.5mg/l，蔗糖的浓度是60~100g/l，琼脂的浓度是10~15g/l。
2.根据权利要求1所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的培养基，其特征在于：6-苄氨基腺嘌呤的浓度是2mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是2mg/l，蔗糖的浓度是90g/l，琼脂的浓度是14g/l。
3.根据权利要求1所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的培养基，其特征在于：所述B5培养基的组成和浓度如下：
Figure FDA00002448643700011
4.一种诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，包括以下步骤：
1）将OT型百合的花蕾置于低温、黑暗条件下1~3天；
2）然后将OT型百合的花药置于权利要求1-3中任一项所述的培养基上，经过热激处理，培养，最终得到单倍体或者双单倍体植株。
5.根据权利要求4所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，其特征在于：所述低温的温度为4~6℃。
6.根据权利要求4所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，其特征在于：所述的花药先经过预处理，将花药用75%酒精浸泡45~60秒，之后用2.5wt%次氯酸钠溶液浸泡12~15分钟，最后用无菌水冲洗。
7.根据权利要求4所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，其特征在于：所述的热激处理为将花药置于37℃及黑暗条件下放置7天。
8.根据权利要求4所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，其特征在于：所述的培养为经过热激处理后，于25℃培养1~2个月。
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《园艺学报》 20121231 韩秀丽等 "新铁炮百合单倍体植株的诱导" 第263-268页尤其是 第37卷, 第2期 *
曲伟娣: ""药用植物黄檗的组织培养及其愈伤组织中生物碱累积研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
韩秀丽等: ""新铁炮百合单倍体植株的诱导"", 《园艺学报》 *

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