CN101116424A - 高效诱导培养百合小鳞茎的方法 - Google Patents

高效诱导培养百合小鳞茎的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高效诱导培养百合小鳞茎的方法。其特征在于经过胚状体诱导培养及胚状体组织增殖培养，达到较高的快繁速率，再经过籽球分化培养及籽球膨大培养，获得围径3cm以上的可移栽籽球。本发明的籽球增殖率可达到100万粒/年以上，是常规方法的10倍，利用本发明可在获得较多数量小籽球的同时，增加大规格、大粒径籽球的比率。本发明优化了优质百合种球的培育程序，缩短了百合优质种球的繁育时间，且籽球的定植成活率高，生产成本低，适用于切花百合原种的规模化快繁生产。

Description

高效诱导培养百合小鳞茎的方法
技术领域
本发明涉及一种在试管内高效生产百合籽球的方法，属于植物种球繁育技术领域。
背景技术
百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本鳞茎植物，是世界著名的观赏花卉，被广泛应用于花卉装饰。近十年来随着我国人民生活水平的提高，大量优良的观赏栽培品种陆续从国外引入我国，成为我国花卉市场中的高档切花种类。百合繁殖系数不高是百合种球生产中一个突出的问题。我国大面积栽培的切花百合，种球绝大部分由荷兰进口。种球的质量和数量已成为我国百合切花生产的重要限制因素。
百合主要以小鳞茎进行分株或鳞片扦插繁殖，通常1株百合每年只能得到3-200个小鳞茎，繁殖速度及数量非常有限。组织培养是快速繁殖种球较为有效的方法。在百合组培种球种苗的培养过程中，已有的报道均采用组培苗增殖或在试管内直接生成小籽球的培养方式，其增殖率在10万粒/年以下，但仍不能满足市场需求量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种繁殖速度快，数量多的高效诱导培养百合小鳞茎的方法，以满足市场需求。
本发明通过下列技术方案实现：一种高效诱导培养百合小鳞茎的方法，包括无菌外植体的获取及鳞片剥取，其特征在于经过下列步骤进行培养：
A、胚状体诱导培养：在无菌条件下，将灭菌后的鳞片切块接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中，在温度为23±3℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为1500-2000Lx的条件下培养15-20d，获得胚状体愈伤组织：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA    2.0-4.0
萘乙酸NAA             0.1-0.5
蔗糖                  30000
琼脂                  5500
pH                    5.8；
B、胚状体组织增殖培养：在无菌条件下，将步骤A获得的胚状体愈伤组织切片后转入单位为mg/L的下列增殖培养基中，在温度为23±3℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为1500-2000Lx的条件下培养15-20d，使胚状体组织分化成大量胚芽：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA     1.0-2.0
萘乙酸NAA              0.1-0.5
蔗糖                   30000
琼脂                   5500
pH                     5.8；
C、籽球分化培养：将步骤B生成的丛生胚芽分割成片状，转入单位为mg/L的下列培养基中进行籽球分化培养，其培养条件为：温度18-22℃，全黑暗遮光，培养时间25-35d，即在切块及周围直接生成小籽球：
MS基本培养液
萘乙酸NAA           0-0.5
蔗糖                60000
琼脂                5500
活性炭              300
pH                  5.5-5.8；
D、籽球膨大培养：将步骤C生成的小籽球分切成单个，剥离外部不规则的小鳞片后转入单位为mg/L的下列培养基中进行生根及膨大培养，培养条件：温度18-22℃，全黑暗遮光，培养时间15-20d，籽球长出根系：
1/2MS基本培养液
萘乙酸NAA         1.0-2.0
蔗糖              60000-90000
琼脂              5500
活性炭            300
pH                5.5-5.8；
E、籽球出瓶及包装：将合格籽球从培养基中取出后放入装清水的盆中清洗，滤干水分后立即放入塑料筛中，采用农用链霉素∶百菌清＝1∶1的比例按混合800倍液浸泡20-30min，滤干消毒液后用打孔的塑料袋包装，及时放置到冷库中贮藏。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，即在百合瓶内结球技术的基础上，通过鳞片基盘分生细胞培养，诱导胚性细胞团和胚状体，获得大量的胚状体再生小鳞茎，在短期内实现了百合优质籽球的快速繁殖。该技术具有如下优越性：(1)籽球再生率高，增殖数量大，是常规瓶内鳞片结球快繁的10倍以上；(2)生产的试管籽球结构完整、整齐，无性系变异不明显；(3)用该技术籽球产出的速度快，出瓶时间一致性较高，可集中种植；(4)出瓶的籽球在冷藏阶段采用裸藏方式，无需添加包装基质，易于处理，定植后成活率较高。本发明优化了优质百合种球的培育程序，缩短了百合优质种球的繁育时间，大大降低了生产成本。适于百合种球的规模化生产。
相关试验结果：本发明改进了百合籽球的再生途径，主要从鳞片直接诱导体细胞胚发生，然后再生小籽球。培养周期缩短，增殖率提高。本方法与常规方法的操作程序及生产效率如(附图)所示：在常规方法中，百合籽球的增殖通过鳞片再生籽球，籽球剥离鳞片的途径进行，增殖率通常在5倍左右，每年可继代7次左右。年增殖率为10万粒左右；本发明通过鳞片诱导出的胚状体增殖，增殖率4倍左右，每年可继代10次以上，再进行籽球分化培养，年增殖率可达100万粒左右。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的实质内容，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于这些。
实施例1
1、优选经检测无病虫害，无病毒，健康的切花用百合品种“Siberia”的种球作为外植体；
2、在流水下将种球冲洗干净，剥取鳞片；鳞片剥离时尽量扳住鳞片的下部剥取，以保证每片鳞片带有基盘组织；用洗衣粉水充分摇晃清洗干净；用0.1％的升汞溶液浸泡40min；用浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡15min；无菌水漂洗2次，平放在接种纸上滤干水分；
3、胚状体诱导培养：在无菌条件下，将灭菌后的鳞片切块接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中培养，在温度为23±3℃，光照时间为10h/d，光照强度为2000Lx的环境条件下培养，随时观察，并及时淘汰污染的外植体，培养15d后，胚状体愈伤组织自切口处生成：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA)      3.0
萘乙酸(NAA)               0.5
蔗糖                      30000
琼脂                      5500
pH                        5.8；
4、胚状体组织增殖培养：在无菌条件下，将上述2步骤获得的胚状体愈伤组织切片后转入单位为mg/L的下列增殖培养基中，在温度为23±3℃，光照时间为10h/d，光照强度为2000Lx的条件下培养，15d后，胚状体组织分化成大量胚芽，增殖率5倍：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA)        1.0
萘乙酸(NAA)                 0.1
蔗糖                        30000
琼脂               5500
pH                 5.8
5、籽球分化培养：将上述3步骤生成的丛生胚芽分割成片状，转入单位为mg/L的下列培养基中进行籽球分化培养，培养条件：温度18℃，全黑暗遮光，35d后，切块及周围可直接生成小籽球，80％以上的小籽球围径1.0-2.0cm，每个切块可生成小籽球3-4个：
MS基本培养液
萘乙酸(NAA)      0.1
蔗糖             60000
琼脂             5500
活性炭           300
pH               5.5
6、籽球膨大培养：将4步骤生成的小籽球分切成单个，剥离外部不规则的小鳞片后转入单位为mg/L的下列培养基中进行生根及膨大培养，培养条件：温度18℃，全黑暗遮光，培养15d后，籽球长出根系，50d天后，多数围径达到3cm以上：
1/2MS基本培养液
萘乙酸(NAA)       1.0
蔗糖              90000
琼脂              5500
活性炭            300
pH                5.5
7、籽球出瓶及包装：将合格籽球从培养基中取出后放入装清水的盆中清洗，滤干水分后立即将籽球放入塑料筛中，采用农用链霉素∶百菌清＝1∶1的比例按混合800倍液浸泡20min；滤干消毒液后用打孔的塑料袋包装，及时放置到冷库中贮藏；冷贮温度2-4℃，冷贮时间3个月；在冷藏期内，需每隔两周检查包装箱内湿度及小籽球的情况，过干可适量用喷壶喷水，避免小籽球脱水；观察其根系及青霉发生情况，一旦发现需及时处理。
实施例2
1、优选经检测无病虫害，无病毒，健康的切花用百合品种“Tiber”的种球作为外植体；
2、在流水下将种球冲洗干净，剥取鳞片；鳞片剥离时尽量扳住鳞片的下部剥取，以保证每片鳞片带有基盘组织；用洗衣粉水充分摇晃清洗干净；用浓度为0.2％的升汞溶液浸泡30min；用浓度为3％的次氯酸钠溶液浸泡15min；无菌水漂洗3次，平放在接种纸上滤干水分；
3、胚状体诱导培养：在无菌条件下，将灭菌后的鳞片切块接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中培养，在温度为23±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500Lx的环境条件下培养，随时观察，并及时淘汰污染的外植体，培养20d后，胚状体愈伤组织自切口处生成：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA)   2.0
萘乙酸(NAA)            0.1
蔗糖                   30000
琼脂                   5500
pH                     5.8；
4、胚状体组织增殖培养：在无菌条件下，将上述2步骤获得的胚状体愈伤组织切片后转入单位为mg/L的下列增殖培养基中，在温度为23±3℃，光照时间12h/d，光照强度为1500Lx的条件下培养，20d后，胚状体组织分化成大量胚芽，增殖率5-7倍：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA)     2.0
萘乙酸(NAA)              0.2
蔗糖                     30000
琼脂                     5500
pH            5.8
5、籽球分化培养：将上述3步骤生成的丛生胚芽分割成片状，转入单位为mg/L的下列培养基中进行籽球分化培养，培养条件：温度22℃，全黑暗遮光，25d后，切块及周围可直接生成小籽球，80％以上的小籽球围径1.0-2.0cm，每个切块可生成小籽球3-4个：
MS基本培养液
萘乙酸(NAA)       0.1
蔗糖              60000
琼脂              5500
活性炭            300
pH                5.5
6、籽球膨大培养：将4步骤生成的小籽球分切成单个，剥离外部不规则的小鳞片后转入单位为mg/L的下列培养基中进行生根及膨大培养，培养条件：温度22℃，全黑暗遮光，培养20d后，籽球长出根系，40d天后，多数围径达到3cm以上：
1/2MS基本培养液
萘乙酸(NAA)         1.0
蔗糖                90000
琼脂                5500
活性炭              300
pH                  5.5
7、籽球出瓶及包装：将合格籽球从培养基中取出后放入装清水的盆中清洗，滤干水分后立即将籽球放入塑料筛中，采用农用链霉素∶百菌清＝1∶1的比例按混合800倍液浸泡30min；滤干消毒液后用打孔的塑料袋包装，及时放置到冷库中贮藏；冷贮温度2-4℃，冷贮时间3个月；在冷藏期内，需每隔两周检查包装箱内湿度及小籽球的情况，过干可适量用喷壶喷水，避免小籽球脱水；观察其根系及青霉发生情况，一旦发现需及时处理。

Claims (1)

1.一种高效诱导培养百合小鳞茎的方法，包括无菌外植体的获取及鳞片剥取，其特征在于经过下列步骤进行培养：
A、胚状体诱导培养：在无菌条件下，将灭菌后的鳞片切块接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中，在温度为23±3℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为1500-2000Lx的条件下培养15-20d，获得胚状体愈伤组织：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA    2.0-4.0
萘乙酸NAA             0.1-0.5
蔗糖                  30000
琼脂                  5500
pH                    5.8；
B、胚状体组织增殖培养：在无菌条件下，将步骤A获得的胚状体愈伤组织切片后转入单位为mg/L的下列增殖培养基中，在温度为23±3℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为1500-2000Lx的条件下培养15-20d，使胚状体组织分化成大量胚芽：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA    1.0-2.0
萘乙酸NAA             0.1-0.5
蔗糖                  30000
琼脂                  5500
pH                    5.8；
C、籽球分化培养：将步骤B生成的丛生胚芽分割成片状，转入单位为mg/L的下列培养基中进行籽球分化培养，其培养条件为：温度18-22℃，全黑暗遮光，培养时间25-35d，即在切块及周围直接生成小籽球：
MS基本培养液
萘乙酸NAA             0-0.5
蔗糖          60000
琼脂          5500
活性炭        300
pH            5.5-5.8；
D、籽球膨大培养：将步骤C生成的小籽球分切成单个，剥离外部不规则的小鳞片后转入单位为mg/L的下列培养基中进行生根及膨大培养，培养条件：温度18-22℃，全黑暗遮光，培养时间15-20d，籽球长出根系：
1/2MS基本培养液
萘乙酸NAA  1.0-2.0
蔗糖       60000-90000
琼脂       5500
活性炭     300
pH         5.5-5.8；
E、籽球出瓶及包装：将合格籽球从培养基中取出后放入装清水的盆中清洗，滤干水分后立即放入塑料筛中，采用农用链霉素∶百菌清＝1∶1的比例按混合800倍液浸泡20-30min，滤干消毒液后用打孔的塑料袋包装，及时放置到冷库中贮藏。
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Patentee before: Flower Research Institute(FRI) of Yunnan

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Assignee: Yuxi Ming Zhu Flower Co., Ltd.

Assignor: Flower Research Institute(FRI) of Yunnan

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Denomination of invention: Highly effective lily bulblet inducement culture method

Granted publication date: 20100519

License type: Exclusive License

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Record date: 20110601

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