CN106069772A - 一种建兰组培快速繁殖方法 - Google Patents

一种建兰组培快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种建兰组培快速繁殖方法，包括以下步骤：植株预处理、材料选取、材料消毒、诱导培养、丛生芽继代增殖培养、生根壮苗培养及移栽，通过本发明采用的外植体和消毒方法，能大大提高外植体的诱导率，同时培养后的苗株成苗率高，长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养建兰提供了技术支持。

Description

一种建兰组培快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种建兰组培快速繁殖方法。
背景技术
建兰是地生植物，生于疏林下、灌丛中、山谷旁或草丛中，海拔600-1800米。产中国安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东、海南、广西、四川西南部、贵州和云南。广泛分布于东南亚和南亚各国，北至日本。目前大多采用的繁殖方式是分株繁殖，而且很少形成种子，种子发育也比较困难，基本上在自然条件下萌发的难度比较大，因此建兰高效繁殖的主要手段就是组织培养。国外一些发达国家采用工厂化育苗技术以及组织培养快繁技术，不仅可以创造巨大的经济效益，同时也培育了很多优良品种，然而我国关于建兰组织培养的快繁技术研究仍然处于初级阶段，在很大程度上阻碍了建兰的规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种消毒效果好、成苗率高的建兰组培快速繁殖方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种建兰组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)植株预处理：将叶长为10～12cm的成熟株母本，放置在培养室中进行培养，培养温度20～22℃，光照时间为15h/d，光照强度为4000～5000lx，培养时间50～60天；
(2)材料选取：建兰预处理后，选取生长健壮及无病虫害长势良好的建兰，剪取植株中未开花或正在开花的花梗，剔除花梗上已开放的花朵及未开放的花蕾，切取花梗中部节位上的花梗芽作为外植体；
(3)材料消毒：将外植体用清水冲洗表面的泥沙，冲洗时间为5～10min，冲洗后将外植体放置在洗洁精水中浸泡10min并用软刷毛刷去表面污垢，用清水冲洗30min，然后用体积分数为75％的酒精棉球擦拭外植体表面，用灭菌水清洗2～3遍，再将花梗芽上的苞叶去除，用手术刀把花梗节与芽相处的苞叶剔除干净，在用体积分数为75％的酒精棉球擦拭外植体，用灭菌水清洗2～3遍，再将花梗节段用质量分数为2％的过氧化氢溶液消毒两次，每次消毒时间为5～10min，且每次消毒后用灭菌水清洗4～5遍；
(4)诱导培养：切除消毒后外植体的两端切口，将外植体接种在诱导培养基中进行预培养，培养时间为22～25d，前10天为暗培养，剩余时间为光培养，培养温度均为23～25℃，光培养时，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；所述诱导培养基为：1/3MS+3～5mg/L 6-BA+0.5～1.5g/L活性炭+0.3～0.5mg/LNAA+15％椰汁+30～40mg/L柠檬酸+22～27g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.4～5.5；
(5)丛生芽继代增殖培养：将诱导培养后萌发的小芽，自基部剥离切割后，接种到继代培养基上，所述继代培养基为：B5+8～12mg/L KT+0.1～0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+140～160g/L香蕉泥+90～110mg/L柠檬酸+28～32g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.1～5.4，培养温度23～25℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000～2500lx；
(6)生根壮苗培养：继代增殖培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为：MS+3～6mg/LKT+0.5～0.8mg/L NAA+140～160g/L香蕉泥+90～110mg/L柠檬酸+28～32g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.5～5.7，培养时间为15～20d，培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；
(7)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。
如上所述的一种建兰组培快速繁殖方法，进一步说明为，所述诱导培养基为：1/3MS+4mg/L 6-BA+1g/L活性炭+0.4mg/L NAA+15％椰汁+35mg/L柠檬酸+25g/L食糖+8g/L琼脂。
如上所述的一种建兰组培快速繁殖方法，进一步说明为，所述继代培养基为：B5+10mg/L KT+0.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+150g/L香蕉泥+100mg/L柠檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂。
如上所述的一种建兰组培快速繁殖方法，进一步说明为，所述壮苗培养基为：MS+5mg/L KT+0.6mg/L NAA+150g/L香蕉泥+100mg/L柠檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂。
本发明的有益效果是：通过本发明采用的外植体和消毒方法，能大大提高外植体的诱导率，同时培养后的苗株成苗率高，长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养建兰提供了技术支持。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做进一步的阐述。
本发明提供的一种建兰组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)植株预处理：将叶长为10～12cm的成熟株母本，放置在培养室中进行培养，培养温度20～22℃，光照时间为15h/d，光照强度为4000～5000lx，培养时间50～60天；通过一段时间的预处理，能够得到更好品质的花梗，使接下来的组织培养效果更好。
(2)材料选取：建兰预处理后，选取生长健壮及无病虫害长势良好的建兰，剪取植株中未开花或正在开花的花梗，剔除花梗上已开放的花朵及未开放的花蕾，切取花梗中部节位上的花梗芽作为外植体；分别切取花梗上不同部位的花梗芽做样本，放置在普通诱导培养基上进行诱导培养；
表1为花梗上不同部位对花梗芽萌芽的影响
由表1可以看出，上部花梗芽和中部花梗芽的萌芽率都较高，但是上部花梗芽的芽健壮情况一般，所以采用花梗中部的花梗芽最好，切取花梗中部节位上的花梗芽作为外植体，能有效提高生产率和质量。
(3)材料消毒：将外植体用清水冲洗表面的泥沙，冲洗时间为5～10min，冲洗后将外植体放置在洗洁精水中浸泡10min并用软刷毛刷去表面污垢，用清水冲洗30min，然后用体积分数为75％的酒精棉球擦拭外植体表面，用灭菌水清洗2～3遍，再将花梗芽上的苞叶去除，用手术刀把花梗节与芽相处的苞叶剔除干净，在用体积分数为75％的酒精棉球擦拭外植体，用灭菌水清洗2～3遍，再将花梗节段用质量分数为2％的过氧化氢溶液消毒两次，每次消毒时间为5～10min，且每次消毒后用灭菌水清洗4～5遍；采用过氧化氢溶液分两次消毒，这样可以能较好起到灭菌作用的同时而又对其活性影响较小；
表2为不同消毒剂及消毒次数对花梗芽污染率和萌芽率的影响
上述经过消毒剂的花梗芽均接种到相同普通诱导基上进行培养，然后得出污染率和萌芽率，由表2可以看出，采用质量分数为2％的过氧化氢溶液消毒效果要好于质量分数为2％的NaClO溶液，同时可以看出分两次进行消毒，虽然污染率要高于一次消毒，但是分两次进行消毒后的萌芽率大大提高，故采用质量分数为2％的过氧化氢溶液消毒两次，能更好的对建兰花梗芽进行消毒时，提高花梗芽的萌芽率。
(4)诱导培养：切除消毒后外植体的两端切口，将外植体接种在诱导培养基中进行预培养，培养时间为22～25d，前10天为暗培养，剩余时间为光培养，通过一段时间的暗培养，能一定程度上有效抑制褐化现象，培养温度均为23～25℃，光培养时，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；所述诱导培养基为：1/3MS+3～5mg/L 6-BA+0.5～1.5g/L活性炭+0.3～0.5mg/L NAA+15％椰汁+30～40mg/L柠檬酸+22～27g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.4～5.5；通过加入抗氧化剂柠檬酸和吸附剂活性炭，更能进一步抑制褐化现象的产生；
表3为诱导培养基成分及用量
作为优选，所述诱导培养基为：1/3MS+4mg/L 6-BA+1g/L活性炭+0.4mg/LNAA+15％椰汁+35mg/L柠檬酸+25g/L食糖+8g/L琼脂，即为表3中诱导培养基1的成分及用量；
表4为基础培养基的用量不同对花梗芽萌芽率的影响
由表4可以看出，适当降低MS基础培养基的大量元素浓度，可以提高建兰花梗芽的萌芽率，当MS基础培养基浓度过低时，又不满足花梗芽的吸收需要，所以本诱导培养基采用1/3MS作为基础培养基，所述MS培养基的成分为公知技术，这里不做详细阐述。
(5)丛生芽继代增殖培养：将诱导培养后萌发的小芽，自基部剥离切割后，接种到继代培养基上，所述继代培养基为：B5+8～12mg/L KT+0.1～0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+140～160g/L香蕉泥+90～110mg/L柠檬酸+28～32g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.1～5.4，培养温度23～25℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000～2500lx；
表5为继代培养基成分及用量
作为优选，所述继代培养基为：B5+10mg/L KT+0.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+150g/L香蕉泥+100mg/L柠檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂，即为表5中继代培养基1的成分及用量。
(6)生根壮苗培养：继代增殖培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为：MS+3～6mg/L KT+0.5～0.8mg/L NAA+140～160g/L香蕉泥+90～110mg/L柠檬酸+28～32g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.5～5.7，培养时间为15～20d，培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；
表6为壮苗培养基成分及用量
作为优选，所述壮苗培养基为：MS+5mg/L KT+0.6mg/L NAA+150g/L香蕉泥+100mg/L柠檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂，即为表6中壮苗培养基1的成分及用量。
(7)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。通过本发明能使培养后的苗株成苗率高，长势良好，同时通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养建兰提供了技术支持。
本发明并不限于上述实例，在本发明的权利要求书所限定的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。

Claims (4)

1.一种建兰组培快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)植株预处理：将叶长为10～12cm的成熟株母本，放置在培养室中进行培养，培养温度20～22℃，光照时间为15h/d，光照强度为4000～5000lx，培养时间50～60天；
(2)材料选取：建兰预处理后，选取生长健壮及无病虫害长势良好的建兰，剪取植株中未开花或正在开花的花梗，剔除花梗上已开放的花朵及未开放的花蕾，切取花梗中部节位上的花梗芽作为外植体；
(3)材料消毒：将外植体用清水冲洗表面的泥沙，冲洗时间为5～10min，冲洗后将外植体放置在洗洁精水中浸泡10min并用软刷毛刷去表面污垢，用清水冲洗30min，然后用体积分数为75％的酒精棉球擦拭外植体表面，用灭菌水清洗2～3遍，再将花梗芽上的苞叶去除，用手术刀把花梗节与芽相处的苞叶剔除干净，在用体积分数为75％的酒精棉球擦拭外植体，用灭菌水清洗2～3遍，再将花梗节段用质量分数为2％的过氧化氢溶液消毒两次，每次消毒时间为5～10min，且每次消毒后用灭菌水清洗4～5遍；
(4)诱导培养：切除消毒后外植体的两端切口，将外植体接种在诱导培养基中进行预培养，培养时间为22～25d，前10天为暗培养，剩余时间为光培养，培养温度均为23～25℃，光培养时，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；所述诱导培养基为：1/3MS+3～5mg/L6-BA+0.5～1.5g/L活性炭+0.3～0.5mg/L NAA+15％椰汁+30～40mg/L柠檬酸+22～27g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.4～5.5；
(5)丛生芽继代增殖培养：将诱导培养后萌发的小芽，自基部剥离切割后，接种到继代培养基上，所述继代培养基为：B5+8～12mg/L KT+0.1～0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+140～160g/L香蕉泥+90～110mg/L柠檬酸+28～32g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.1～5.4，培养温度23～25℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000～2500lx；
(6)生根壮苗培养：继代增殖培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为：MS+3～6mg/L KT+0.5～0.8mg/L NAA+140～160g/L香蕉泥+90～110mg/L柠檬酸+28～32g/L食糖+5～9g/L琼脂，pH为5.5～5.7，培养时间为15～20d，培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；
(7)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。
2.根据权利要求1所述的一种建兰组培快速繁殖方法，其特征在于：所述诱导培养基为：1/3MS+4mg/L 6-BA+1g/L活性炭+0.4mg/L NAA+15％椰汁+35mg/L柠檬酸+25g/L食糖+8g/L琼脂。
3.根据权利要求1所述的一种建兰组培快速繁殖方法，其特征在于：所述继代培养基为：B5+10mg/L KT+0.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+150g/L香蕉泥+100mg/L柠檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂。
4.根据权利要求1所述的一种建兰组培快速繁殖方法，其特征在于：所述壮苗培养基为：MS+5mg/L KT+0.6mg/L NAA+150g/L香蕉泥+100mg/L柠檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂。
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