CN103461118A - 一种金线莲种苗的工厂化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金线莲种苗的工厂化生产方法。本发明包括如下步骤：（1）选择植株完整, 生长粗壮, 形态特征优良的金线莲植株为外植体，对其进行消毒处理，进行组织培养；（2）增殖培养，然后转接入继代培养基进行分化培养；（3）进行二代增殖；（4）壮苗生根培养；（5）炼苗。与现有技术相比，本发明的快繁系数比原来传统丛芽诱导方式的快繁系数提高了3-4倍，能大大降低工厂化生产的成本。

Description

一种金线莲种苗的工厂化生产方法

技术领域

本发明涉及一种金线莲种苗的工厂化生产方法。 

背景技术

金线莲别名金线兰、金丝草，为兰科开唇植物花叶兰属多年生珍稀中草药。它在民间使用范围较广，素有“药王”、“金草”、“神草”、“鸟人参”等美称。经测定发现，金丝莲中氨基酸组成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参，几百年来作为民间常用草药。金线莲对生产环境要求很高，且种子发育不全，在自然条件下极难萌发，再加上近年自然环境遭受严重破坏，人们常年过度采收，使得金线莲自然资源日益枯竭。 

人工栽培是解决目前金线莲原材料稀少及价格显著过高的有效途径。种苗工厂化生产是金线莲栽培的重要环节，目前常用的手段是通过组织培养的方式培育种苗。台湾在组织培养繁殖金线莲方面开始得很早。广东省在工厂化育苗方面也做出了显著成绩,但是金线莲组织培养育苗技术还不成熟,存在着诸多问题。目前，金线莲的工厂化生产采用得主要组培快繁方式是诱导丛生芽的方式，该方式繁殖系数偏低,生长周期长，污染率高,造成生产成本偏高,成为其工厂化生产的瓶颈，因此，探索其他的组培快繁方式，提高繁殖系数，缩短生长周期，改进其生产技术体系，是目前解决金线莲市场需求的主要问题。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种金线莲种苗的工厂化生产方法。 

为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案： 

一种金线莲种苗的工厂化生产方法，包括如下技术步骤：

（1）每年春季选择植株完整, 生长粗壮, 形态特征优良的金线莲植株为外植体，对其进行消毒处理，进行组织培养；培养条件为室温25士1℃，湿度60～80%，光照强度1000luX下，每天光照6小时进行培养，培养基为MS+TDZ 0.4mg/L+NAA 0.2mg/L；

（2）经过约30天的萌发，转到

MS+S-3307 1.0mg/L+ 6-BA 2.0mg/L+ NAA 0.6mg/L+20%土豆泥的原球茎增殖培养基上进行增殖培养，增殖培养后，培养基养分也已被大量消耗；此时，应转接入继代培养基进行分化培养，培养条件为室温25士2℃，湿度60～80%，光照强度1000lux，每天光照时间8小时，培养基为MS+TDZ 0.2mg/L+ S-3307 1.5mg/L+ NAA1.5mg/L； 

（3）在原球茎增殖培养过程中，如果原球茎增殖速度比较快，长势比较好时，可进行二代增殖，培养条件与原来相同；

（4）经过约90天的分化培养后，可见原球茎己分化成无根幼苗；幼苗高度在18～28mm之间，并己长有4～5片小叶片，第二节茎粗在1.1～1.6mm之间；但此时幼苗各器官均比较娇嫩，因此，幼苗应转接入壮苗培养基进行壮苗生根培养；培养条件为室温25士1℃，湿度60～80%，光照强度5001ux，每天光照时间 10～12小时，并需有缓冲操作；使用培养基为MS+NAA0.2+ 20%土豆泥；壮苗培养基；

（5）经过壮苗培养约60天，幼苗发育成叶片较浓绿、茎较强壮的小苗，其高度在40～55mm之间，叶片5～7片，第三节茎粗达2.8～3.6mm；组培室生产的种苗依然比较脆弱，抗病抗晒能力比较差，如果直接进行移栽，种苗很难存活；因而在移栽前必须进行炼苗；

（6）经过炼苗后，种苗的根进一步强壮，茎杆、叶片颜色进一步加深；叶片厚实，杆体粗壮，种苗抗病抗晒能力得到了加强；此时方可进行种苗的移栽。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 

利用本发明方法，可以提高金线莲种苗的快繁系数。本发明的快繁系数比原来提高了3-4倍，能大大降低工厂化生产的成本，解除金线莲日益枯竭的趋势以及濒危的状态，为今后更进一步保护和利用该物种奠定良好的基础。

具体实施方式

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。 

实施例1 

一种金线莲种苗的工厂化生产方法，包括如下技术步骤：

（1）每年春季选择植株完整, 生长粗壮, 形态特征优良的金线莲植株为外植体，对其进行消毒处理，进行组织培养，培养条件为室温25士1℃，湿度60～80%，光照强度1000luX下，每天光照6小时进行培养，培养基为MS+TDZ 0.4mg/L+NAA 0.2mg/L；

（2）经过约30天的萌发，转到

MS+S-3307 1.0mg/L+ 6-BA 2.0mg/L+ NAA 0.6mg/L+20%土豆泥的原球茎增殖培养基上进行增殖，增殖培养后，培养基养分也已被大量消耗；此时，应转接入继代培养基进行分化培养，培养条件为室温25士2℃，湿度60～80%，光照强度1000lux，每天光照时间8小时，培养基为MS+TDZ 0.2mg/L+ S-3307 1.5mg/L+ NAA1.5mg/L； 

（3）在原球茎增殖培养过程中，如果原球茎增殖速度比较快，长势比较好时，可进行二代增殖，培养条件与原来相同；

（4）经过约90天的分化培养后，可见原球茎己分化成无根幼苗；幼苗高度在18～28mm之间，并己长有4～5片小叶片，第二节茎粗在1.1～1.6mm之间；但此时幼苗各器官均比较娇嫩，因此，幼苗应转接入壮苗培养基进行壮苗生根培养；培养条件为室温25士1℃，湿度60～80%，光照强度5001ux，每天光照时间 10～12小时，并需有缓冲操作；使用培养基为MS+NAA0.2+20%土豆泥；壮苗培养基；

（5）经过壮苗培养约60天，幼苗发育成叶片较浓绿、茎较强壮的小苗，其高度在40～55mm之间，叶片5～7片，第三节茎粗达2.8～3.6mm；组培室生产的种苗依然比较脆弱，抗病抗晒能力比较差，如果直接进行移栽，种苗很难存活；因而在移栽前必须进行炼苗；

（6）经过炼苗后，种苗的根进一步强壮，茎杆、叶片颜色进一步加深；叶片厚实，杆体粗壮，种苗抗病抗晒能力得到了加强；此时方可进行种苗的移栽。

以下提供关于本实施例的详细的技术实现手段： 

金线莲种苗的工厂化生产方法具体研究方法、步骤和数据分析如下

1、快繁方式的摸索

1.1通过丛生芽途径建立快繁体系

1.1.1材料和方法

1.1.1.1试验材料

采摘自福建三明的福建野生金线莲。

1.1.1.2试验方法 

1.1.1.2.1无菌体系的建立

选取植株完整, 生长粗壮, 形态特征优良的野生金线莲植株, 先用大量的清水冲洗去表面附着的泥土腐叶等杂物, 去除根、叶(保留顶部叶片) 备用，将预处理好的野生金线莲茎先用无菌水冲洗3 次, 再进行消毒处理。设置11种处理方法为：

(l)75%乙醇(30秒浸泡)+2.0% 次氯酸钠(10 分钟浸泡)

(2) 75%乙醇(30秒浸泡)+2.0% 次氯酸钠(20分钟浸泡)

(3) 75%乙醇(30秒浸泡)+0.1% HgCl (5分钟浸泡)

（4）75%乙醇(30 秒浸泡)+0.1% HgCl (8分钟浸泡)

（5）75%乙醇(30 秒浸泡)+0.1% HgCl (11分钟浸泡)

（6）75%乙醇(30 秒浸泡)+2.0% 次氯酸钠(20分钟浸泡)+0.1% HgCl (11分钟浸泡) 

(7) 75%乙醇(30 秒浸泡)+2.0% 次氯酸钠(10分钟浸泡)+0.1% HgCl (8分钟浸泡)  (8) 75%乙醇(30 秒浸泡)+2.0% 次氯酸钠(10分钟浸泡)+0.1% HgCl (11分钟浸泡) (9) 75%乙醇(30 秒浸泡)+2.0% 次氯酸钠(20分钟浸泡)+0.1% HgCl (5分钟浸泡) 

(10) 75%乙醇(30 秒浸泡)+2.0% 次氯酸钠(20分钟浸泡)+0.1% HgCl (8分钟浸泡)

(11) 75%乙醇(30 秒浸泡)+2.0% 次氯酸钠(20分钟浸泡)+0.1% HgCl (11分钟浸泡)。

浸泡消毒过程中轻微振荡, 以提高消毒效果, 浸泡处理后, 用无菌水洗4 次。按小组分别将消毒处理后的材料切割成带一个节的茎段(长约l.5cm ), 分别接入诱导培养基, 每瓶接一个外植体。 

诱导培养基采用MS基本培养基, 每个消毒处理接种30 瓶, 共330 瓶。放入培养箱进行黑暗培养, 培养温度为25℃ 。期间定期进行观察, 排查污染瓶, 培养3Od 后统计结果。 

1.1.1.2.2芽的诱导 

将消毒好的茎段接种到含有不同激素配比的MS培养基上，每个处理接种15瓶，每瓶有5个茎段，于温度23℃、前两天弱光照（500lx-800lx）,后期强光照下培养（1500lx-2000lx）, 每种培养基加蔗糖30%，加琼脂7.0g/L,PH5.1-5.5,

培养40天调查芽萌发的情况。诱芽培养基有以下几个处理：

(l)MS＋ＢＡ1.5mg/L+NAA0.3mg/L

(2)MS＋ＢＡ2.0mg/L+NAA0.3mg/L

(3)MS＋ＢＡ2.5mg/L+NAA0.3mg/L

(4)MS＋ＢＡ1.5mg/L+NAA0.1mg/L

(5)MS＋ＢＡ2.0mg/L+NAA0.1mg/L

(6)MS＋ＢＡ2.5mg/L+NAA0.1g/L

(7)MS＋ＢＡ1.5mg/L+NAA0.5mg/L

(8)MS＋ＢＡ2.0mg/L+NAA0.5mg/L

(9)MS＋ＢＡ2.5mg/L+NAA0.5mg/L

（10）MS＋ＢＡ3.0mg/L+NAA0.3mg/L

1.1.1.2.3芽的丛生增殖

a、不同激素浓度对芽的丛生增殖的影响

将诱导的芽体接种到丛生增殖培养基上，每个处理接种25瓶，每瓶有6个芽体，于温度25℃、强光照下培养（1500lx）, 每种培养基加蔗糖30%，加琼脂7.0g/L,PH5.1-5.5,培养20天调查芽萌发的情况。芽增殖培养基有以下几个处理：

 (1)MS＋ＢＡ0.5mg/L+NAA0.1mg/L

(2)MS＋ＢＡ1.0mg/L+NAA0.1mg/L

(3)MS＋ＢＡ1.5mg/L+NAA0.1g/L

(4)MS＋ＢＡ0.5mg/L+NAA0.5mg/L

(5)MS＋ＢＡ1.0mg/L+NAA0.5mg/L

(6)MS＋ＢＡ1.5mg/L+NAA0.5mg/L

(7)MS＋ＢＡ2.0mg/L+NAA0.1mg/L

b、不同有机添加物对芽的丛生增殖的影响

以MS＋ＢＡ0.5mg/L+NAA0.5mg/L+30%蔗糖+琼脂7.0g/L为基本培养基，设置添加植物生长调节剂与未添加植物生长调节剂两个区组, 选择组培中常用的有机添加物: 香蕉泥、椰子汗、马铃薯汁、蛋白胨(配合添加活性碳) 等作为添加物, 分别设置两个水平, 比较各有机添加物的效果。接种材料为无菌丛生苗,每个处理接种25瓶。

具体方法: 香蕉泥以香蕉去皮后加适量水用家用搅拌机打成香蕉浆, 和煮化的琼脂、蔗糖共同加热后加入配制好的基本培养基, 定容分装后高压灭菌; 椰子汁以新鲜的椰子取汁, 使用经过高温高压灭菌的溶剂过滤器和经过75 % 酒精消毒的超滤膜真空抽滤除菌, 用灭过菌的量筒量取所需量加入己灭菌冷却但尚未凝固的培养基中并摇匀, 最后分装到经过高压灭菌的组培瓶中冷却凝固;马铃薯汁选用质量良好的新鲜马铃薯块茎去皮后称取所需质量, 切片后加适量水煮熟, 用粗纱布过滤, 薯汁加入培养基定容分装后高压灭菌; 蛋白胨添加以称取所需质量, 和琼脂、蔗糖共煮后加入基本培养基, 分装灭菌后待用。 

1.1.1.2.4芽体生长及分化成苗 

a、不同激素浓度对芽体分化的影响

选取长约0.3cm,芽茎约0.1cm芽尖尚未分化变绿的芽体接种到如下的培养基上，每个处理接种25瓶，每瓶有4个芽体，每种培养基加蔗糖30%，加琼脂7.0g/L,PH5.1-5.5。于温度23℃的条件下,培养30天调查芽生长的情况。培养基有以下几个处理：

（l)ＭＳ＋ＢＡ1.0mg/L+NAA0.5mg/L

（2)MＳ＋ＢＡ0.5. mg/L+NAA0.5mg/L

（3)ＭＳ＋ＢＡ0.05mg/L+NAA0.5mg/L

（4)ＭＳ+NAA0.5mg/L

b、不同光照度对芽体分化及成苗的影响

选取长约0.3cm,芽茎约0.1cm芽尖尚未分化变绿的芽体接种到MＳ＋ＢＡ0.05mg/L+NAA0.5mg/L号培养基上，设置200lx、500lx、1000lx、三个处理，每个处理接种25瓶，每瓶有4个芽体，于温度23℃的条件下,培养45天调查苗的生长的情况。

1.1.2结果和分析 

1.1.2.1外植体消毒

外植体消毒处理后, 经过一个月时间培养, 其中部分出现污染, 未污染的外植体有一部分萌发出新芽,还有一部分未出现污染, 但也不萌发, 这部分材料呈永久休眠状态。具体情况见表1。

通过表1可知, 第（4）组处理，75%乙醇(30 秒浸泡)+0.1% HgCl (8分钟浸泡)萌发率最高, 达到85%优于其它参试组。外植体消毒不彻底易产生污染, 消毒处理时间过长可使金线莲外植体因其毒害使幼芽出现死亡或进入永久休眠状态。0.1% HgCl次氯酸钠与2.0% 次氯酸钠配合消毒也可提升消毒效果, 减少污染瓶数, 但由于较长时间的浸泡处理, 易引起对外植体的毒害作用, 最终结果并不理想。 

       表1-1不同处理对外植体消毒的影响 

处理	（1）	（2）	（3）	（4）	（5）	（6）	（7）	（8）	（9）	（9）	（9）
												污染率	40%	30%	25%	15%	35%	20%	5%	8%	15%	20%	15%
萌发率	60%	55%	80%	85%	75%	50%	40%	35%	0%	10%	15%

1.1.2.2芽的诱导

以金线莲的茎节段为外植体，在培养10—15天时，茎节开始肿大，15—25时开始萌芽，试验结果表明（表1-2），当6-BA浓度在1.5-2.5mg/L、NAA浓度在0.1-0.5mg/L时均能诱导出芽，最适宜的诱导培养基是（2）号：ＭＳ＋ＢＡ2.0mg/L+NAA0.3mg/L。在一定的浓度范围内，BA能明显促进腋芽的萌动和不定芽的形成，在本试验中，BA的浓度在1.5-2.0时最适合诱导茎段芽的萌发，并随着BA浓度的增加，不定芽的数量逐渐增加，但当BA的浓度达到2.5时，虽有较多的腋芽萌发,但是芽的生长受到抑制，长势慢，并且较为瘦弱，虽然增加NAA的浓度能使得芽体壮实，但芽体老化，不利于下一步的丛生增殖。BA的浓度达到3.0时，腋芽的萌发受到抑制，芽体老化严重。一定浓度的NAA有利于腋芽的萌发，并有利于芽体萌发后的生长增壮。过高浓度的NAA则对芽的萌发明显起到抑制作用，在本试验中，NAA的浓度在0.1-0.3时，金线莲腋芽萌发率区别不大，但当其浓度增加到0.5时,腋芽萌发明显受到抑制。因此，NAA的浓度在0.1-0.3为宜

表1-2不同激素浓度组合对台湾金线莲芽诱导的情况：

培养基编号	诱导芽数	芽体生长状况	综合评价
				（1）	1.5	色乳白、芽弱	优
（2）	2.3	色嫩绿、芽壮	优
				（3）	2.5	色嫩绿、芽壮	良
（4）	1.6	色嫩绿、芽粗壮	优
				（5）	1.8	色绿、芽弱	良
（6）	2.0	色绿、芽壮	良
				（7）	1.0	色浓绿、芽粗壮	良
（8）	1.1	色绿、芽壮	优
				（9）	1.5	色绿、芽壮	优
（10）	1.9	色绿、芽弱	良
				（11）	0.6	色绿、芽弱	差

(注：诱导芽数为每个处理单个茎段平均诱导的芽数)

1.1.2.3芽的丛生增殖

a、同激素浓度对芽的丛生增殖的影响

所谓丛生包含两个含义，一个就是指成熟的芽体本身含有分生组织，其分生组织在激素的作用下，分化成一个新的芽体，这种芽的分化能力较强，萌发出来后，在激素的作用下，可以立刻分化出2~4个新芽，也就是芽上长芽，另一个含义就是指芽体生长出现节的组织，这个节段一般只能分化出一个芽体，由于激素的作用使得节与节之间的距离缩短，使其分化出的芽体长成苗后看上去是丛生状。本试验中这两种情况都有出现。表1-3可以看出随着BA浓度的提高，芽的增殖数逐渐增加，但是当BA的浓度为2.0时虽然诱导的芽体较多，但是芽体瘦弱，不利于下一步的成苗培养，因此，在本试验中采用(6)MS＋ＢＡ1.5mg/L+NAA0.5g/L的处理。

表1-3 芽在不同激素配比的增殖情况 

培养基编号	诱导芽数	芽体生长状况	综合评价
				（1）	2.0	色乳白、芽弱	优
（2）	2.3	色嫩绿、芽壮	良
				（3）	2.5	色嫩绿、芽壮	良
（4）	2.1	色嫩绿、芽粗壮	优
				（5）	2.4	色绿、芽壮	良
（6）	2.7	色绿、芽粗壮	优
				（7）	3.1	色浓绿、芽弱	差

b、不同有机添加物对芽的丛生增殖的影响

培养基中添加有机物能提高增殖倍数, 培养基中添加香蕉泥、蛋白胨, 其瓶苗明显比其他处理更为粗壮, 且根系发达。其中添加香蕉泥的处理, 其增殖倍数高, 而且瓶苗粗状, 是各处理中综合表现最优秀的培养基。

1.1.2.4芽体生长及分化成苗 

a、不同激素浓度对芽体分化的影响

表1-4显示，在金线莲芽体营养器官分化期间，只要适当降低培养基中细胞分裂素的浓度就可以使芽茎明显增加，在本试验中，组合(4)对的浓度为芽体生长的最佳组合，其芽茎平均增加一倍，并且提前成叶。

在营养器官分化期间，若用细胞分裂素含量较高的增殖培养基进行培养，则在芽体器官分化的同时．继续大量增殖新生芽，从而分散了营养成分．致使茎粗几乎不增加，叶的分化成形也较慢 若只添加0．5 mg/L NAA．芽体器官的分化也较缓慢．这说明低含量的分裂素对组培金线莲的器官分化还是必要的 试验证明，在芽体形成后、茎叶分化成形前．应及时转移至更低浓度的分裂素、生长素分化培养基中。 

表1-4不同激素浓度对金线莲芽营养体分化的影响（单位：cm） 

培养基编号	芽茎	节数	顶叶宽	生长状况
					（1）	0.1	2		叶片不展开，基部和茎节仍有芽体产生
(2)	0.1	2		叶片少有展开，基部仍有芽体产生
					(3)	0.2	3	0.3	茎、叶完全分化成形
(4)	0.1	2	0.2	叶片部分分化成形，部分卷曲未展开

b、不同光照度对芽体分化及成苗的影响

从表1-5可以看出，在移植密度相同的条件下，光照的增加对金线莲生长期叶片生长的作用非常明显，500 lx光照下的叶面积显著大于200 1x光照下的叶面积，可见在分化生长的后期， 一定强度的光照对金线莲叶等营养体的发育有利，当光照大于1000lx时，叶片发育缓慢，苗体明显变褐，老化严重，这也说明了金线莲是喜阴植物，过高的光照强度不利于其芽体的生长发育，但是500lx是否为最适照度，还有待于进一步研究。

表1-5光照度对组培金线莲营养体生长期的影响 

光照度（lx）	苗茎（cm）	苗高（cm）	顶叶长(cm)	顶叶宽(cm)
					200	0.15-0.2	2.5-3.0	0.6	0.4
500	0.15-0.2	2.0-2.5	0.8	0.5
					1000	0.12-0.18	1.6-1.9	0.4	0.2

1.2通过原球茎途径建立快繁体系

1.2.1材料和方法

1.2.1.1试验材料

1.2.1.2试验方法

1.2.1.2.1原球茎的诱导

选用生长粗壮的无菌苗, 在超净工作台上用解剖刀将芽体从茎段切下, 随机接种到以下不同激素配比的各组培养基中,( MS为基本培养基, 加入不同浓度的植物生长调节物质, 蔗糖浓度为5.0%, pH 值5.8,)  每组10 瓶,光照500LX，温度23~25℃。每瓶接种4个芽体, 每20d更换1次培养基, 30 d 统计诱导出原球茎的茎节数, 重复3次, 取平均值计算其诱导率。

诱导率=（诱导出原球茎茎节数/ 接种外植体数）×100% 

(1)MS＋+NAA0.2mg/L

(2)MS＋TDZ0.2mg/L+NAA0.2mg/L

(3)MS＋TDZ0.2mg/L+NAA0.4g/L

(4)MS＋TDZ0.2mg/L+NAA0.6mg/L

(5)MS＋TDZ0.4mg/L+NAA0.2mg/L 

(6)MS＋TDZ0.4mg/L+NAA0.4mg/L

(7)MS＋TDZ0.4mg/L+NAA0.6mg/L

(8)MS＋TDZ0.6mg/L+NAA0.2mg/L

(9)MS＋TDZ0.6mg/L+NAA0.4mg/L

(10)MS＋TDZ0.6mg/L+NAA0.6mg/L

1.2.1.2.2原球茎的增殖

a、不同激素配比的对原球茎增殖的影响

选取S-3307( 稀效唑, Uniconazole)、6-BA（苄基腺嘌呤, 6-Benzyladenine）和NAA( A-萘乙酸,A-NaphthaleneaceticAcid)3因素，各取3 水平进行正交实验。将诱导出来的原球茎, 选取颜色较绿、形状比较规则、长势良好的原球茎作为接种材料,切割成大小约1cm×1cm×1cm的块状，称重后接种到培养基上, 每组15瓶, 每瓶接种4 个, 每20d更换1次培养基, 60d 统计结果, 重复3次, 取平均值计算增殖倍数。

增殖倍数=（60d后的原球茎重量）/（接种时原球茎的重量） 

b、不同基本培养基对原球茎增殖的影响

分别以N6、B5、MS以及1/2MS为基本培养基，每个培养基同时添加S-3307 1.0mg/L＋BA2.0ｍｇ／Ｌ＋NAA0.6,蔗糖30g/L＋琼脂7g/L，调PH至5.8，研究不同基本培养基对原球茎增殖的影响。每个处理20瓶，培养45后观察长势，称重。

c、不同添加物对金线莲原球茎增殖的影响 

以MS+S-3307 1.0mg/L＋BA2.0ｍｇ／Ｌ＋NAA0.6为基本培养基，，分别添加20%的香蕉汁、苹果汁和土豆泥，同时设置不加添加物为对照，调ｐＨ至5.8，研究不同的添加物对金线莲原球茎增殖的影响。，每个处理20瓶，培养60d后统计结果。

1.2.1.2.3原球茎的分化 

选取TDZ( 苯基噻二唑基脲, Thid-iazuron) 、S-3307 和NAA 3 因子, 各取3 水平, 进行正交实验。将诱导出的原球茎随机接种到表3各组培养基中, 每组20瓶, 每瓶接种4 个, 每20d 更换1次培养基, 60d统计分化情况, 重复3 次, 取平均值计算分化率。

分化率=( 分化原球茎数/ 接种原球茎数) ×100% 

1.2.1.2.3壮苗和生根培养

当原球茎上分化的幼苗长到3-4 cm 时,将表3 第5 号培养基中的苗切割下来, 转到表4 的培养基中进行生根培养, 60d 后统计苗的生根情况。

1.2.1结果和分析 

1.2.1.2原球茎的诱导

在培养20d 后, 在外植体的节上先后分化出2~ 4 个乳白色原球茎。在解剖镜下, 可见其顶端与基部的组织分化状况不同, 在基部可观察到有根毛状突起, 顶部组织为球状突起。在后期培养中, 基部分化出大量根毛, 顶部球状突起可继续增殖成新的原球茎。试验结果表明，在只有NAA 的1号培养基中, 诱导率最低; 在有NAA、TDZ 配合的5、6、7 号培养基中均有较高的诱导率, 其中TDZ 和NAA 的浓度分别为0.4mg/L 和0.2mg/L 时诱导率最高, 达93.3%。

表2-1原球茎的诱导结果 

编号	TDZ mg/L	NAA mg/L	诱导率 %
				1	0	0.2	5.0
2	0.2	0.2	58.3
				3	0.2	0.4	61.7
4	0.2	0.6	51.7
				5	0.4	0.2	93.3
6	0.4	0.4	85.0
				7	0.4	0.6	73.3
8	0.6	0.2	18.3
				9	0.6	0.4	16.7
10	0.6	0.6	20.0

1.2.1.2原球茎的增殖

a、不同激素配比的对原球茎增殖的影响

试验结果( 表2-2) 表明,第5 号培养基的增殖系数最高, 为9.4, 且新增殖的原球茎个大、体圆, 生长旺盛, 故初步推断原球茎增殖的最优组合为S-3307 1.0mg/ L+ 6-BA2.0mg/L+ NAA0.6mg/L; 从极差R值可知, S-3307 对原球茎的增殖起主要作用, 其次为NAA, 影响最小的是6-BA。在原球茎增殖培养时发现, S-3307 是原球茎增殖的主要因子, 其作用超过了NAA和6- BA。原球茎是节间极度缩短了的根状茎, 其增殖方式是通过体细胞胚的途径进行的,而S-3307 是一种新型高效的植物生长调节剂, 能抑制赤霉素的生物合成, 具有促进分蘖、抑制植物生长的作用, 故在原球茎增殖培养时, 加入一定量的生长抑制剂, 都有利于增殖率的提高

表2-2 不同激素配比的对原球茎增殖的影响

编号	S-3307	6-BA	NAA	平均接种量/g	60d后平均质量/g	增殖倍数	生长态势
								1	0.5	1.0	0.2	1.418	7.374	5.2	+
2	0.5	2.0	0.4	1.204	7.104	5.9	++
								3	0.5	3.0	0.6	1.242	6.831	5.5	++
4	1.0	1.0	0.4	1.344	11.693	8.7	++
								5	1.0	2.0	0.6	1.321	12.417	9.4	++
6	1.0	3.0	0.2	1.452	12.487	8.6	++
								7	1.5	1.0	0.6	1.531	9.339	6.1	+
8	1.5	2.0	0.2	1.234	5.059	4.1	++
								9	1.5	3.0	0.4	1.542	7.468	4.9	+
R	3.9	0.4	1.0
								主次顺序	1	3	2

注：“+”表示生长状况一般，速度慢，颜色淡;“++”表示生长状况良好，速度较快，颜色较绿。

b、不同基本培养基对原球茎增殖的影响 

将切割好的材料接到培养基中，接种约12d后，原球茎均开始生长。接种材料颜色均匀呈鲜绿色的生长较快，生长20ｄ后，生长速度加快，与培养基接触的组织深入到培养基内部。由可以看出，B5、MS整体的增殖效果比N6、1/2MS好。MS的增殖效果最佳，经过45d的培养增殖倍数最大，达到3.156，所以MS作为基本培养基比较适合金线莲原球茎增殖。由MS和1/2MS结果对比可以看出，MS的增殖效果明显好于1/2MS，说明大量元素含量高有利于金线莲原球茎增殖。

表2-3基本培养基对金线莲原球茎增殖的影响（45天） 

基本培养基	平均接种量	45d平均重量	增殖倍数	生长态势
					N6	1.21	3.021	2.748	+
MS	1.414	4.350	3.156	++
					B5	1.292	3.842	2.974	++
1/2 MS	1.407	3.314	2.361	+

c、不同添加物对金线莲原球茎增殖的影响

金线莲原球茎在含有添加物、苹果汁和椰汁的培养基上10d后均开始生长，长出芝麻大小的浅绿色新组织，生长日益旺盛；未加添加物的对照要12d后才有新的原球茎出现。由表2-4可以看出，添加物（香蕉汁、苹果汁和土豆泥）对金线莲原球茎的增殖有明显的促进作用，增殖效果均好于未添加任何添加物的对照。土豆泥促进作用最为明显（增殖倍数达6.414），增殖效果好于香蕉汁、苹果汁。所以土豆泥最适合作为添加物添加到金线莲增殖原球茎培养基中，促使原球茎快速增殖。下一步需要进一步确定土豆泥的添加浓度。

表2-4  添加物对金线莲原球茎增殖的影响（45d） 

添加物	平均接种量/g	45d平均接种量	增殖倍数	生长态势
					香蕉汁	1.290	5.980	4.791	+++
苹果汁	1.090	3.880	3.620	++
					土豆泥	1.030	6.250	6.146	++++
CK	1.292	3.842	2.974	++

1.2.1.3原球茎的分化

原球茎经25d分化培养, 原球茎球体顶部突起变尖, 分化成小芽, 35d后可分化成丛生状的芽。试验结果( 表2-4) 表明,TDZ 的浓度在0. 1- 0. 2mg/ L 时,随着浓度的增加, 分化率也逐渐增加, 但TDZ 的浓度超过0. 3mg/L时, 分化受到抑制。（5）号培养基的苗整齐, 长势好, 而且分化率最高, 故分化的最佳组合为TDZ 0.2mg/L+ S-3307 1.5mg/L+ NAA1.5mg/L; 从极差分析可知, TDZ 对原球茎分化的影响最大, S-3307 次之, NAA 最小。在原球茎的分化试验中发现, 植物生长调节物质对原球茎分化作用大小依次为TDZ> S-3307> NAA, 这可能与TDZ具有很强的细胞分裂素活性(CTK) , 可促进植物芽的再生和繁殖, 打破芽的休眠, 并且可以通过对其他植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程等有关。同时发现4、5、6号培养基上单个的原球茎平均的分化芽数比较高TDZ的浓度为0.2 mg/L时，最有利于原球茎的芽体分化。

表2-4 原球茎分化试验结果 

1.2.1.4壮苗和生根培养

试验结果( 表2-5) 表明，加入活性炭和适当减少大量元素的含量, 都有利于根的分化和生长。2号培养基中加入0. 05% AC, 其平均每株的根数与1 号培养基相比, 有所增加3 号培养基与2 号培养基或与4 号相比,生根数均较多, 且根粗壮、暗红色, 根毛较多; 此外, 3 号培养基中的植株叶片展开呈紫色天鹅绒状, 叶脉金黄色, 老叶叶脉橙红色。因此, 最佳壮苗、生根培养基为1/ 2MS+NAA 0. 2mg/ L+ AC 0. 05%。

表2-5不同培养基对生根的影响 

编号	培养基	接种苗数	30d总根数	平均每根生根数
					1	MS+NAA0.2mg/L	65	126	1.9
2	MS+NAA0.2mg/L+AC0.05%	70	147	2.1
					3	1/2MS+NAA0.2mg/L+AC0.05%	68	298	4.4
4	1/4MS+NAA0.2mg/L+AC0.05%	72	245	3.4

在根的诱导试验中, 发现培养基中大量元素含量和是否附加活性炭与根的诱导、生长密切相关。由表2-5可知, 在大量元素的含量没有减半的1、2 号培养基中, 附加一定浓度的活性炭, 有利根的诱导与生长, 究其原因是活性炭具有一定的吸附作用, 起到了降低大量元素的含量的作用, 同时又能造成一定的黑暗环境, 故有利于根的诱导; 由2、3 号培养基培养结果可知, 大量元素的降低, 有利根的诱导, 但并不是降低越多越好, 这由3、4 号培养基的培养结果中可以得到验证,MS 培养基是属于高无机盐成分的培养基, 在生根阶段,培养基高渗透势有利于营养素和激素的运转, 有利于根的发生和生长。

1.2.3结论 

通过以上可以看出，诱导金线莲原球茎最适宜的培养基为(5)号培养基MS＋TDZ0.4mg/L+NAA0.2mg/L;原球茎增殖的较为适宜的培养基为（5）号培养基MS+S-3307 1.0mg/ L+ 6-BA2.0mg/L+ NAA0.6mg/L；并且添加一定20%的土豆泥，金线莲原球茎分化的较为适宜的培养基为（5）号培养基MS+TDZ 0.2mg/L+ S-3307 1.5mg/L+ NAA1.5mg/L，壮苗和生根培养的较为适宜的培养基为（3）号培养基1/2MS+NAA0.2mg/L+AC0.05%。金线莲通过诱导原球茎的方式进行快速繁殖。 

1.3通过原球茎途径建立快繁体系 

1.3.1材料和方法

1.3.1.1试验材料

金线莲长约1cm的单节茎段

1.3.1.2方法

1.3.1.2.1根状茎的诱导

a、不同激素配比对根状茎诱导的影响

选用生长粗壮的无菌苗, 在超净工作台上用解剖刀将其切成长度1cmz左右的单节茎段, 随机接种到以下不同激素配比的各组培养基中,( MS为基本培养基, 加入不同浓度的植物生长调节物质, 蔗糖浓度为5.0%, pH 值5.8,)  每组10 瓶, 每瓶接种4茎段, 每20d更换1次培养基, 暗培养20天后，在光照（1500lx）培养25天，温度23~25℃，45d 统计诱导出根状茎的茎节数, 重复3次,取其平均值计算其诱导率。

诱导率=（诱导出根状茎数/ 接种外植体数）×100% 

(1)MS+2,4-D0.5mg/L+BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L

(2)MS+2,4-D0.5mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L

(3)MS+2,4-D0.5mg/L+BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L

(4)MS+2,4-D1.0mg/L+BA0.1mg/L+NAA0.3mg/L

(5)MS+2,4-D1.0mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L

(6)MS+2,4-D1.0mg/L+BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L

(7)MS+2,4-D1.5mg/L+BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L

(8)MS+2,4-D1.5mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L

(9)MS+2,4-D1.5mg/L+BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L

b、不同基本培养基对根状茎诱导的影响

分别以N6、B5、MS以及1/2MS为基本培养基，每个培养基同时添加MS+2,4-D1.0mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L,蔗糖30g/L＋琼脂7g/L，调PH至5.8，研究不同基本培养基对原球茎增殖的影响。每个处理10瓶，每瓶接种4个茎段，暗培养20天后，在光照（1500lx）培养25天，温度23~25℃，45d 统计诱导出根状茎的茎节数, 重复3次, 取平均值计算其诱导率。

c、活性炭浓度的添加对根状茎诱导的影响 

以N6+2,4-D1.0mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L为基本培养基，添加不同浓度的活性炭，并以不添加活性炭的培养基为对照，研究不同活性炭浓度对原球茎增殖的影响每个处理20瓶，暗培养20天后，在光照（1500lx）培养25天，温度23~25℃，45d 统计诱导出根状茎的茎节数, 重复3次, 取平均值计算其诱导率。

d、不同有机添加物根状茎诱导的影响 

以N6+2,4-D1.0mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+0.1%Ac为基本培养基，分别添加20%的香蕉汁、苹果汁和土豆泥，同时设置不加添加物为对照，调ｐＨ至5.8，研究不同的添加物对金线莲原球茎增殖的影响。每个处理20瓶暗培养20天后，在光照（1500lx）培养25天，温度23~25℃，45d 统计诱导出根状茎的茎节数, 重复3次, 取平均值计算其诱导率。

1.3.1.2.2根状茎的增殖 

将在根状茎诱导培养基上培养了45d的根状茎，切成含有3个茎段的根状茎，转接到含有不同激素配比处理的N6培养基上，每瓶接种3个根状茎，每种培养基都添加20%的土豆泥和0.1%的活性炭，PH调至5.8，在光照（1500lx）培养60天后统计其增殖倍数，温度23~25℃，重复3次取，平均值计算其增殖倍数。

根状茎增殖倍数=（60d后的根状茎数量）/（接种时根状茎的数量） 

1.3.1.2.3根状茎的分化

将增殖的成束根状茎在超净台上切成只还有3条根状茎，每条根状茎还有3个节的相对规则的束状根状茎，接种到分化培养基上，每瓶接种2个规则根状茎，每种培养基都添加20%的土豆泥和0.1%的活性炭，PH调至5.8，在光照（1500lx）培养45天后统计其分化成苗数，温度23~25℃，重复3次取，平均值计算其分化率。

分化率=（分化的根状茎节数/接种的根状茎节数）×100 

1.3.2结果和分析

1.3.2.1根状茎的诱导

a、不同激素配比对根状茎诱导的影响

接种在根状茎诱导培养基上的茎段从第3周开始长出嫩绿色尖尾状的腋芽;1 个月时腋芽长成根状茎； 40～45天后, 根状茎长2～5cm, 有节3～4 个, 根状茎的下部叶呈鳞片状, 上部的1～2 片叶为真叶。由表3-1看出各个培养基上的根状茎诱导率普遍偏低，在4、5、6号培养基上相对较高。从R值可知，根状茎诱导的决定激素为2,4-D。当2,4-D的浓度为1.0mg/L时根状茎的诱导率最高。

表3-1 不同激素配比对根状茎诱导的影响 

b、不同基本培养基对根状茎诱导的影响

将切割好的材料接到培养基中，接种约40d后，根状茎均长约2-5cm。其中接种N6培养基上的材料颜色均匀呈鲜绿色的生长较快，与培养基接触的组织深入到培养基内部。由可以看出，N6、MS整体的增殖效果比B5、1/2MS好。N6的增殖效果最佳，经过45d的诱导率最大，达到92.6%，所以N6作为基本培养基比较适合金线莲根状茎的增殖。

表3-2不同基本培养基对根状茎诱导的影响 

基本培养基	接种茎段数	45d诱导数	诱导率%
				N6	40	35. 3	88.2
MS	40	29.2	73.2
				B5	40	18.7	46.7
1/2 MS	40	13.5	33.7

c、活性炭浓度的添加对根状茎诱导的影响

从表3-3可以看出活性炭的添加对金线莲根状茎的诱导起到一定的促进作用，究其原因可能是活性炭具有一定的吸附作用, 起到了降低大量元素的含量的作用, 同时又能造成一定的黑暗环境,有利于根根状茎的诱导，当活性炭的浓度为0.1%时 其诱导率为最高，达到了95%

表3-3不同活性炭浓度对根状茎诱导的影响

活性炭浓度%	接种茎段数	45d诱导数	诱导率%
				0.01	40	35. 4	88.5
0.05	40	36. 2	90.5
				0.1	40	38.0	95.0
0.15	40	36.8	92.0

d、不同有机添加物根状茎诱导的影响

金线莲茎段在含有添加物、苹果汁和椰汁的培养基上17d后均出现明显变化，长出尾状腋芽，生长旺盛；未加添加物的对照要20d后才长出尾状腋芽。由表2-4可以看出，添加物（香蕉汁、苹果汁和土豆泥）对金线莲根状茎的诱导有明显的促进作用，增殖效果均好于未添加任何添加物的对照。土豆泥促进作用最为明显（诱导率达到96.5%），增殖效果好于香蕉汁、苹果汁。所以土豆泥最适合作为添加物添加到金线莲增殖原球茎培养基中，促使原球茎快速增殖。下一步需要进一步确定土豆泥的添加浓度。

表3-4  添加物对金线莲原球茎增殖的影响（45d） 

添加物	接种茎段数	45d诱导数	诱导率%	生长态势
					香蕉汁	40	38.0	95.0	+++
苹果汁	40	37.2	93.0	+++
					土豆泥	40	38.6	96.5	++++
CK	40	36.1	90.2	++

注：“+”表示生长状况一般，速度慢，颜色淡;“++”表示生长状况良好，速度较快，颜色较绿。

1.3.2.2根状茎的增殖 

接入到增殖培养基7d后，根状茎开始生长，并逐渐长成成束的根状茎，45d后每束有根状茎3-7条，每条根状茎上有3~4个节，下部节上的叶为鳞片状上部为真叶。从表3-5可以看出从极差R值可知, 2,4-D对根状茎的增殖起主要作用, 其次为6-BA, 影响最小的是NAA。在原球茎增殖培养时发现, 2,4-D 是根状茎增殖的主要因子, 其作用超过了NAA和6- BA。发现4号和5号培养基根状茎的增殖效果最好，二者的增殖倍数相差不大，因此需要下一步的试验继续验证，找到金线莲根状茎增殖合适的激素配比。

表3-5不同激素配比对根状茎增殖的影响 

1.3.2.3根状茎的分化

将根状茎接种到分化培养基上10d后节上开始分化长芽，在25天时开始长出第一片叶，40~45天时长成带有4~5片叶2~4cm高的小苗，从表3-6可以看出在6-BA的浓度为0.1~0.5mg/L时随着6-BA浓度的提高根状茎的分化率逐渐增加，但是过高的浓度也会抑制根状茎的分化。4号和5号培养基的分化率较高。

表3-6不同激素配比对根状茎分化的影响 

1.3.3结论

通过以上可以看出，诱导金线莲根状茎最为适宜的培养基为 (5)号培养基N6+2,4-D1.0mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+0.1% AC+20%土豆泥。根状茎增殖的最为适宜的培养基为(4)号培养基N6+2,4-D1.5mg/L+BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+0.1%AC+20%土豆泥，金线莲根状茎分化的较为适宜的培养基为（5）号培养基N6+6-BA0.5 mg/L +NAA0.5mg/L+0.1%AC+20%土豆泥。 

2 金线莲规模化生产技术体系的建立 

建立金线莲规模化生产技术体系的目的是为了保证药材质量的稳定、可控，对金线莲组培生产技术进行规范，改善生产工艺，控制污染率，降低生产成本。相关研究工作有以下几方面。

2.1组培快繁途径的确定 

分别通过以上建立的三种不同的快繁途径进行工厂扩大性中间生产试验，对三种快繁途径的生产周期、快繁系数以及苗体的生长状况进行进一步的考察从而确定最优的快繁途径。

2.1.1材料和方法 

以消毒好的茎段为外置体，分别通过丛生芽途径、原球茎途径、根状茎途径，对金线莲进行组培快繁，每个途径各接种500瓶，每瓶接种4个茎段。根据以上建立的组培快繁技术体系，进行培养基和培养条件的选择。进行一个培养周期后统计其出苗数和苗体生长状况，

计算其生产周期、快繁系数。具体计算方法如下：

生产周期=茎段接种的日期到苗出瓶的日期

快繁系数=（出瓶的苗数/接种茎段数）×100%

2.1.1结果和分析

     从表4-1可以看出三种快繁方式中，丛芽诱导的快繁方式最为快捷，所需时间最短，苗的生长状况也做最好，苗体粗壮，叶片墨绿宽大，但快繁系数比较低，用该方式进行组培苗的工业生产，间接地加大了生产成本。原球茎和根状茎诱导的快繁方式所需时间较长，苗体纤弱，必须经过一次壮苗培养（培养时间30天），才能进行下一步的生根培养，这也是快繁周期偏长的原因。但二者的快繁系数较高，是丛芽诱导快繁方式的3~4倍，结合快繁周期的综合考虑，诱导原球茎的快繁方式，是金线莲快速繁殖的最佳方式。

表4-1三种快繁方式的比较 

Claims (1)

1.一种金线莲种苗的工厂化生产方法，其特征在于，包括如下技术步骤：

（1）每年春季选择植株完整, 生长粗壮, 形态特征优良的金线莲植株为外植体，对其进行消毒处理，进行组织培养，培养条件为室温25士1℃，湿度60～80%，光照强度1000luX下，每天光照6小时进行培养，培养基为MS+TDZ 0.4mg/L+NAA 0.2mg/L；

（2）经过约30天的萌发，转到

MS+S-3307 1.0mg/L+ 6-BA 2.0mg/L+ NAA 0.6mg/L+20%土豆泥的原球茎增殖培养基上进行增殖；增殖培养后，培养基养分也已被大量消耗；此时，应转接入继代培养基进行分化培养，培养条件为室温25士2℃，湿度60～80%，光照强度1000lux，每天光照时间8小时，培养基为MS+TDZ 0.2mg/L+ S-3307 1.5mg/L+ NAA1.5mg/L；

（3）在原球茎增殖培养过程中，如果原球茎增殖速度比较快，长势比较好时，可进行二代增殖，培养条件与原来相同；

（4）经过90天的分化培养后，可见原球茎己分化成无根幼苗；幼苗高度在18～28mm之间，并己长有4～5片小叶片，第二节茎粗在1.1～1.6mm之间；但此时幼苗各器官均比较娇嫩，因此，幼苗应转接入壮苗培养基进行壮苗生根培养；培养条件为室温25士1℃，湿度60～80%，光照强度5001ux，每天光照时间 10～12小时，并需有缓冲操作；使用的壮苗培养基为MS+NAA0.2+ 20%土豆泥；

（5）经过壮苗培养60天，幼苗发育成叶片较浓绿、茎较强壮的小苗，其高度在40～55mm之间，叶片5～7片，第三节茎粗达2.8～3.6mm；组培室生产的种苗依然比较脆弱，抗病抗晒能力比较差，如果直接进行移栽，种苗很难存活；因而在移栽前必须进行炼苗；

（6）经过炼苗后，种苗的根进一步强壮，茎杆、叶片颜色进一步加深；叶片厚实，杆体粗壮，种苗抗病抗晒能力得到了加强；此时方可进行种苗的移栽。