CN104686361B - 一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，它包括以下步骤：取葡萄植株的嫩梢为外植体，经过修剪、消毒洗涤，得到无菌葡萄茎段；将无菌葡萄茎段置于葡萄愈伤组织诱导培养基诱导培养，再转接继代两次，得到葡萄愈伤组织，葡萄愈伤组织诱导培养基含6‑苄氨基腺嘌呤1.0‑2.5mg/L、a‑萘乙酸0.1‑0.5mg/L；将葡萄愈伤组织转接至胚性愈伤组织培养基培养，得到胚性愈伤组织，胚性愈伤组织培养基含2,4‑二氯苯氧乙酸0.5‑1.5mg/L、6‑苄氨基腺嘌呤0.5‑2.0mg/L、a‑萘乙酸0.05‑0.5mg/L。该方法以葡萄幼嫩茎段为外植体进行诱导，有效解决了葡萄胚性愈伤组织诱导难、诱导率低的问题。

Description

一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法

技术领域

本发明涉及葡萄胚性愈伤组织诱导技术领域，具体涉及一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法。

背景技术

葡萄是多年生落叶藤本浆果类果树，属葡萄科(Vitaceae.Lindl)葡萄属(VitisL.)植物。葡萄组织培养开始于二十世纪四十年代，葡萄再生体系发生的途径主要有器官发生途径和体细胞胚发生途径，但与器官发生相比，体细胞胚发生产生的胚性细胞分散性好，生长旺盛、生理生化代谢活跃、生命力强且易于分化，以胚性愈伤组织作为遗传转化的受体，植株再生性高，遗传操作的效果较好，因此，在葡萄转基因技术研究过程中，再生体系主要以体细胞胚发生途径为主。迄今为止，已有11种葡萄属植物成功地再生出植株，并已被部分学者应用于葡萄遗传转化，获得少量转基因植株。因此，葡萄再生技术的发展为进一步拓宽繁殖葡萄种类以及葡萄遗传转化开辟了更加广阔的前景。但目前葡萄再生大多集中于砧木品种，且再生效率低、重复性差，导致遗传转化率低，基因工程改良葡萄品种进展缓慢。

愈伤组织由葡萄的外植体经过不同培养基诱导后能否诱导产生体细胞胚，取决于是否诱导出有胚性的愈伤组织。一般将诱导产生的愈伤组织划分为三类：(1)淡黄色有明显颗粒状的愈伤组织：体积较小，质地坚硬，多次继代之后会发生褐化，但在发育后期可产生不同形态的胚状体，这一类属于胚性愈伤组织(Embryo callus，EC)；(2)黄色愈伤组织：质地疏松，愈伤组织在发育后期没有诱导出胚状体，被称之为非胚性愈伤组织(NE)；(3)白色愈伤组织：体积较大、质地疏松、增长速度较快，多次继代会发生褐化且水渍化，这一类型属于非胚性愈伤组织(NE)。

授权公告号为CN102499079B的中国发明专利公开了一种葡萄体细胞胚发生的方法。该方法采集开花前5-7天的花蕾，再清洗消毒并吸干水分备用；将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养；选取浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培养基上进行培养；将得到的诱导形成的体细胞胚继代在同样的培养基上进行培养；将得到的体细胞胚同样继代在培养基上进行培养。

授权公告号为CN103444523B的中国发明专利公开了一种花药快速诱导胚性愈伤组织再生植株的方法。该方法采集葡萄盛花前12-14天的花蕾，进行花药愈伤组织培育、愈伤组织分化培养及分化苗生根培养。

不管是以上是花药为原材料进行胚性愈伤组织诱导，还是以种子为原材料进行胚性愈伤组织诱导，均存在一个致命的缺点，那就是原材料的取材受时间季节的限制，不能够实现根据实验或生产的需要随时进行葡萄胚性愈伤组织的诱导培养。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术问题的不足，提供一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，该方法以葡萄幼嫩茎段为外植体诱导形成胚性愈伤组织，步骤简单，取材不受时间季节的限制，耗时短，诱导率高，建立高效的葡萄胚性愈伤组织培养体系，提高葡萄胚性愈伤组织的产量，有效地解决了葡萄胚性愈伤组织诱导困难、诱导率低的问题，为建立葡萄组织培养体系、快速繁育葡萄组培苗奠定基础，是一条提高葡萄组培苗产量的有效途径。

本发明所采用的技术方案为：

一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)外植体的选取：选取抗病、早熟、高产的葡萄植株，取葡萄植株的嫩梢为外植体，经过修剪、消毒洗涤，得到无菌葡萄茎段；

(2)愈伤组织的诱导培养：将无菌葡萄茎段置于葡萄愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养葡萄愈伤组织；将得到的初级培养葡萄愈伤组织再转接至葡萄愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的葡萄愈伤组织，所述葡萄愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0-2.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L，pH值5.8；

(3)胚性愈伤组织的培养：将得到的葡萄愈伤组织转接至胚性愈伤组织培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织，所述胚性愈伤组织培养基以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5-2.0mg/L、a-萘乙酸0.05-0.5mg/L，pH值5.8。

所述步骤(2)中诱导培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养25-35天，光培养按光照强度2000lx下16h、暗条件下8h交替进行。

所述步骤(2)中继代培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养55-65天，光培养按光照强度2000lx下16h、暗条件下8h交替进行。

所述步骤(3)中的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，暗培养55-65天左右。

葡萄体细胞胚胎发生受到内因和外因的影响，内因主要有基因型、外植体类型以及发育阶段等；外因为培养基成分、光照等因素。基本培养基保证培养物的生存与最低的生理活动，但只有配合使用适当的植物激素，才能使培养物健壮的生长，因此培养基激素组合的选取是决定植物组织培养成败的关键因素。与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

(1)选取葡萄植株的嫩梢为原材料进行葡萄胚性愈伤组织的诱导培养，取材方便，不受时间、季节等气候条件的限制，可根据需要随时进行葡萄胚性愈伤组织的诱导培养；

(2)选用合适的愈伤组织诱导培养基和胚性愈伤组织培养基，特别是选用合适的细胞分裂素和生长素，以及选取合适的细胞分裂素和生长素的配比，有效保证了葡萄胚性愈伤组织的顺利诱导，保证了苗/根的形成、且组织本身在器官形成部位的生长调节物质的平衡；

(3)本发明步骤简单，耗时短，诱导率高，建立高效的葡萄胚性愈伤组织培养体系，提高葡萄胚性愈伤组织的产量，有效地解决了葡萄胚性愈伤组织诱导困难、诱导率低的问题，为建立葡萄组织培养体系、快速繁育葡萄组培苗奠定基础，是一条提高葡萄组培苗产量的有效途径。

附图说明

图1所示的是本发明培养得到的初级培养葡萄愈伤组织的照片；

图2所示的是本发明培养得到的葡萄愈伤组织的照片；

图3所示的是本发明培养得到的胚性愈伤组织的照片。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

本实施例葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，包括以下步骤：

1.外植体的选取

选取抗病、早熟、优质高产的葡萄品种金手指的嫩梢为材料(采集自宁波九龙湖镇葡萄园)，从大田中取回当年生半木质化葡萄嫩茎，剪掉叶柄和叶片，剪成长约1-2cm的茎段，用洗洁精洗净葡萄茎段后用自来水冲洗1h，再用无菌纸吸干表面的水分。然后在超净工作台上进行以下步骤：将茎段浸入70％酒精30s后，用无菌水冲洗一次，放入盛有0.1％升汞的广口瓶中浸泡7min，在消毒的过程中不时的摇动广口瓶，使材料的各个部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底，7min后用无菌水将材料冲洗4～5次，用无菌纸吸干葡萄茎段表面的水分，得到无菌的葡萄茎段。

2.愈伤组织的诱导培养

将上述无菌的葡萄茎段切成长约1.5cm左右的小段，接种到葡萄愈伤组织诱导培养基中进行培养。培养条件：温度(25±1)℃、湿度60-70％，暗培养两周后转移到光照强度2000lx下培养，光照时间16/8h的光/暗条件下交替培养，培养1个月后得到初级培养葡萄愈伤组织。经过以上诱导培养后在葡萄茎段的切口处出现愈伤组织，所得结果见图1。

以上愈伤组织的诱导培养共进行8个处理，每个处理接种10瓶，每瓶接种5个外植体，重复3次，以统计其平均愈伤诱导率及生长状态。每个处理使用的葡萄愈伤组织诱导培养基配方如表1所示，pH值5.8，培养基的制备方法如下：以MS为基本培养基(配方如表5所示)，添加3％的蔗糖，0.7％的琼脂，煮沸，再添加适宜浓度的聚乙烯吡咯烷酮、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、a-萘乙酸(NAA)，调pH，分装，最后高温高压灭菌。不同激素对茎段诱导愈伤组织的影响见表2。

表1 8个处理使用的培养基配方

表2 激素对茎段诱导愈伤组织的影响

注：表中小写字母表示显著性差异5％水平。

在愈伤组织的诱导过程中，细胞分裂素和生长素的比例是非常重要的。6-BA能促进愈伤组织或胚状体形成，并诱导分化成植株；而NAA对愈伤组织的诱导、胚状体的产生以及试管苗的快繁也是必需的。从上表2可知，培养基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L的组合中茎段愈伤组织的诱导率显著高于其他处理组。实验结果表明：6-BA1.0mg/L和NAA0.1mg/L的激素配比有利于茎段愈伤组织诱导，诱导率为99.40％。

将初级培养葡萄愈伤组织再转接至葡萄愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，即依次为：接种到葡萄愈伤组织诱导培养基，暗培养两周后转移到光照强度2000lx下培养，光照时间16/8h的光/暗条件下交替培养，培养两个月；再接种到新的葡萄愈伤组织诱导培养基，暗培养两周后转移到光照强度2000lx下培养，光照时间16/8h的光/暗条件下交替培养，培养两个月，培养的环境条件均为：温度(25±1)℃、湿度60-70％。所得结果见图2。

3.胚性愈伤组织的培养

将得到的葡萄愈伤组织转接至胚性愈伤组织培养基中进行培养，培养条件：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，暗培养55-65天左右，得到葡萄胚性愈伤组织，所得结果见图3。

以上胚性愈伤组织的诱导培养共进行9个处理，每个处理接种10瓶，重复3次。每个处理使用的胚性愈伤组织培养基配方如表3所示，pH值5.80，培养基的制备方法如下：以MS为基本培养基，添加3％的蔗糖，0.7％的琼脂，煮沸，再添加适宜浓度的聚乙烯吡咯烷酮、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、a-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸，调pH，分装，最后高温高压灭菌。不同激素对胚性愈伤组织诱导的影响见表4。

表3 9个处理使用的培养基配方

表4 激素对胚性愈伤组织诱导的影响

三种激素组合进行正交实验的结果如上表所示，由上表可知，极差顺序为R(24-D)>R(NAA)>R(6-BA)，说明3个因素中，2,4-D的浓度对胚性愈伤的诱导率的影响最大，因为外植体诱导体细胞转变为胚性细胞过程中2,4-D为重要的激素。其次是NAA和6-BA，从直观分析可以看出，各个因素的最优水平是2,4-D第1水平，6-BA第3水平和NAA第3水平，因此最佳的培养基为3号培养基：MS+2，4-D0.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L，胚性愈伤的诱导率达到89.25％。

本发明实施例涉及到的主要试剂如表6所示，主要实验所用仪器如表7所示；其他用到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合葡萄胚性愈伤组织诱导技术领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

表5 MS培养基配方

表6 实验所需试剂

表7 实验所用仪器

Claims (4)

1.一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)外植体的选取：取葡萄植株的嫩梢为外植体，经过修剪、消毒洗涤，得到无菌葡萄茎段；

(2)愈伤组织的诱导培养：将无菌葡萄茎段置于葡萄愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养葡萄愈伤组织；将得到的初级培养葡萄愈伤组织再转接至葡萄愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的葡萄愈伤组织，所述葡萄愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0-2.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L，pH值5.8；

(3)胚性愈伤组织的培养：将得到的葡萄愈伤组织转接至胚性愈伤组织培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织，所述胚性愈伤组织培养基以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5-2.0mg/L、a-萘乙酸0.05-0.5mg/L，pH值5.8。

2.根据权利要求1所述的一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中诱导培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养25-35天，光培养按光照强度2000lx下16h、暗条件下8h交替进行。

3.根据权利要求1所述的一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中继代培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养55-65天，光培养按光照强度2000lx下16h、暗条件下8h交替进行。

4.根据权利要求1所述的一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，暗培养55-65天。