CN104813939B - 一种荷花再生体系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荷花再生体系的构建方法。用修枝剪将灭菌的‘广昌白莲’的莲子破壳，取出成熟莲心(胚)作为外植体培养无菌苗；2个月后从无菌苗上切取2‑3mm的茎尖、未展开的幼嫩叶片(带有少量叶柄)为外植体诱导愈伤组织；2个月后将愈伤组织诱导分化出芽；1个月后切除底部黑色愈伤，将分化苗增殖；3个月后，将分化苗诱导生根；1个月后将生根的组培苗进行炼苗驯化与移栽。本发明为中国荷花的转基因技术提供了技术基础；较之前的技术提高了荷花的诱导愈伤率，且愈伤组织个大而稳定；提高了不定芽的繁殖系数；还突破性地以荷花无菌苗的幼嫩叶片为外植体诱导愈伤并成功分化成苗，为荷花诱导愈伤的材料选择拓宽了范围，并提供了材料保障。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，涉及一种荷花再生体系的构建方法。
背景技术
荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)为莲科莲属多年生水生花卉,是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值、经济价值和独特的文化内涵，深受人们喜爱。
2013年5月，荷花的全基因组序列公布，将荷花的转基因研究提上了工作日程。而作为转基因重要技术基础的荷花的遗传转化再生体系尚不成熟，严重制约了荷花转基因工作的开展。目前报道的荷花再生的途径有两种，一种途径是由茎尖直接分化形成丛生苗，然后进行增殖，最后诱导生根获得完整植株(于文进，1997；彭静，2001；汤泳萍，2001；刘玫，2002)，但尚未见该再生途径转基因方面的报道。另一种途径是用荷花成熟胚培养出无菌苗，再用无菌苗的茎尖作为外植体诱导出愈伤，然后对愈伤组织诱导不定芽分化，最后生根成苗。
关于用荷花成熟胚进行无菌苗培养时取莲胚的方法以及消毒的方法，郭娜娜等人(2013)使用浓硫酸腐蚀莲子种皮，用小刀破壳后直接用酒精和氯化汞消毒，由于硫酸渗透对外植体造成伤害，成活率最高仅86.63％。孔德政等人(2007)研究发现，对用浓硫酸腐蚀莲子壳获得的种胚进行直接灭菌时间太短则污染率高，时间延长则致死率高。本发明通过实验总结出了用带壳莲子消毒，再破壳取成熟莲胚进行培养的方法，操作简单，死亡率极低，大大降低了污染率(除内生菌外鲜有污染)，褐化率极低，成活率高达98％以上。
发明内容
本发明的目的是提供一种荷花再生体系的高效构建方法，为中国荷花的转基因技术提供重要的技术基础。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种荷花再生体系的构建方法，包括以下步骤：
(1)灭菌：选取‘广昌白莲’的圆形饱满的带壳莲子用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒灭菌备用；
(2)无菌苗的培养：将莲子较圆的一端用无菌修枝剪横剪一下使莲心(胚)露出，然后用镊子取出莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中,每天光照时间为14-16小时，光照强度控制在1500-2500Lx，温度控制在25-28℃；
(3)愈伤组织诱导：从无菌苗上切取2-3mm的茎尖或带有1mm的叶柄未展开的整片幼嫩叶片作为外植体，接种到愈伤培养基上培养，接种时使切口处完全与培养基相接，每个培养基接种5-6个，在黑暗条件下培养，每30天更换新鲜培养基，培养2个月后获得愈伤组织；
(4)不定芽分化诱导与增殖：将叶片和茎尖的愈伤组织接到不定芽诱导培养基上，每天光照时间为14小时，光照强度1500-2500Lx，一个月后分化苗长至1cm时切去下面死去的黑色愈伤，并将分化苗转移至增殖培养基，培养三个月，每30天更换新鲜培养基；
(5)分化苗的生根：将分化苗从增殖培养基转移到生根培养基内，每天光照时间为14小时，光照强度1500-2500Lx，一个月后待小苗长出根后取出小苗进行组培苗的炼苗驯化；
(6)组培苗的炼苗驯化与移栽：将生了根的小苗洗净后，用0.8-1g/L代森锰锌浸泡半小时，栽至装有灭菌淤泥的塑料盆中，遮阴并覆盖薄膜保湿，4天后昼覆夜敞，15天后完全除掉薄膜；其中，使用的培养基配方如下：
无菌苗培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.8，
愈伤诱导培养基：MS+TDZ 0.1-0.2mg/L+NAA 0.7-0.8mg/L+蔗糖50g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6，不定芽诱导培养基：MS+6-BA 50μM+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6,
增殖培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6，
生根培养基：MS+IBA 1-2mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6。
步骤(1)灭菌的具体方法优选：选取“广昌白莲”的圆形饱满的种子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，备用。
步骤(2)中每天光照时间优选14h，光照强度1500-2500Lx，控温优选25℃。
步骤(6)中代森锰锌浓度优选1g/L。
步骤(4)中所述的不定芽诱导培养基优选：MS+6-BA 50μM+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6。
本发明的有益效果：
1、本发明采用先用成熟莲胚培养出无菌苗，再切取无菌苗的茎尖、叶片或叶柄，成功诱导出愈伤组织，并诱导分化成苗最后获得生根苗的方法，成功建立了完整的荷花再生体系，为中国荷花的转基因研究提供了新的途径和重要载体。
2、本发明采取先对带壳莲子消毒，然后用灭菌修枝剪对莲子破壳，取出成熟的莲心(胚)作为外植体培养无菌苗，克服了前人报道的用硫酸腐蚀莲子获取莲胚以及直接对取出的莲胚消毒易杀死莲胚的缺陷，方法操作简单，死亡率极低，污染率低(除内生菌外鲜有污染)，褐化率极低，成活率高(98％以上)。
3、本发明通过对愈伤培养基中外植体个数的调节，大幅提高了愈伤的诱导率，使愈伤率最高达60％。
4、本发明通过对增殖培养基中激素含量的调节，提高了不定芽的繁殖系数，使分化率达到65％。
5、本发明突破性地用荷花无菌苗幼嫩的叶片、叶柄为外植体成功诱导出愈伤，并将带叶柄的叶片产生的愈伤组织诱导分化成苗，为荷花愈伤组织的诱导拓宽了外植体的选择范围，且材料的来源更有保障。
附图说明
图1荷花无菌苗不同外植体诱导出的愈伤组织的褐化情况
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
一种荷花再生体系的构建方法，按以下步骤进行：
(一)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及其每升所含的重量为：
1)基本培养基：MS；
2)无菌苗培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.8；
3)愈伤诱导培养基：MS+TDZ 0.1-0.2mg/L+NAA 0.7-0.8mg/L+蔗糖50g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6，
4)不定芽诱导培养基：MS+6-BA 50μM+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6,
5)增殖培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6
6)生根培养基：MS+IBA 1-2mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6
(二)灭菌及破壳：
试验一：改变破壳和灭菌顺序，分别设立以下两个处理组：
处理组1：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，将莲子用无菌的修枝剪剪开，取出莲心备用。
处理组2：先将莲子用无菌的修枝剪剪开取出莲心，再用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次。
(三)无菌苗的培养：将取出的莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中，每瓶接种4个，各接种30瓶,每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，控温25℃，两个月后获得无菌苗。统计无菌苗成活率和污染率(由于预实验中发现，若组培瓶内出现个别莲胚污染，再取出未污染的莲胚进行消毒时，其死亡率高且污染很难根除，所以发现污染则整瓶剔除)。成活率＝成活的无菌苗数(不包括污染了被剔除的)/接种莲心×100％，污染率＝污染无菌苗数/总接种数×100％。
处理组1共发现6瓶污染，污染率为20％(皆出现在20天后，为莲子自生菌污染)。无污染的96株无菌苗中成活95株，褐化0株，成活率为98.96％，褐化率为0；处理组2无菌苗全部褐化。说明直接灭菌对外植体伤害严重，严重影响后续试验展开，而使用本发明先灭菌后破壳方法有效避免由于直接消毒对外植体的伤害，方法操作简单、污染率低，死亡率极低，为组培培养快速繁殖奠定了基础。
(四)愈伤组织诱导：
试验二：从分别从无菌苗上切取茎尖、带少量叶柄(2-3mm)的幼嫩叶片(下文简称叶片)作为外植体，接到愈伤培养基上培养，接种时使切口处完全与培养基相接，改变接种数目,每个培养基接种数分别为5-10个。在黑暗条件下培养。每30天更换新鲜培养基，培养两个月。两个月后获得愈伤组织，愈伤率和褐化率结果见下表1、表2。
表1表明，叶片外植体愈伤诱导率随数量增加呈现先增加后减少趋势，叶片数量为7时，愈伤诱导率最高，且与接种外植体数量为6和数量为10的愈伤诱导率出现显著性差异。而茎尖在外植体数量为5时愈伤率最高，接种外植体数大于5时愈伤率下降。综上，一瓶培养基中接种叶片数最佳为7，最佳接种茎尖数为5。
表1 不同外植体数量对愈伤率诱导的影响
分析不同数量外植体对愈伤褐化率的影响，数据表明(表2)，叶片和茎尖外植体褐化率随数量增加呈现先减少后增加趋势，分别在叶片数量为8，茎尖数量为9时，愈伤褐化率最低，但是外植体数量对褐化率影响不显著。
这是由于单位面积上接种外植体数不同，获得的营养水平和激素水平都会有所不同，因此合适的外植体密度能够优化愈伤的产生。
表2 不同外植体数量对褐化率的影响
试验三：从无菌苗上切取叶柄(5-8mm)作为外植体，接到愈伤培养基上培养，接种时使切口处完全与培养基相接，在黑暗条件下培养。每30天更换新鲜培养基，培养两个月。两个月后获得愈伤组织，愈伤率结果见表3，褐化率结果见图1。
表3 不同类型外植体的诱导愈伤率情况
从愈伤的生长部位统计，叶片的愈伤大多长在叶缘及叶柄处，愈伤形态为半透明状紧密的组织使叶片或叶柄具有膨大感；而茎尖的愈伤主要长在茎尖端，愈伤形态为半透明状黄白色，紧密的团型物，愈伤较为稳定；幼茎的愈伤主要在周身分布，愈伤形态较松散且数量极少，该愈伤不稳定。
从愈伤诱导率的平均水平来看(表3)，叶片最高，茎尖次之，叶柄最低。在前10天，茎尖、叶片和叶柄的愈伤率无明显差异；在随后的5-10天后叶片愈伤率显著高于叶柄，且茎尖愈伤率增加，并渐与叶柄愈伤率出现显著差异。说明叶片发生愈伤的速度最快，茎尖发生愈伤较慢，叶柄的愈伤生长最缓慢。同时叶片和茎尖愈伤发生较多，适合作为诱导分化的材料。
从‘广昌白莲’愈伤组织第30天时的褐化率的分析可知(图1)，叶柄、茎尖、叶片产生愈伤的褐化率无显著差异；而至第60天时，茎尖愈伤褐化率显著大于叶柄和叶片的愈伤褐化率。说明茎尖愈伤褐化最严重，褐化外植体数量不断增加；而第30天的叶柄和叶片愈伤褐化数值与60天基本无变化，说明叶柄和叶片愈伤褐化主要发生在前30天，且褐化状况不严重。而叶片主要由于诱导过程展开干枯死亡，其原因尚不明了，需要进一步试验探究。所以茎尖诱导愈伤时建议添加如抗坏血酸或其他能抑制褐化的药品，以避免褐化对茎尖诱导的造成损失。
(五)不定芽分化诱导与增殖：
试验四：将叶片和茎尖愈伤组织接到不定芽诱导培养基上，改变6-BA的浓度分别为40μM、50μM、60μM，每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx。一个月后分化苗长至1cm即切去下面死去黑色愈伤，并将分化苗转移至增殖培养基，培养三个月，每30天更换新鲜培养基。分化结果见下表4、表5。
表4 不同浓度6-BA对茎尖分化率的影响
由表4可知，不同浓度6-BA都能促使茎尖分化，其分化率基本呈上升趋势。数据表明50μΜ6-BA下茎尖分化率显著高于40μΜ6-BA处理的茎尖分化率，能更好的促进分化。且较于60μM的分化效果虽然没有显著差异，但更能节约成本。综上，选用50μΜ6-BA促茎尖分化效果较好。
表5 不同浓度6-BA对叶片分化率的影响
叶片也可由叶柄的愈伤处长出小苗，但是没有叶柄的叶片无法长出分化苗。叶片分化率较低，但能成功诱导分化苗。从表5中数据可以看出，50μΜ6-BA处理的叶片分化率略高于40μΜ和60μM 6-BA处理的叶片的分化率，但是无显著差异。由此可见6-BA可以诱导叶片分化，但是对叶片分化率影响不明显。由于叶片在分化诱导过程中会干枯死亡，所以第30天40μM,和50Μm 6-BA处理分化率略有下降。
叶片分化成具有根茎叶的完整植株，可为组培材料选择拓宽渠道。直接使用幼嫩叶片和叶柄进行组培，来源广，既防止破坏性取材对珍稀荷花品种造成损失，还可以直接从珍稀荷花母体上取材以防止基因变异，尤其是为珍稀荷花品种种质资源保存的组培奠定了基础。
(六)分化苗的生根：将分化苗从增殖培养基转移到生根培养基内，每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，一个月后取出小苗进行组培苗的炼苗驯化。
(七)组培苗的炼苗驯化与移栽：将生了根的小苗洗净后，用1g/L代森锰锌浸泡半小时，栽至装有灭过菌的淤泥的塑料盆中.并覆盖薄膜保湿，4d后昼覆夜敞，15d后完全除掉薄膜。
实施例2
(一)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及其每升所含的重量为：
1)基本培养基：MS；
2)无菌苗培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.8；
3)愈伤诱导培养基：MS+TDZ 0.1-0.2mg/L+NAA 0.7-0.8mg/L+蔗糖50g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6，
4)不定芽诱导培养基：MS+6-BA 50μM+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6,
5)增殖培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6
6)生根培养基：MS+IBA 1-2mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6
(二)2014年3月选取‘广昌白莲’的圆形饱满的种子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，备用。
(三)将莲子用无菌的修枝剪剪开，取出莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中,两个月后获得无菌苗。每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，控温25℃。每瓶接种4个，共接种575瓶合计2300棵，其中有81瓶污染，污染率14％(全为自生菌污染)。将污染整瓶剔除后，未污染494瓶约1976个无菌苗。两个月后统计发现死亡13棵，成活1963棵，成活率99.34％。
(四)2014年5月从以上获得的491瓶共计1963株无菌苗上切取茎尖(2-3mm)作为外植体，接到愈伤培养基上培养，接种时使切口处完全与培养基相接，每个培养基接种5-6个。在黑暗条件下培养。每30天更换新鲜培养基，培养两个月。两个月后获得愈伤组织，愈伤率为60％。
(五)2014年7月将获得的253瓶茎尖愈伤组织接到不定芽诱导培养基上，每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，分化率达到65％。一个月后分化苗长至1cm即切去下面死去黑色愈伤，并将126瓶分化苗转移至增殖培养基，培养三个月，每30天更换新鲜培养基。
(六)2014年11月将分化苗从增殖培养基转移到生根培养基内，每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，一个月后取出小苗进行组培苗的炼苗驯化。生根率为33.33％。
(七)2014年12月将生了根的小苗洗净后，用1g/L代森锰锌浸泡半小时，栽至装有灭过菌的淤泥的塑料盆中，并覆盖薄膜保湿，4d后昼覆夜敞，15d后完全除掉薄膜。
Claims (2)
1.一种荷花再生体系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子用75%的酒精和3%次氯酸钠消毒灭菌备用；
（2）无菌苗的培养：用无菌的修枝剪将莲子剪开，取出莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中, 每天光照时间为14h，光照强度1500-2500 Lx，控温25℃，两个月后获得无菌苗；
（3)愈伤组织诱导：从无菌苗上切取2-3mm的茎尖、带有1mm叶柄的未展开的整片幼嫩叶片或5-8mm的叶柄为外植体，接种到愈伤诱导培养基上培养，接种时使切口处完全与培养基相接，每个培养基接种5-6个，在黑暗条件下培养，每30天更换新鲜培养基，培养两个月后获得愈伤组织；
（4）不定芽分化诱导与增殖：将愈伤组织接到不定芽诱导培养基上，每天光照时间为14小时，光照强度1500-2500 Lx，一个月后分化苗长至1cm时切去下面死去的黑色愈伤，并将分化苗转移至增殖培养基，培养三个月，每30天更换新鲜培养基；
（5）分化苗的生根：将分化苗从增殖培养基转移到生根培养基内，每天光照时间为14小时，光照强度1500-2500 Lx，一个月后待小苗长出根后取出小苗进行组培苗的炼苗驯化；
（6）组培苗的炼苗驯化与移栽：将生了根的小苗洗净后，用1 g/L代森锰锌浸泡半小时，栽至装有灭菌淤泥的塑料盆中，遮阴并覆盖薄膜保湿，4天后昼覆夜敞，15天后完全除掉薄膜；
其中，使用的培养基配方如下：
无菌苗培养基：MS+6-BA 1 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L, 琼脂8 g/L,pH=5.8，
愈伤诱导培养基：MS+ TDZ 0.1-0.2 mg/L + NAA 0.7-0.8 mg/L +蔗糖50 g/L, 琼脂8g/L, pH=5.6，
不定芽诱导培养基：MS+ 6-BA 50μM+蔗糖30 g/L, 琼脂8 g/L,pH=5.6,
增殖培养基： MS+ 6-BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L, 琼脂8 g/L, pH=5.6，
生根培养基： MS+IBA 1-2 mg/L+蔗糖30 g/L, 琼脂8 g/L, pH=5.6。
2.根据权利要求1所述的荷花再生体系的构建方法，其特征在于步骤（1）灭菌的具体方法为选取“广昌白莲”的圆形饱满的种子用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3%次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，备用。
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