CN109362571A - 一种通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，包括如下步骤：1）沿阶草种子采集的种类、时间及采后的低温预处理；2）种子的消毒灭菌；3）种子外植体的无菌萌发培养；4）外植体胚性愈伤组织的诱导培养；5）胚性愈伤组织的分化培养；6）种苗的胚状体快繁培养；7）壮苗生根培养；8）无菌苗的移栽。本发明具有操作简单，种子胚芽易形成胚性愈伤组织，进而通过转接在分化培养基上形成具有根茎叶的完整植株，形成的组培苗即可移栽成活转接到种苗胚状体快繁培养基上，经过胚状体增殖培养和胚状体分化快繁培养，就可在2个月内形成胚状体丛生芽或小植株，培养20天左右就形成具有根茎叶的健壮种苗，且极易移栽成活，成活率高达100%。

Description

一种通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法
技术领域
本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法。
背景技术
沿阶草(Ophiopogon japonicus)又名麦冬，属百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，因其植株低矮，四季常绿，适应性广，喜温耐寒、耐瘠耐阴，抗病虫性好，无需修剪等特性而成为暖季型园林绿化中不可或缺的构景草坪地被植物。沿阶草的块根，又常为滋阴中药，《神农本草经》列为上品，具有养阴生津，润肺清心的功效，还是“药食同源”品种，在保健食品的开发方面也有大量的应用。
沿阶草通过种子繁殖很困难，所以生产上往往采用分株繁殖，但分株繁殖不但繁殖系数很低，生长也很缓慢，还易引起种质严重地衰退现象，从而影响了沿阶草优良种质的快繁及推广应用。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，包括如下步骤：
1)沿阶草种子采集的种类、时间及采后的低温预处理：采集种类包括野生沿阶草或地方沿阶草品种；时间可从当年10月底开始到第二年2月底结束；未成熟种子需低温处理1-2个月；
2)种子的消毒灭菌：包括次氯酸钠液消毒，之后用70-75％酒精灭菌，升汞+吐温混合液消毒灭菌；
3)种子外植体的无菌萌发培养：包括剥去种皮并对半劈开，之后接种在MS+GA4.0mg/L培养基上光照培养；
4)外植体胚性愈伤组织的诱导培养：采用胚性愈伤组织诱导培养基对外植体进行暗培养；
5)胚性愈伤组织的分化培养：采用分化培养基对胚性愈伤组织进行光照培养得到胚状体；
6)种苗的胚状体快繁培养：采用胚状体增殖培养基和胚状体分化快繁培养基对胚状体进行光照培养；
7)壮苗生根培养：采用壮苗生根培养基光照培养；
8)无菌苗的移栽：将组培苗室内炼苗1-2d之后移栽到穴盘中，适当遮荫，及时浇水，10～20d即可成活。
其中，所述步骤3)～步骤8)中的培养条件为：培养温度均在25-30℃，光照强度500-2000LX，光照时间12h-14/d，PH5.8-6.0；所有培养基均添加7g/L琼脂，蔗糖30g/L。
其中，所述步骤4)的胚性愈伤组织诱导培养基MS+2,4-D 0.5-3.0mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L。
作为进一步优选，所述步骤4)的胚性愈伤组织诱导培养基MS+2,4-D 2.0mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L。
其中，所述步骤5)的分化培养基为MS+6-BA0-2mg/L+NAA0-0.1mg/L。
作为进一步优选，所述步骤5)的分化培养基为MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L。
其中，所述步骤6)的胚状体增殖培养基MS+2,4-D0.5mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA0.2mg/L。
其中，所述步骤6)的胚状体分化快繁培养基MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：该方法具有操作简单，种子胚芽易形成胚性愈伤组织，进而通过转接在分化培养基上形成具有根茎叶的完整植株，形成的组培苗即可移栽成活也可转接到种苗胚状体快繁培养基上，经过胚状体增殖培养和胚状体分化快繁培养，就可在短短的2个月内源源不断形成几十余个大小不同、形状各异的胚状体丛生芽或小植株，丛生芽或小植株只需在基本培养基中培养20天左右就可形成具有根茎叶的健壮种苗，且极易移栽成活，成活率高达100％。所以此项发明技术既解决了沿阶草种子繁殖困难，分株繁殖系数低，生长缓慢，良种种质衰退严重等问题，也有利于大规模工厂化生产良种，为生产上提供源源不断的整齐健壮的优良种苗及优良种苗的示范推广应用。
具体实施方式：
下面通过实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：
1、沿阶草种子采集的种类、时间及采后的低温预处理：采集种子的种类包括有金边细叶型、矮生型、长叶型及银纹沿阶草等；采集时间可从当年10月底开始(未成熟种子)到第二年2月底结束(成熟种子)；但未成熟的种子需放入0℃冰箱低温冷藏处理1-2个月，而自然成熟的种子可直接消毒灭菌进行无菌培养。
2、种子的消毒灭菌：把上述种子先去掉果皮，放在洗衣粉中浸泡15-20min后流水冲洗2h，再用2％次氯酸钠液消毒20-25min，灭菌水冲洗3次后吸干表面水分，拿到超净工作台上再用下述消毒液灭菌：先用70-75％酒精浸泡30s，之后放入0.1％升汞+3滴吐温混合液中消毒8-10分钟，无菌水冲洗8-10次后，用灭菌吸水纸擦干水分，准备接种。
3、种子外植体的无菌萌发培养：将上述消毒灭菌过的种子剥去种皮，对半劈开把剖开面紧贴培养基，接种在7％琼脂+GA4.0mg/L培养基上诱导种子无菌萌发；以培养10-13天，温度为28士2℃，光照为自然光下获得的无菌萌发外植体为最好。
4、外植体胚性愈伤组织的诱导培养：将上述无菌萌发的外植体接种到诱导胚性愈伤组织的培养基即为不同2,4-D浓度梯度的配方：即MS+2,4-D0-2.0mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA0.2mg/L中，每瓶接种5个外植体，共接种10瓶，暗培养26-30天后，观察在2,4-D不同浓度梯度下外植体胚性愈伤组织生长发育的状况,并统计胚性愈伤组织形成率。
胚性愈伤组织形成率＝形成胚性愈伤组织的外植体/供试外植体*100％
表1不同浓度的2,4-D培养基配方及对胚性愈伤组织发育的影响
从表1可以看出：2,4-D对胚性愈伤组织的形成影响很大，若2,4-D浓度过低，则基本无胚性愈伤组织形成；2,4-D浓度过高，愈伤组织生长过快过大，水渍化程度高，也不利于胚性愈伤组织的形成；所以2,4-D浓度的高低对胚性愈伤组织的形成率及形成时间影响很大，过低过高都不利于胚性愈伤组织的发育成熟，实验结果表明，合适的2,4-D浓度即最好的是配方5，胚性愈伤组织发育中等正常大小，形成时间也短，总体缩短了生长发育时期，加快了组培快繁时间。
5、胚性愈伤组织的分化培养：将上述配方5的外植体转接到不同6-BA浓度梯度的分化培养配方：即MS+6-BA0-2mg/L+NAA0-0.1mg/L的培养基上，在1500-2000LX光下培养12h/d，培养26-30天后，观察在6-BA不同浓度梯度下外植体分化的情况,并统计胚性愈伤组织分化率。
表2不同浓度的6-BA培养基配方及对胚性愈伤组织分化的影响
从表2可以看出：6-BA和NAA对胚性愈伤组织的分化影响不大，但对丛生芽的形成率及植株的健壮程度影响很大，6-BA过低不利于丛生芽的形成及植株的发育成熟，生长健壮；实验结果表明，合适的6-BA浓度即最好的配方是配方6，胚性愈伤组织即可分化出大量的丛生芽，又能生长出旺盛的生长健壮的完整植株。
6、种苗的胚状体快繁培养：将上述分化的丛生芽苗剪去老根老叶之后转入下述胚状体增殖培养基即MS+2,4-D 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L中，在500-1000LX光下培养12h/d，培养28-30天后，再转入MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L的胚状体分化快繁培养基上，在1500-2000LX光下培养12h/d，培养28-30天后，种苗芽增殖倍数平均可达22-26倍，所以此步骤既可以继续作为下一代的繁殖材料，扩大繁殖系数，加速了组培快繁周期，也扩大了种苗生产数量，有利于种苗工厂化育苗生产。
7、壮苗生根培养：将上述分化的丛生芽苗分成单株，剪去老根老叶转入壮苗生根培养基(即1/2MS+7％琼脂+20g白糖)，在1500-2000LX光下培养12h/d，20天左右待种苗长成具有完整根茎叶的正常健壮植株进行移栽。
8、无菌苗的移栽与成活：将上述生根的组培苗揭开瓶口的封口膜室内炼苗1-2d，之后取出小苗，洗净根上附着的培养基，移栽到装有蛭石和泥炭土的混合基质的穴盘中，适当遮荫，并及时浇水，保持种苗处在湿润状态直到长出新根，15d左右统计成活率可达100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）沿阶草种子采集的种类、时间及采后的低温预处理：采集种类包括野生沿阶草或地方沿阶草品种；时间可从当年10月底开始到第二年2月底结束；未成熟种子需低温处理1-2个月；
2）种子的消毒灭菌：包括次氯酸钠液消毒，之后用70-75%酒精灭菌，升汞+吐温混合液消毒灭菌；
3）种子外植体的无菌萌发培养：包括剥去种皮并对半劈开，之后接种在MS+GA4.0mg/L培养基上光照培养；
4）外植体胚性愈伤组织的诱导培养：采用胚性愈伤组织诱导培养基对外植体进行暗培养；
5）胚性愈伤组织的分化培养：采用分化培养基对胚性愈伤组织进行光照培养得到胚状体；
6）种苗的胚状体快繁培养：采用胚状体增殖培养基和胚状体分化快繁培养基对胚状体进行光照培养；
7）壮苗生根培养：采用壮苗生根培养基光照培养；
8）无菌苗的移栽：将组培苗室内炼苗1-2d之后移栽到穴盘中，适当遮荫，及时浇水，10~20d即可成活。
2.根据权利要求1所述的通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，其特征在于，所述步骤3）~步骤8）中的培养条件为：培养温度均在25-30℃，光照强度500-2000LX，光照时间12h-14/d，PH5.8-6.0；培养基添加7g/L琼脂，蔗糖30g/L。
3.根据权利要求1所述的通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，其特征在于，所述步骤4）的胚性愈伤组织诱导培养基MS+2,4-D 0.5-3.0mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L。
4.根据权利要求1所述的通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，其特征在于，所述步骤5）的分化培养基为MS+6-BA0-2mg/L+NAA0-0.1mg/L。
5.根据权利要求1所述的通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，其特征在于，所述步骤5）的分化培养基为MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L。
6.根据权利要求1所述的通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，其特征在于，所述步骤6）的胚状体增殖培养基MS+2,4-D0.5mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L。
7.根据权利要求1所述的通过沿阶草种子组培快繁种苗的方法，其特征在于，所述步骤6）的胚状体分化快繁培养基 MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L。
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