CN105850728A - 一种荆半夏种茎快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荆半夏种茎快速繁殖方法，步骤是：A﹑外植体的选择和诱导：选用叶柄作外植体，以叶片展开后的叶柄作外植体，经自来水冲洗后，加入酒精，浸泡,倒掉酒精，用无菌水清洗，用新洁儿灭浸泡，倒掉新洁尔灭，用无菌水清洗，加入升汞溶液和吐温，浸泡，用无菌水清洗后接种到诱导培养基，培养形成带芽的球状体；B﹑球状体芽的增殖：经过诱导将获得带有芽点的球状体，在超净工作台内将芽切开，切开的球状体含芽点，增殖培养；C、种茎的形成：带芽的球状体经过增殖培养后，取下单个芽点，在超净工作台接种到种茎培养基，促使种茎增大。方法易行，操作简便。能有效的降低了内生菌对半夏无菌培养的影响，提高了组培快繁效率。增殖效率高。

Description

一种荆半夏种茎快速繁殖方法

技术领域

本发明属于通过组织培养技术的植物再生技术领域，更具体涉及一种利用植物组织培养技术生产荆半夏种茎的方法。该方法主要用于荆半夏种茎的快速生产。

背景技术

半夏(Pinellia ternata)为天南星科半夏属多年生草本植物，株高15-30厘米；块茎近球形，直径1-2厘米；叶出自块茎顶端，叶柄长6-23厘米，一年生的叶为单叶，卵状心形；2-3年后，叶为三出复叶。半夏是一种常用的中药材，在588种中药处方中，半夏使用频率居第22位。具有降逆止呕、燥湿化痰、消痞散节的功效。近年来,研究发现半夏还有抗早孕、抗肿瘤、降血脂、护肝等功能。由于市场需求量大，野生半夏资源无法满足，现已有大规模的人工种植。但半夏人工种植所需种茎量大，成本高。目前，人工种植半夏每亩地需种茎300-400kg，购买这些种茎的成本约为6000-8000元，因此，人工种植半夏种茎的成本为6000-8000元/亩。这也是影响半夏人工种植效益的主要因素之一。因此，开发种茎高效繁殖方法是提高半夏人工种植效益的途径之一。

自然状态下，半夏可通过有性和无性两种方式进行繁殖。半夏雌雄花序在同一个佛焰苞中，属同株异花传粉，一般而言，只有较大块茎才能抽出佛焰苞，形成的种子在常规条件下萌发率相当低。因此，有性繁殖不是其主要繁殖方式。自然群体内大部分个体是源自无性繁殖产生的珠芽。珠芽繁殖是半夏无性繁殖的主要方式，珠芽着生在叶柄下部内侧面，有的会在三叶交汇处着生一珠芽。珠芽落于土中形成新植株，珠芽变成了块茎。半夏块茎偶尔也产生子块茎，子块茎能形成新个体。块茎繁殖是另一种无性繁殖方式。综上所述可见，自然状态下半夏繁殖效率低。

组织培养是一种植物快速繁殖的方法，是指从植物体中取出组织、器官，然后模拟机体的生理条件，在体外进行培养，使之生存，形成组织或长成植株的技术过程。任家惠(1983)最早用半夏叶片和叶柄作外植体进行研究，通过愈伤组织获得大量完整植株。通过组培方法快繁半夏种苗的方法主要集中于外植体、培养条件和培养基、再生途径方面。半夏组织培养中常用的半夏材料有叶片、叶柄、块茎和珠芽。夏海武(1994)在半夏不同生长时期分别取叶片、叶柄和块茎进行培养，发现早期取材诱导效果较好。万美亮等(1995)的研究表明叶柄诱导效果最好，叶片次之，二者皆启动快，诱导率可达 90％；而块茎、珠芽较差。武宗信等(2005)报道了采用珠芽成功建立半夏无性繁殖系，并获得了大量再生植株。邱萍等(2008)采用半夏茎尖作外植体，得到较高的成活率和成苗率。培养条件和培养基方面研究比较一致，MS培养基是比较适合培养基，培养光照强度1500～2500lx，每日10～12h左右。培养温度为(25±1)℃。半夏植株再生途径有两种：器官途径和胚状体途径。朱忠荣(1991)等用叶柄和块茎切块进行培养，过程中不出现明显的愈伤组织，而是直接从外植体表面产生多个球状体，然后由球状体上方长绿芽，下方长出根。何奕昆(1994)等将叶柄接在分化培养基上，可直接产生小块茎或小鳞茎,进而分化出完整植株。在某些情况下也可经过愈伤阶段形成再生苗。以上研究为半夏组培快繁奠定了基础，可利用半夏叶柄、叶片、珠芽和块茎作为外植体进行培养，最终均可获得完整植株。

在半夏人工栽培中，还主要是用半夏块茎作为种茎，播种量为300-400kg/亩，种茎成本为6000-8000元/亩，一般5年内不用再购买种茎。因此，如果通过组培方法来商业化生产种茎，需要在种茎质量、成本等方面优于天然块茎。为此，一些半夏改良的组培快繁方法被建立起来，主要目标在于降低半夏种植的成本，提高半夏种植的效益。为了减少组培中的操作环节，降低成本，罗成科等(2007)引入一步成苗技术，该技术的优点是将组培技术中的诱导、增殖和分化等环节合并一个环节，将外植体叶片接入到培养基中，经过90天培养后，获得再生苗，再生苗移栽容易存活。应该说，一步成苗技术有助于半夏组培快繁技术的商业化应用。对于培养方式也有些有益探索。贾明良等(2012)将间歇浸没培养的方法引入半夏组培快繁，减少培养时的人力投入，且提高增殖率，为低成本生产大量高质量的种苗提供保障。该方法的具体操作是：将无菌外植体接入到生物反应器中，间歇性地加入无菌液体培养基，使外植体能从培养基中吸收养分，接受培养基中激素的诱导，另一方面，又可避免像悬浮培养那样导致外植体和分化苗等中间体玻璃化。该方法展现出一些工业化生产的特点，为半夏利用组培方法进行商业化生产提供了技术支持。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种荆半夏种茎快速繁殖方法，方法易行，操作简便。能有效的降低了内生菌对半夏无菌培养的影响，提高了组培快繁效率。能高效的诱导带芽球状体的形成，并能使带芽球状体高效的增殖，增殖效率高。所形成种茎相对组培苗使用更方便。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明构思是：一种荆半夏种茎快速繁殖方法包括三个步骤：A﹑外植体的选择和诱导；B﹑球状体芽的增殖；C﹑种茎形成。

一种荆半夏种茎快速繁殖方法，其步骤是：

A﹑外植体的选择和诱导：当选用叶柄作外植体时，应该选用叶片还未展开时叶柄作为外植体，叶柄展开后的叶柄作外植体时，其内生菌的污染率明显增高。外植体的诱导过程如下：取下按上述要求选取的叶柄外植体，经自来水冲洗10-30min后，在超净工作台中将上述叶柄外植体移到一个经灭菌的烧杯中，加入75％(V/V，体积比)酒精，浸泡28－32S,倒掉酒精，用无菌水清洗2－4次，然后加入0.1％(M/V，体积质量比)新洁尔灭浸泡2－4min，倒掉新洁尔灭，用无菌水清洗4－6次，然后加入0.2％(M/V，体积质量比)升汞溶液和1-2滴吐温，浸泡8－12min，期间应旋转烧杯，使药剂和外植体表面充分接触，然后用无菌水冲洗4－6次。接种时尽量将叶柄在滤纸上晾干，以平躺的方式接种到培养基上。诱导培养基为：MS+TDZ 0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L，pH5.4－pH6.2。也可以用叶片作为外植体，操作过程与上述操作相同。用无菌苗的叶柄和叶片作外植体无需进行外植体消毒过程。接种完毕后接好后将培养瓶放入培养室培养，培养室温度24－26℃左右，光照1500～2500lx，光照时间为：10-12h/d。培养25-30d可形成带芽的球状体。

另外，为了降低组培过程中劳动量和成本，可用PC方盒代替培养瓶，用滤纸取代琼脂。具体操作如下：以长宽高分别为20×13×9cm的带盖PC方盒为例。制作一个长宽比此方盒长宽略小的PC板，保证能卡在方盒中间。将滤纸铺在PC板上，然后卡在方盒内，将方盒盖盖后放入高压灭菌灭菌，同时将配制好的上述不加琼脂培养基也放入高压灭菌锅灭菌，完毕后，在超净工作台内将液体培养基加入PC方盒，盖上盖子，等培养基冷却后，将上述外植体接种滤纸上，接种密度与接种到培养基上相同。此改进能大幅度降低培养基分装的劳动量。同时也可更有效利用组培架空间。

所述的叶柄(petiole)是叶片与块茎的联系部分，其上端与叶片相连，下端着生在茎上，通常叶柄位于叶片的基部。少数植物的叶柄着生于叶片中央或略偏下方，称为盾状着生，如莲、千金藤。叶柄通常呈细圆柱形。

B﹑球状体芽的增殖：经过步骤A的诱导将获得带有芽点的球状体，在超净工作台内将芽切开，尽可能保证切开的球状体含2-3个芽点，增值培养密度控制在0.2个/cm²左右。芽增值培养基为：MS+6-BA 0.5-1.0mg/L，蔗糖30g/L pH5.8。培养条件为：温度24－26℃左右，光照1500～2500lx,光照时间：10h/d。一般24－26d左右可达到充分增殖。

本步骤同样可利用PC方盒改进方法，节省劳动量。

C、种茎的形成：带芽的球状体经过增殖培养后，尽量取下单个芽点，在超净工作台接种到种茎培养基，种茎培养基配方为：1/2MS，蔗糖45-60g/L,pH5.8。培养条件为：温度24－26℃左右，光照1500～2500lx,光照时间：10h/d。一般18－22d左右可形成完整植株，可见叶片、叶片和根系从切下的芽点上长出，此时，该芽点已具备半夏块茎的特性。此时，可将培养瓶放在室温(室温在15-30℃之间)下有自然光照的地方，有利于营养物质在种茎中进一步积累，促使种茎增大。

所述的诱导培养基：MS+TDZ 0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L，pH5.4－pH6.2；

所述的增殖培养基：MS+6-BA 0.5-1.0mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8；

所述的种茎形成培养基：1/2MS，蔗糖45-60g/L,pH5.8。

本发明与现有技术相比，具有以下优点与效果：

(1)与半夏自然繁殖和一次成苗技术相比，本发明主要特征是半夏种茎繁殖效率高。自然状态下，一棵生长2年半夏苗可产生1-2个珠芽(种茎)，通过本发明一个培养过程(75-90d)，无污染情况下一棵苗可产生约468个种茎[21(诱导芽点数)×3(叶柄通常可切成三段)×6(增殖率)+5(诱导芽点数)×3(三片叶)×6(增殖率)计算方法]。繁殖效率相较自然繁殖效率提高约20万倍。

(2)与传统采用自然生长半夏块茎做种茎的方法相比，本发明主要特征是工厂化大规模生产优势明显，种茎成本可降低。按100平米培养室的组培规模，每斤半夏种茎成本为5-6元，与传统采用自然生长半夏块茎做种茎的方法(每斤10-20元)相比成本相对较低。

(3)本发明操作简单，成本低，具备推广前景。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的详细描述，但并非是对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

一种荆半夏种茎快速繁殖方法，其步骤是：

A﹑外植体的选择和诱导：当选用叶柄作外植体时，应该选用叶片还未展开时叶柄作为外植体，叶柄展开后的叶柄作外植体时，其内生菌的污染率明显增高。外植体的诱导过程如下：取下按上述要求选取的叶柄外植体，经自来水冲洗10-30min后，在超净工作 台中将上述叶柄外植体移到一个经灭菌的烧杯中，加入75％(V/V，体积比)酒精，浸泡28或29或30或31或32S,倒掉酒精，用无菌水清洗2或3或4次，然后加入0.1％(M/V，体积质量比)新洁尔灭浸泡2或3或4min，倒掉新洁尔灭，用无菌水清洗4或5或6次，然后加入0.2％(M/V，体积质量比)升汞溶液和1-2滴吐温，浸泡8或9或10或11或12min，期间应旋转烧杯，使药剂和外植体表面充分接触，然后用无菌水冲洗4或5或6次。接种时尽量将叶柄在滤纸上晾干，以平躺的方式接种到培养基上。诱导培养基为：MS+TDZ0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L,pH5.4或5.6或5.8或6或6.2。也可以用叶片作为外植体，操作过程与上述操作相同。用无菌苗的叶柄和叶片作外植体无需进行外植体消毒过程。接种完毕后接好后将培养瓶放入培养室培养，培养室温度24或25或26℃，光照1500或2000或2500lx，光照时间为：10或11或12h/d。培养25或27或28或29或30d可形成带芽的球状体。

另外，为了降低组培过程中劳动量和成本，可用PC方盒代替培养瓶，用滤纸取代琼脂。具体操作如下：以长宽高分别为20×13×9的带盖PC方盒为例。制作一个长宽比此方盒长宽略小的PC板，保证能卡在方盒中间。将滤纸铺在PC板上，然后卡在方盒内，将方盒盖盖后放入高压灭菌灭菌，同时将配制好的上述不加琼脂培养基也放入高压灭菌锅灭菌，完毕后，在超净工作台内将液体培养基加入PC方盒，盖上盖子，等培养基冷却后，将上述外植体接种滤纸上，接种密度与接种到培养基上相同。此改进能大幅度降低培养基分装的劳动量。同时也可更有效利用组培架空间。

B﹑球状体芽的增殖：经过步骤A的诱导将获得带有芽点的球状体，在超净工作台内将芽切开，尽可能保证切开的球状体含2或3个芽点，增值培养密度控制在0.2个/cm²左右。芽增值培养基为：MS+6-BA 0.5-1.0mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8。培养条件为：温度24或25或26℃，光照1500或1800或2200或～2500lx,光照时间：10h/d。一般24或25或26d左右可达到充分增殖。

C、种茎的形成：带芽的球状体经过增殖培养后，尽量取下单个芽点，在超净工作台接种到种茎培养基，种茎培养基配方为：1/2MS，蔗糖45-60g/L,pH5.8。培养条件为：温度24或25或26℃，光照1500或1900或2300或2500lx,光照时间：10h/d。一般18或19或20或21或22d可形成完整植株，可见叶片、叶片和根系从切下的芽点上长出，此时，该芽点已具备半夏块茎的特性。此时，可将培养瓶放在室温(室温在15或18或20或23或23或28或30℃之间)下有自然光照的地方，有利于营养物质在种茎中进一步积累，促使种茎增大。

实施例2：

一种荆半夏种茎快速繁殖方法，其步骤是：

A、外植体的选择和诱导：

a、外植体的选择，为了确定合适的外植体，选用半夏块茎、珠芽、不同发育时期的叶柄和叶片作为外植体，测试其污染率和诱导效率。外植体消毒方法如下：先用自来水冲洗15min。在超净工作台内，将冲洗干净的叶柄和叶片转到经过灭菌的瓶中，加75％酒精浸泡30s，用无菌水冲洗3次，然后加0.01％新洁尔灭溶液浸泡5min，用无菌水冲洗5次，然后用0.1％升汞浸泡10min，用无菌水冲洗5次。测试培养基为：MS+TDZ0.5mg/L+NAA0.01mg/LpH5.8。叶柄切取长度为1cm左右，块茎切成约0.5×0.5×0.5cm大小，珠芽对半切开，叶片切成1×1cm大小。每种外植体取15个，分别接种5个经灭菌的培养基中。7或9或12或15或18或20d后统计结果。见表1

表1不同外植体培养效果

注：叶柄1和叶片1表示半夏叶片长出，但叶片未展开这一时期；叶柄2和叶片2表示叶片展开，但珠芽并未形成时期；叶柄3和叶片3表示珠芽已形成时期。诱导效果“差”表示外植体褐化或未有芽点形成。“较好”表示有芽点形成，但芽点数量不多。“好”表示形成芽在10个以上。

从以上结果可看出，叶片形成初期的叶柄和叶片不仅污染率低，诱导效果较好，适合做外植体。

b、适合外植体诱导的培养基筛选：设计不同浓度细胞分裂素培养基，培养基基本成分为MS，蔗糖浓度为30g/L，pH为5.8。然后将发育初期的叶柄和叶片接种到培养基上。接种时将叶柄切成1cm左右，叶片大小在1×1cm左右。每种培养基接种5瓶，每瓶接种3个外植体。外植体消毒方法与“a、外植体的选择”部分相同。培养条件为：培养室温度25℃左右，光照1500或2100或2500lx，光照时间为：12h/d。25d后统计结果。

结果见表2。

由此可见，随着细胞分裂素浓度增高，诱导形成芽的数量也在增加，但同时，芽点之间接触紧密，不易分离。但作为一种高效的快繁体系，诱导形成芽点越多意味着最终的效率越高。因此，细胞分离素选择TDZ，浓度在0.5-1.0mg/L比较合理。

表2细胞分裂素种类和浓度对外植体诱导效果

注：芽点诱导率＝芽点数/外植体数*100％；芽点大小和密度分三个等级，“a”代表芽点较大，芽点之间易于分离，“b”代表芽点中等，芽点比较容易分离，“c”代表芽点较小，芽点之间距离较小，相对不易分离。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例3：

一种荆半夏种茎快速繁殖方法，其步骤是：

A、球状体芽的增殖：为使球状体芽增殖，同时，使芽分散且易于分离，设计一系列分裂素种类和浓度不同培养基，培养基基本成分为MS，蔗糖添加量为30g/L,pH值为5.8。将上述诱导形成球状体上芽点切下，约2-3个芽点为一个单位，接种到增殖培养基上。每瓶培养基接种3个带2-3个芽的球状体，每种培养基接种5瓶。

B、培养条件与实施例1和实施例2相同。培养25d后观察芽点增殖和分散效果，见表3。从中可以看出，随着6-BA和TDZ浓度增加，芽增殖效率越高，但同时也导致芽点之间紧密相连，这对于下一步种茎形成不利。综合增值率和芽点分散效果两方面考虑，6-BA浓度控制在0.5-1.0mg/L合适。TDZ细胞分裂素效果太强，伴随着增殖还会引起芽点相连。

表3不同分裂素种类和浓度对球状体芽增殖的影响

注：增殖率＝增值后芽点数/增殖前芽点数；芽点分散效果：“a”代表分散效果良好，“b”代表芽点分散效果比原球状体芽点分散度稍好，“c”代表分散度与原球状体相同。

其它实施步骤与实施例1相同。

实例4：

一种荆半夏种茎快速繁殖方法，其步骤是：

A、种茎的形成：此步培养是使芽点转变成块茎，如果自然状态下珠芽落到土壤转变块茎一样。

B、鉴于步骤A的结果和自然状态下珠芽向块茎的转变过程，在培养基不适合添加细胞分裂素。为使形成种茎具有更大体积(更大体积块茎做种茎可以降低收获块茎的年限)，在培养基基本成分和蔗糖浓度方面进行对比实验。结果见表4。由此可见，降低基本培养基至1/2水平对半夏种茎形成无影响，降低至1/4水平则有影响。蔗糖浓度增加有利于半夏种茎的增大。故种茎培养基以1/2MS为基本成分添加60g/L蔗糖为宜。

表4MS培养基浓度及蔗糖添加量对种茎影响

其它实施步骤与实施例1相同。

Claims (1)

1.一种荆半夏种茎快速繁殖方法，其步骤是：

A﹑外植体的选择和诱导：选用叶柄作外植体，叶柄展开后的叶柄作外植体，外植体的诱导过程如下：取下选取的叶柄外植体，经自来水冲洗10-30min后，在超净工作台中将上述叶柄外植体移到一个经灭菌的烧杯中，加入75%V/V酒精，浸泡28－32S,倒掉酒精，用无菌水清洗2－4次，然后加入0.1%M/V新洁尔灭浸泡2－4min，倒掉新洁尔灭，用无菌水清洗4－6次，然后加入0.2%M/V升汞溶液和1-2滴吐温，浸泡8－12min，期间应旋转烧杯，使药剂和外植体表面接触，然后用无菌水冲洗4－6次，接种时将叶柄在滤纸上晾干，以平躺的方式接种到培养基上，诱导培养基为：MS+TDZ 0.5-1.0mg/L ,蔗糖30g/L，pH5.4－pH6.2，接种完毕后将培养瓶放入培养室培养，培养室温度24－26℃，光照1500~2500 lx，光照时间为：10-12h/d，培养25-30d形成带芽的球状体；

B﹑球状体芽的增殖：经过步骤（A）的诱导将获得带有芽点的球状体，在超净工作台内将芽切开，切开的球状体含2-3个芽点，增值培养密度控制在0.2个/cm²，芽增值培养基为：MS+6-BA 0.5-1.0 mg/L，蔗糖30g/L pH5.8，培养条件为：温度24－26℃，光照1500~2500 lx,光照时间：10h/d，24－26d达到增殖；

C、种茎的形成：带芽的球状体经过增殖培养后，取下单个芽点，在超净工作台接种到种茎培养基，种茎培养基配方为：1/2MS，蔗糖45-60g/L, pH5.8，培养条件为：温度24－26℃，光照1500~2500 lx,光照时间：10h/d，18－22d形成完整植株，见叶片、叶片和根系从切下的芽点上长出，该芽点已具备半夏块茎，将培养瓶放在室温下有自然光照的地方，有利于营养物质在种茎中进一步积累，促使种茎增大。