CN101491216B

CN101491216B - 一种吴茱萸组培快繁方法

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Publication number: CN101491216B
Application number: CN2009100964699A
Authority: CN
Inventors: 徐刚; 陈剑平; 汪一婷; 吕永平; 牟豪杰
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-03-09
Filing date: 2009-03-09
Publication date: 2011-11-09
Anticipated expiration: 2029-03-09
Also published as: CN101491216A

Abstract

本发明涉及一种吴茱萸组培快繁方法，属植物繁殖技术领域，包括如下步骤：选种、材料培育、外植体的选取与灭菌、培养基的配制、诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽。本发明的优点是：提出的吴茱萸组培优化培养基针对性强、适用性好，克服了组培苗玻璃化严重的问题，原始外植体诱导率80％；组培苗培增殖率每周期(约45天)2～3倍；组培苗生根率达90％以上；组培苗移栽成活率达90％以上；组培穴盘苗的大田定植成活率达到95％以上，年组培苗生产能力可达100万苗以上，适于大规模工厂化生产。

Description

一种吴茱萸组培快繁方法

技术领域

本发明涉及植物组培快繁技术领域，尤其涉及一种吴茱萸组培快繁方法。

背景技术

吴茱萸为常用大宗中药材，别名吴萸，吴椒、米椒子、茶辣、石虎等，属芸香科吴茱萸属植物。以果实供药用，具有温中、散寒、燥温、疏肝止呕，止痛的功能；主治胃腹冷痛、恶心呕吐、泛酸暖气、腹泻、痛经、胁痛、疝痛、脚气痛，蛲虫病等症；外用治湿疹、杀虫、高血压。现代药理研究证明：吴茱萸提取液有镇痛、杀虫、抑菌以及收缩子宫作用。随着医药科技的发展，吴茱萸的功能效用在不断扩大，吴茱萸及其复方制剂的研究，新用途新剂型及新药的开发已越来越受到人们的关注，特别是在临床上发现其可用于治疗高血压等心血管疾病后，更引起了国内外的高度重视。上述有关吴茱萸的现代研究，为其深度开发打下良好的基础，其开发潜力极大，发展前景广阔。

我国吴茱萸生产应用历史悠久，过去以野生为主，现大多依赖人工栽培，上世纪50年代末，吴茱萸部分产区开展野生变家种驯化工作，生产发展较快，产量逐年增加，但目前吴茱萸尚处于半野生状态，种内性状变异复杂，株间产量、质量差异极大，其主要表现在：1、成熟期差异较大，前后相差近一个月；2、单株产量相差较大，从0.5至3千克不等；3、药材折干率差异大，从15％至50％不等；4、药用成分差异大；5、雌雄异株，各占50％左右。鉴于以上的性状差异，直接影响生产成本、产量和质量，同时也影响着产品的市场竞争力。

中药材种质是中药材生产过程中的重要生产资料，随着中药材规范化生产的普及，特别对于作为中药饮片和中成药主要原料的药用植物来说，在中药材生产过程中，只有采用主要经济性状整齐一致的优良种质与品种，才是确保其中药饮片和中成药质量稳定而可靠的重要手段之一。吴茱萸是极其重要的中药饮片和中成药原料药材，我国著名的地道药材(浙江省是主产地之一)，但对其种质资源和品种资源(基因型或化学型等)的研究与筛选还很不够，繁育方法还很传统。因此，通过植物组培快繁技术手段，培育出符合药典要求的优良吴茱萸品种，确保品种的纯正和统一性具有十分现实的经济意义。

在吴茱萸的繁殖方法方面，进行了种子播种繁殖、分株、根插、扦插等研究，但吴茱萸种子发芽率低，分株、根插、扦插等繁殖率低、成活率低、发根少、生根慢。难以满足生产上对优质种苗的要求。

在吴茱萸的组织培养方面，卢萍(1989)进行了吴茱萸的愈伤组织诱导与植株再生的研究，虽然叶的愈伤组织诱导率达到100％，但植株分化率极低(2.6％)，且组培苗生根亦难。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种吴茱萸组培快繁方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：这种吴茱萸组培快繁方法，按如下步骤进行：

1)、选种：组培材料应在4～5年生雌性吴茱萸优良品系健壮母株上选取1～2年生的枝条，作为插穗；

2)、材料培育：将插穗扦插于含泥炭、珍珠岩和蛭石混合基质的盆钵中，再放在温室中进行肥水、防病虫害管理，经1～2个月培育枝条萌发出嫩枝；

3)、外植体的选取与灭菌：取长约5～10cm的新萌发的嫩枝，剪去叶片，切成长约1.5cm的带顶芽的茎段或带腋芽的茎段作为外植体，经灭菌处理后备用；

4)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：选用WPM培养基或MS培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

(2)诱导培养基：WPM+BA 0.5～5.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或WPM+BA 0.5～5.0mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.5～5.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.5～5.0mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(3)增殖培养基：WPM+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+NAA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或WPM+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+IBA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+NAA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+IBA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(4)生根培养基：1/2WPM+IBA0.1～1.0mg/L+蔗糖或白糖20g/L；或1/2WPM+NAA0.1～1.0mg/L+蔗糖或白糖20g/L；或1/2MS+IBA0.1～1.0mg/L+蔗糖或白糖20g/L；或1/2MS+NAA0.1～1.0mg/L+蔗糖或白糖20g/L；

5)、诱导培养：在无菌条件下将经表面灭菌后的外植体带顶芽的茎段或带腋芽的茎段的一端或二端切口变褐处切除后，顶芽和带腋芽茎段的芽向上接种在诱导培养基中，在培养条件下培养30～45天后，诱导顶芽和腋芽萌芽，然后分化丛芽；

6)、增殖培养：在无菌条件下将丛芽切成单株接入增殖培养基中进行增殖培养，在培养条件下培养30～45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼苗再增殖培养；

7)、生根培养：将培养的丛生苗切成单株后，接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成约5～7cm、苗基部长出3～5根细根；

8)、移栽：将生根组培苗移栽于穴盘内的育苗袋中，培育1～2个月至成苗。

所述的吴茱萸组培快繁方法，所述的插穗长5～10cm(含1节)，插穗上端剪成平口，距离叶柄0.3～0.4cm，下端近节处削成马耳形斜面，用500mg/kg IBA溶液蘸下端切口1～2cm处，1s～2s后，取出晾15～30min。

所述的吴茱萸组培快繁方法，所述的材料培育时枝条扦插的混合基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶2∶2配制而成。

所述的吴茱萸组培快繁方法，所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：选用WPM培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

(2)诱导培养基：WPM+BA 2.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(3)增殖培养基：WPM+BA 1.0mg/L++KT1.0+NAA 0.1mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(4)生根培养基：1/2WPM+IBA0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L。

所述的吴茱萸组培快繁方法，所述的灭菌处理是整理好的外植体进行预处理，用加1％中性洗洁精的溶液浸泡并振荡10～30min，自来水冲洗30～60min；预处理后的外植体用75％酒精表面消毒30～45s，无菌水冲洗3遍；然后用0.1％升汞溶液浸泡振荡灭菌10～15min，无菌水洗3～5遍。

所述的吴茱萸组培快繁方法，所述的各组培阶段的培养条件是，培养温度为25～28℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为12h/d。

所述的吴茱萸组培快繁方法，所述的组培苗移栽基质采用育苗袋。

本发明的有益效果是：

1)、引进现代植物组织培养技术，生产药用植物种苗，具有不受地区、季节与气候限制，便于工厂化生产等优势。选择野生资源吴茱萸的优良株进行组织培养繁殖，实现吴茱萸雌雄株种苗分别繁殖，合理搭配，可以提高药材的产量和质量。

2)、提出的吴茱萸组培优化培养基针对性强、适用性好，克服了组培苗玻璃化严重的问题，原始外植体诱导率80％；组培苗培增殖率每周期(约45天)2～3倍；组培苗生根率达90％以上；组培苗移栽成活率达90％以上；种苗的大田定植成活率达到95％以上，年组培苗生产能力可达100万苗以上(一年为8个培养周期)，适于大规模工厂化生产。

3)、引进现代的穴盘苗生产技术，具有省工、省力、效率高、集中育苗、能源土地利用率高，适宜远距离运输和移栽成活率、大田定植成活率高等优点。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

(2)诱导培养基：WPM+BA0.5～5.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或WPM+BA 0.5～5.0mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.5～5.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.5～5.0mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(3)增殖培养基：WPM+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+NAA0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或WPM+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+IBA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+NAA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+IBA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于：所述的插穗长5～10cm(含1节)，插穗上端剪成平口，距离叶柄0.3～0.4cm，下端近节处削成马耳形斜面，用500mg/kg IBA溶液蘸下端切口1～2cm处，1s～2s后，取出晾15～30min。

所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于：所述的材料培育时枝条扦插的混合基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶2∶2配制而成。

所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于：所述的灭菌处理是整理好的外植体进行预处理，用加1％中性洗洁精的溶液浸泡并振荡10～30min，自来水冲洗30～60min；预处理后的外植体用75％酒精表面消毒30～45s，无菌水冲洗3遍；然后用0.1％升汞溶液浸泡振荡灭菌10～15min，无菌水洗3～5遍。

所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于，所述的各组培阶段的培养条件是，培养温度为25～28℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为12h/d。

所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于：所述的组培苗移栽基质采用育苗袋。

实施例2：

本例中，基本培养基：选用WPM培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；诱导培养基：WPM+BA 0.5～5.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；增殖培养基：WPM+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+NAA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；生根培养基：1/2WPM+IBA0.1～1.0mg/L+蔗糖或白糖20g/L。

其余步骤，条件均同于实施例1。

实施例3：

本例中，基本培养基：选用WPM培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；诱导培养基：WPM+BA 0.5～5.0mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；增殖培养基：WPM+BA0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+IBA0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；生根培养基：1/2WPM+NAA0.1～1.0mg/L+蔗糖或白糖20g/L。

其余步骤，条件均同于实施例1。

实施例4：

本例中，基本培养基：选用MS培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；诱导培养基：MS+BA 0.5～5.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；增殖培养基：MS+BA0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+NAA0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；生根培养基：1/2MS+IBA0.1～1.0mg/L+蔗糖或白糖20g/L。

其余步骤，条件均同于实施例1。

实施例5：

本例中，基本培养基：选用MS培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；诱导培养基：MS+BA 0.5～5.0mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；增殖培养基：MS+BA 0.1～3.0mg/L+KT0.0～2.0+IBA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；生根培养基：1/2MS+NAA0.1～1.0mg/L+蔗糖或白糖20g/L。

其余步骤，条件均同于实施例1。

实施例6：

本例中，基本培养基：选用WPM培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；诱导培养基：WPM+BA 2.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖或白糖30g/L；增殖培养基：WPM+BA1.0mg/L+KT1.0+NAA 0.1mg/L+蔗糖或白糖30g/L；生根培养基：1/2WPM+IBA0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L。

其余步骤，条件均同于实施例1。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims

1.一种吴茱萸组培快繁方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：

2)、材料培育：将插穗扦插于混合基质中，再放在温室中进行肥水、防病虫害管理，经1～2个月培育枝条萌发出嫩枝；所述的混合基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶2∶2配制而成；

3)、外植体的选取与灭菌：取长5～10cm的新萌发的嫩枝，剪去叶片，切成长1.5cm的带顶芽的茎段或带腋芽的茎段作为外植体，经灭菌处理后备用；

(2)诱导培养基：WPM+BA0.5～5.0mg/L+NAA0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或WPM+BA 0.5～5.0mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.5～5.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.5～5.0mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(3)增殖培养基：WPM+BA0.1～3.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或WPM+BA 0.1～3.0mg/L+IBA 0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA 0.1～3.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；或MS+BA0.1～3.0mg/L+IBA0.01～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

5)、诱导培养：在无菌条件下将经表面灭菌后的外植体带顶芽的茎段或带腋芽的茎段，切除其一端或二端切口变褐处后，顶芽和带腋芽茎段的芽向上接种在诱导培养基中，在培养条件下培养30～45天后，诱导顶芽和腋芽萌芽，然后分化丛芽；

7)、生根培养：将培养的丛生苗切成单株后，接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成5～7cm、苗基部长出3～5根细根；

2.根据权利要求1所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于：所述的插穗长5～10cm，插穗上端剪成平口，距离叶柄0.3～0.4cm，下端近节处削成马耳形斜面，用500mg/kg IBA溶液蘸下端切口1～2cm处，1秒～2秒后，取出晾15～30分钟。

3.根据权利要求1所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于：所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(2)诱导培养基：WPM+BA2.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖或白糖30g/L；

(3)生根培养基：1/2WPM+IBA0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L。

4.根据权利要求1所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于：所述的灭菌处理是整理好的外植体进行预处理，用加了重量比为1％中性洗洁精的溶液浸泡并振荡10～30分钟，自来水冲洗30～60分钟；预处理后的外植体用75％酒精表面消毒30～45秒，无菌水冲洗3遍；然后用0.1％升汞溶液浸泡振荡灭菌10～15分钟，无菌水洗3～5遍。

5.根据权利要求1所述的吴茱萸组培快繁方法，其特征在于，所述的各组培阶段的培养条件是，培养温度为25～28℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为12h/d。