CN102823502A - 毛葡萄离体快速繁殖培养方法 - Google Patents

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刘伟
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本发明公开了一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法,包括以下步骤,无菌系的建立、不定芽诱导、生根培养及炼苗移栽。本发明采用植物组织培养技术成功实现毛葡萄离体快速繁殖,使毛葡萄无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%以上,繁殖系数达17.0-20.2,生根率达93%以上,炼苗成活率可达100%,解决毛葡萄种苗繁殖率低下的问题,为生产提供大量的优质毛葡萄种苗;本发明方法简单,成本低廉,使用效果好,产业化应用前景广阔。

Description

毛葡萄离体快速繁殖培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及农业科学领域,尤其是一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法。
背景技术
[0002] 毛葡萄(Kids heyneana Roem. & Schult.)又名绒毛葡萄、五角叶葡萄,在我国华中、华东、西南、华南北部、西北的陕、甘及华北的山西均有分布,是分布最为广泛的野生葡萄种类之一。毛葡萄抗性强、适应性好,既是葡萄嫁接栽培的优良抗性砧木,也是我国野生葡萄红酒的优质原料。随着野生毛葡萄酒消费量的增加和西南地区石漠化生态治理的需要,生产上对毛葡萄种苗的需求量巨大。毛葡萄实生繁殖后代优良性状易发生分离,扦插繁殖生根困难,繁殖率低下。研究者虽然采用组织培养技术进行毛葡萄离体培养,但因培养基和培养方法不适宜,繁殖系数均在4. 5以下,不能满足产业化需求。
发明内容
[0003] 本发明的目的是:提供一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法,它解决毛葡萄种苗繁殖率低下的问题,为生产提供大量的优质毛葡萄种苗,以满足农业生产需要。
[0004] 本发明是这样实现的:毛葡萄离体快速繁殖培养方法,包括以下步骤,
步骤一、无菌系的建立:在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体,用自来水冲洗干净,在超净工作台上,先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s,再用无菌水冲洗3次后,用质量百分比为0. 1%的升汞溶液(即相当于Ig氯化汞溶解在I升水中)浸泡消毒8-lOmin后,用无菌水冲洗5-6次,然后剪除新梢两端褐化部分后,剪成单芽茎段,接种到MS培养基中,在温度为25±1°C,光照强度为40umol • s_1 • nT2,光照时间为12h/d的培养条件下,培养诱导至腋芽萌发,获得腋芽萌发产生的带芽茎段;
步骤二、腋芽增殖:取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段,芽眼向上接种到MS培养基上,在温度为25±1°C,光照强度为40umol • s—1 • m_2,光照时间为12h/d的条件下培养30d,腋芽增殖产生大量丛生不定芽;
步骤三、生根培养:取步骤二中产生的不定芽,将其接种到1/2MS生根培养基中,先光下培养7d,再暗培养7d后,然后转入光下继续培养至正常生根,获得试管苗;培养温度为25±1°C,光照强度为40umol • s_1 • nT2,光照时间为12h/d ;
步骤四、炼苗移栽:选取步骤三中生有3-4条根,长为4-5cm的试管苗,在102. Sumol -S-1 .m-2的光照条件下炼苗7d,然后从培养瓶中取出试管苗,洗净试管苗根部培养基,用质量百分比为0. 1% KMnO4溶液浸根10s,再移栽到灭菌的珍珠岩基质中,用1/8MS营养液浇透,之后每隔7d浇灌I次营养液,并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌I次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液,加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度,置于温度为25土 1°C的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中,置于温室内炼苗30d,最后定植到大田即可。
[0005] 步骤一中采用的MS培养基为国际通用的培养基,并在该MS培养基中每升添加2. Omg的6-苄基嘌呤,0. 2mg的吲哚乙酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,其pH值为5. 8-6. O。
[0006] 步骤二中采用的MS培养基为国际通用的培养基,并在该MS培养基中每升添加
2. 0-3. Omg的6-苄基嘌呤,0. 01-0. 07mg的吲哚丁酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,pH5. 8-6. O。
[0007] 步骤三中采用的1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半,其它元素不变,并在该MS培养基中每升添加0. 05-0. 5g吲哚丁酸,0-0. 20g吲哚乙酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,pH5. 8-6. O。
[0008] 步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8,其它元素不变,并在该MS培养基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸。
[0009] 由于采用上述的技术方案,与现有技术相比,本发明采用植物组织培养技术,对腋芽萌发产生的带芽茎段进行组培,并配置适合的培养基,使毛葡萄无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%以上,繁殖系数达17. 0-20. 2,生根率达93%以上,炼苗成活率可达100%,解决毛 葡萄种苗繁殖率低下的问题,为生产提供大量的优质毛葡萄种苗;本发明方法简单,成本低廉,使用效果好,产业化应用前景广阔。
[0010] 本发明的实施例I :毛葡萄离体快速繁殖培养方法,包括以下步骤,
步骤一、无菌系的建立:在生长季节选取生长健壮的毛葡萄“花溪-9”新梢为外植体,在自来水下冲洗干净后,先在体积百分比70%的酒精中浸泡30s,无菌水冲洗3次,再用质量百分比为0. 1%升汞溶液浸泡消毒8min,无菌水冲洗5次,剪成单芽茎段,接种到MS培养基上(每升MS培养基附加2. Omg的6-苄基嘌呤,0. 2mg的吲哚乙酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,PH5. 8-6. 0),MS培养基的温度为25土1°C,光照强度为40umol • s-1 • m_2,光照时间为12h/d ;培养诱导至腋芽萌发,获得腋芽萌发产生的带芽茎段;
步骤二、腋芽增殖:取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段,芽眼向上接种到MS培养基上(每升培养基添加2.0-3. 0 mg的6-苄基嘌呤,0. 01-0. 07 mg的吲哚丁酸,20 g蔗糖和5g琼脂粉,pH5. 8-6. 0),在温度为25±1°C,光照强度为40umol .s—1 .nT2,光照时间为12h/d的条件下培养30d,腋芽增殖产生大量丛生不定芽,无菌单芽茎段腋芽增殖率达100%,繁殖系数达17. 0 ;
步骤三、生根培养:取步骤二中产生的不定芽,将其接种到1/2MS生根培养基中(1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半,其它元素不变,并在该MS培养基中每升添加
0. 08-0. 5g吲哚丁酸,0-0. 20g吲哚乙酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,pH5. 8-6. 0),先光下培养7d,再暗培养7d后,然后转入光下继续培养至正常生根,获得试管苗;培养温度为25 ± I °C,光照强度为40umol • S-1 • nT2,光照时间为12h/d ;30d后生根率可达93. 7% ;
步骤四、炼苗移栽:选取步骤三中生有3-4条根,长为4-5cm的试管苗,在102. Sumol -S-1 .m-2的光照条件下炼苗7d,然后从培养瓶中取出试管苗,洗净试管苗根部培养基,用质量百分比为0. 1% KMnO4溶液浸根10s,再移栽到灭菌的珍珠岩基质中,用1/8MS营养液(1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8,其它元素不变,并在该MS培养基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸)浇透,之后每隔7d浇灌I次营养液,并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌I次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液,加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度,置于温度为25土TC的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中,置于温室内炼苗30d,最后定植到大田,成活率100%。
[0011] 本发明的实施例2 :毛葡萄离体快速繁殖培养方法,包括以下步骤,步骤一、无菌系的建立:在生长季节选取生长健壮的毛葡萄“农院-11”新梢为外植体,在自来水下冲洗干净后,先在体积百分比70%的酒精中浸泡30s,无菌水冲洗3次,再用质量百分比为0. 1%升汞溶液浸泡消毒8min,无菌水冲洗5次,剪成单芽茎段,接种到MS培养基上(每升MS培养基附加2. Omg的6-苄基嘌呤,0. 2mg的吲哚乙酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,PH5. 8-6. 0),MS培养基的温度为25土1°C,光照强度为40umol • s-1 • m_2,光照时间为12h/d ;培养诱导至腋芽萌发,获得腋芽萌发产生的带芽茎段;
步骤二、腋芽增殖:取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段,芽眼向上接种到MS培养基上(每升培养基添加2. 0-3. Omg的6-苄基嘌呤,0. 01-0. 07mg的吲哚丁酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,pH5. 8-6. 0),在温度为25± 1°C,光照强度为40umol • s-1 • m_2,光照时间为12h/d的条件下培养30d,腋芽增殖产生大量丛生不定芽,无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%,繁殖系数达20. 2 ;
步骤三、生根培养:取步骤二中产生的不定芽,将其接种到1/2MS生根培养基中(1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半,其它元素不变,并在该MS培养基中每升添加
0. 08-0. 5g吲哚丁酸,0-0. 20 g吲哚乙酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,pH5. 8-6. 0),先光下培养7d,再暗培养7d后,然后转入光下继续培养至正常生根,获得试管苗;培养温度为25 ± I °C,光照强度为40umol • S-1 • nT2,光照时间为12h/d ;30d后生根率可达100% ;
步骤四、炼苗移栽:选取步骤三中生有3-4条根,长为4-5cm的试管苗,在102. Sumol -S-1 .m-2的光照条件下炼苗7d,然后从培养瓶中取出试管苗,洗净试管苗根部培养基,用质量百分比为0. 1% KMnO4溶液浸根10s,再移栽到灭菌的珍珠岩基质中,用1/8MS营养液(1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8,其它元素不变,并在该MS培养基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸)浇透,之后每隔7d浇灌I次营养液,并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌I次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液,加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度,置于温度为25土TC的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中,置于温室内炼苗30d,最后定植到大田,成活率100%。
[0012] 花溪-9及农院-11均是从野外收集的贵州野生毛葡萄优良单株,与栽培葡萄品种相比,果粒小,含糖量较低、含酸量较高,风味独特,抗病性及抗旱性强,既可作为酿酒葡萄栽培,也可作为抗性砧木利用。

Claims (5)

1. 一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法,其特征在于:包括以下步骤, 步骤一、无菌系的建立:在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体,用自来水冲洗干净,在超净工作台上,先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s,再用无菌水冲洗3次后,用质量百分比为O. 1%的升汞溶液浸泡消毒8-lOmin后,用无菌水冲洗5-6次,然后剪除新梢两端褐化部分后,剪成单芽茎段,接种到MS培养基中,在温度为25土 1°C,光照强度为40umol · s—1 · m_2,光照时间为12h/d的培养条件下,培养诱导至腋芽萌发,获得腋芽萌发产生的带芽茎段; 步骤二、腋芽增殖:取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段,芽眼向上接种到MS培养基上,在温度为25± 1°C,光照强度为40umol · s—1 · m_2,光照时间为12h/d的条件下培养30d,腋芽增殖产生大量丛生不定芽; 步骤三、生根培养:取步骤二中产生的不定芽,将其接种到1/2MS生根培养基中,先光 下培养7d,再暗培养7d后,然后转入光下继续培养至正常生根,获得试管苗;培养温度为25±1°C,光照强度为40umol · s_1 · πΓ2,光照时间为12h/d ; 步骤四、炼苗移栽:选取步骤三中生有3-4条根,长为4-5cm的试管苗,在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照条件下炼苗7d,然后从培养瓶中取出试管苗,洗净试管苗根部培养基,用质量百分比为O. 1% KMnO4溶液浸根10s,再移栽到灭菌的珍珠岩基质中,用1/8MS营养液浇透,之后每隔7d浇灌I次营养液,并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌I次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液,加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度,置于温度为25土 1°C的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中,置于温室内炼苗30d,最后定植到大田即可。
2.根据权利要求I所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法,其特征在于:步骤一中采用的MS培养基为国际通用的培养基,并在该MS培养基中每升添加2. Omg的6-苄基嘌呤,O. 2mg的吲哚乙酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,其pH值为5. 8-6. O。
3.根据权利要求I所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法,其特征在于:步骤二中采用的MS培养基为国际通用的培养基,并在该MS培养基中每升添加2. 0-3. Omg的6-苄基嘌呤,O. 01-0. 07mg的吲哚丁酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,pH5. 8-6. O。
4.根据权利要求I所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法,其特征在于:步骤三中采用的1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半,其它元素不变,并在该MS培养基中每升添加O. 05-0. 5g吲哚丁酸,0-0. 20g吲哚乙酸,20g蔗糖和5g琼脂粉,ρΗ5· 8-6. O。
5.根据权利要求I所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法,其特征在于:步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8,其它元素不变,并在该MS培养基中每升添加O. 05mg Π引哚乙酸。
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