CN102823502A - 毛葡萄离体快速繁殖培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法，包括以下步骤，无菌系的建立、不定芽诱导、生根培养及炼苗移栽。本发明采用植物组织培养技术成功实现毛葡萄离体快速繁殖，使毛葡萄无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%以上，繁殖系数达17.0-20.2，生根率达93%以上，炼苗成活率可达100%，解决毛葡萄种苗繁殖率低下的问题，为生产提供大量的优质毛葡萄种苗；本发明方法简单，成本低廉，使用效果好，产业化应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及农业科学领域，尤其是一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法。
背景技术
毛葡萄（Vitis heyneana Roem. & Schult.）又名绒毛葡萄、五角叶葡萄，在我国华中、华东、西南、华南北部、西北的陕、甘及华北的山西均有分布，是分布最为广泛的野生葡萄种类之一。毛葡萄抗性强、适应性好，既是葡萄嫁接栽培的优良抗性砧木，也是我国野生葡萄红酒的优质原料。随着野生毛葡萄酒消费量的增加和西南地区石漠化生态治理的需要，生产上对毛葡萄种苗的需求量巨大。毛葡萄实生繁殖后代优良性状易发生分离，扦插繁殖生根困难，繁殖率低下。研究者虽然采用组织培养技术进行毛葡萄离体培养，但因培养基和培养方法不适宜，繁殖系数均在4.5以下，不能满足产业化需求。
发明内容
本发明的目的是：提供一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法，它解决毛葡萄种苗繁殖率低下的问题，为生产提供大量的优质毛葡萄种苗，以满足农业生产需要。
本发明是这样实现的：毛葡萄离体快速繁殖培养方法，包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s，再用无菌水冲洗3次后，用质量百分比为0.1%的升汞溶液（即相当于1g氯化汞溶解在1升水中）浸泡消毒8-10min后，用无菌水冲洗5-6次，然后剪除新梢两端褐化部分后，剪成单芽茎段，接种到MS培养基中，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的培养条件下，培养诱导至腋芽萌发，获得腋芽萌发产生的带芽茎段；
步骤二、腋芽增殖：取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段，芽眼向上接种到MS培养基上，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的条件下培养30d，腋芽增殖产生大量丛生不定芽；
步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中，先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；
步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102.8umol·s-1·m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田即可。
步骤一中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加2.0mg 的6-苄基嘌呤，0.2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，其pH值为5.8-6.0。
步骤二中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加2.0-3.0mg 的6-苄基嘌呤，0.01-0.07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0。
步骤三中采用的1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05-0.5g吲哚丁酸，0-0.20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0。
步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05mg吲哚乙酸。
由于采用上述的技术方案，与现有技术相比，本发明采用植物组织培养技术，对腋芽萌发产生的带芽茎段进行组培，并配置适合的培养基，使毛葡萄无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%以上，繁殖系数达17.0-20.2，生根率达93%以上，炼苗成活率可达100%，解决毛葡萄种苗繁殖率低下的问题，为生产提供大量的优质毛葡萄种苗；本发明方法简单，成本低廉，使用效果好，产业化应用前景广阔。
本发明的实施例1：毛葡萄离体快速繁殖培养方法，包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄“花溪-9”新梢为外植体，在自来水下冲洗干净后，先在体积百分比70%的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比为0.1%升汞溶液浸泡消毒8min，无菌水冲洗5次，剪成单芽茎段，接种到MS培养基上（每升MS培养基附加2.0mg 的6-苄基嘌呤，0.2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0），MS培养基的温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；培养诱导至腋芽萌发，获得腋芽萌发产生的带芽茎段；
步骤二、腋芽增殖：取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段，芽眼向上接种到MS培养基上(每升培养基添加2.0-3.0 mg 的6-苄基嘌呤，0.01-0.07 mg的吲哚丁酸，20 g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0)，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的条件下培养30d，腋芽增殖产生大量丛生不定芽，无菌单芽茎段腋芽增殖率达100%，繁殖系数达17.0；
步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中（1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.08-0.5g吲哚丁酸，0-0.20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0），先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；30d后生根率可达93.7%；
步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102.8umol·s-1·m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液（1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05mg吲哚乙酸）浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田，成活率100%。
本发明的实施例2：毛葡萄离体快速繁殖培养方法，包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄“农院-11”新梢为外植体，在自来水下冲洗干净后，先在体积百分比70%的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比为0.1%升汞溶液浸泡消毒8min，无菌水冲洗5次，剪成单芽茎段，接种到MS培养基上（每升MS培养基附加2.0mg 的6-苄基嘌呤，0.2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0），MS培养基的温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；培养诱导至腋芽萌发，获得腋芽萌发产生的带芽茎段；
步骤二、腋芽增殖：取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段，芽眼向上接种到MS培养基上(每升培养基添加2.0-3.0mg 的6-苄基嘌呤，0.01-0.07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0)，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的条件下培养30d，腋芽增殖产生大量丛生不定芽，无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%，繁殖系数达20.2；
步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中（1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.08-0.5g吲哚丁酸，0-0.20 g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0），先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；30d后生根率可达100%；
步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102.8umol·s-1·m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液（1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05mg吲哚乙酸）浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田，成活率100%。
花溪-9及农院-11均是从野外收集的贵州野生毛葡萄优良单株，与栽培葡萄品种相比，果粒小，含糖量较低、含酸量较高，风味独特，抗病性及抗旱性强，既可作为酿酒葡萄栽培，也可作为抗性砧木利用。
Claims (5)
1.一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s，再用无菌水冲洗3次后，用质量百分比为0.1%的升汞溶液浸泡消毒8-10min后，用无菌水冲洗5-6次，然后剪除新梢两端褐化部分后，剪成单芽茎段，接种到MS培养基中，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的培养条件下，培养诱导至腋芽萌发，获得腋芽萌发产生的带芽茎段；
步骤二、腋芽增殖：取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段，芽眼向上接种到MS培养基上，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的条件下培养30d，腋芽增殖产生大量丛生不定芽；
步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中，先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；
步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102.8umol·s-1·m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田即可。
2.根据权利要求1所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于：步骤一中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加2.0mg 的6-苄基嘌呤，0.2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，其pH值为5.8-6.0。
3.根据权利要求1所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于：步骤二中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加2.0-3.0mg 的6-苄基嘌呤，0.01-0.07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0。
4.根据权利要求1所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于：步骤三中采用的1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05-0.5g吲哚丁酸，0-0.20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0。
5.根据权利要求1所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于：步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05mg吲哚乙酸。
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