CN104542298A - 一种葡萄组织的再生培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄茎段外植体离体再生的组织培养方法，该方法通过选取合适的葡萄茎段外植体、对葡萄茎段外植体消毒、接种、葡萄茎段外植体离体再生体系建立、葡萄试管苗增殖培养、葡萄试管苗生根培养，实现对葡萄组织的再生培养。方法与以往类似研究相比，具有不定芽再生率高、褐化率低、增殖系数达到5.6、生根率达到98.7％。将发明应用于葡萄离体快繁中，可大大大降低繁殖成，还可为诸如葡萄生物技术育种及分子育种等葡萄育种相关研究提供便利。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体地指一种葡萄组织的再生培养方法。
背景技术
葡萄(Vitis vinifera L.)，系葡萄属落叶藤本植物，是世界最古老的植物之一。其适应性强、用途广，既可满足人们鲜食、加工、制酒、制汁、制干、制罐等物质需求，又具有独特的园艺、文化价值。其中，红地球葡萄具有粒大、耐储藏、果肉硬脆甜等特性，。
尽管葡萄是一种容易扦插成活的果树，常规扦插繁殖对于常规品种具有经济有效的特性。但对于一些传统优良品种，苗木需求量大，利用组织培养技术可以有效降低繁殖成本。同时，组织培养技术在葡萄无核品种培育、多倍体育种、抗病育种、葡萄无病毒苗木培养等品种改良方面具有重要意义。
当前的培养技术相对比较繁琐，操作时间相对长一些，而且很多技术芽增殖培养中使用了植物生长素类物质，成本也相对较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡萄的组织再生培养方法，该方法具有再生频率高、增殖倍数高、褐化率低、无菌苗玻璃化程度低等优点。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种葡萄组织的再生培养方法，其步骤为：
1)选取一周内未被打湿的葡萄地栽苗，带腋芽当年生幼嫩枝条，去除叶片，剪为4-6厘米长，清水冲洗2小时后作为外植体备用；
2)将清洗干净的外植体用浓度为75％的酒精浸泡1分钟、浓度为0.1％升汞溶液浸泡8分钟，浸泡期间不断摇动，每次浸泡消毒后用无菌水冲洗3-5遍；
3)外植体用无菌滤纸将外植体表面水分吸干，用无菌镊子小心夹住，用无菌刀片将茎段两端接触消毒液的表面切掉，切成1厘米长左右的茎段，接入灭过菌的不定芽诱导固体培养基中；
4)外植体经过5-9天的暗培养，转移到光照强度为1800-2000勒克斯，温度为25±1℃下培养16小时；
5)接入不定芽诱导固体培养基培养15天后，将再生不定芽从茎段切下，转接入增殖培养基中进行继代增殖培养；
6)增殖培养30天后，将不定芽增殖生长形成的丛芽切下，转接入生根培养基中，进行生根培养，获得健壮的组培生根苗。
所述的葡萄的组织再生培养方法，其中步骤1)中：采集幼嫩的茎段时，保证被采集茎段一周内未被雨水打湿，在晴天的上午，选取带腋芽当年生幼嫩枝条，去除叶片，清水冲洗2h后作为外植体备用。
所述的葡萄的组织再生培养方法，其中步骤2)中：在超净工作台上操作，将清洗干净的外植体分别用酒精和升汞溶液浸泡消毒，其中，酒精浓度为75％，浸泡时间为1min，升汞溶液的浓度为0.1％，浸泡时间为8min，浸泡消毒期间不断摇动，每次用无菌水冲洗3-5 次。
所述的葡萄的组织再生培养方法，其中步骤3)中：经过消毒处理过的外植体用无菌滤纸将外植体表面水分吸干，用无菌镊子小心夹住，用无菌刀片将茎段两端接触消毒液的表面切掉，接入灭过菌的不定芽诱导固体培养基中；所述的不定芽诱导初代培养基的配方为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.5mg/L IBA，2.0g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；
所述的葡萄的组织再生培养方法，其中步骤4)中：不定芽诱导先进行一段时间暗培养，培养时间为7d，暗培养结束后转移到光照下培养，培养温度为25±1℃，光照时间为16h，光强2000Lx，茎段外植体从暗培养转到光照培养2-3d后，腋芽开始萌动，呈嫩绿色或白绿色且茎段基部膨大，接入培养基15d后，腋芽萌发为再生不定芽，并进一步生长成幼嫩植株的上半部分。
所述的葡萄的组织再生培养方法，其中步骤5)中：茎段再生不定芽经过一段时间培养后，高度大约长到2cm左右，培养时间为15d，将再生不定芽从茎段上切离下来，接种到培养殖培养中，所述的增殖培养基的配方为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.1mg/L IBA，3.0mg/L Ad，2.0g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；
所述的葡萄的组织再生培养方法，其中步骤6)中：在增殖培养基中培养30d，基部增殖出丛芽，将长度超过2.5cm的嫩枝从芽丛上 分离，接入生根培养基；所述的生根培养基的配方为：：MS基本培养基，1.0mg/L IBA，0.5mg/L AC，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和积极效果：
采用本发明的组织培养方法得到的葡萄组培苗不定芽再生率高、褐化率低、增殖系数达到5.6、生根率达到98.7％，得到的再生苗生长健壮，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明的一个实施例茎段外植体接种当天示意图。
图2为本发明的一个实施例茎段外植体再生苗继代增殖示意图。
图3为本发明的一个实施例茎段外植体再生苗生根示意图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：
1)4-5月间从葡萄的地栽苗中选取带腋芽当年生幼嫩枝条，去除叶片，剪为5厘米长左右，清水冲洗2小时后作为外植体备用；
2)将清洗干净的外植体材料转移至超净工作台上，以腋芽为单位切为1厘米长左右的茎段，并将切好的茎段外植体用75％浸泡消毒1分钟，用0.1％升汞溶液浸泡消毒8分钟，每次浸泡消毒后用无菌水 冲洗3-5遍，浸泡消毒期间不断摇动，倒掉升汞溶液用无菌水冲洗3-5次。
3)外植体消毒后用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子小心夹住，用无菌刀片将茎段两端接触消毒液的表面切掉，接入无菌的不定芽诱导固体培养基中；不定芽诱导培养基的配方为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.5mg/L IBA，2.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0；
4)暗培养7d后转到光照培养条件下,培养温度为25℃，光照时间为16小时，光强1800Lx，茎段外植体从暗培养转到光照培养2-3天后，腋芽开始萌动，呈嫩绿色或白绿色且茎段基部膨大，接入培养基15天后，腋芽萌发为再生不定芽，并进一步生长成幼嫩植株的上半部分。
5)茎段再生不定芽培养15天后，高度大约长到2厘米左右，将再生不定芽从茎段上切离下来，接种到培养殖培养中，增殖培养基的配方为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.1mg/L IBA，3.00mg/L腺嘌呤，2.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0；
6)增殖培养30天后，将不定芽增殖生长形成的丛芽切下，转接入生根培养基培养中，进行生根培养，60天后获得健壮的组培生根苗，生根培养基配方为：MS基本培养基，1.0mg/L IBA，0.5mg/L AC，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0。
实施例2：
1)4-5月间从葡萄的地栽苗中选取带腋芽当年生幼嫩枝条，去 除叶片，剪为5厘米长左右，清水冲洗2小时后作为外植体备用；
2)将清洗干净的外植体材料转移至超净工作台上，以腋芽为单位切为1厘米长左右的茎段，并将切好的茎段外植体用70％浸泡消毒30秒，用0.1％升汞溶液浸泡消毒10分钟，每次浸泡消毒后用无菌水冲洗3-5遍，浸泡消毒期间不断摇动，倒掉升汞溶液用无菌水冲洗3-5次。
3)外植体消毒后用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子小心夹住，用无菌刀片将茎段两端接触消毒液的表面切掉，接入无菌的不定芽诱导固体培养基中；不定芽诱导培养基的配方为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.5mg/L IBA，2.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0；
4)暗培养5天后转到光照培养条件下,培养温度为25℃，光照时间为16小时，光强2000Lx，茎段外植体从暗培养转到光照培养2-3天后，腋芽开始萌动，呈嫩绿色或白绿色且茎段基部膨大，接入培养基15天后，腋芽萌发为再生不定芽，并进一步生长成幼嫩植株的上半部分。
5)茎段再生不定芽培养15天后，高度大约长到2厘米左右，将再生不定芽从茎段上切离下来，接种到培养殖培养中，增殖培养基的配方为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.1mg/L IBA，3.00mg/L腺嘌呤，2.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0；
6)增殖培养30天后，将不定芽增殖生长形成的丛芽切下，转接入生根培养基培养中，进行生根培养，60天后获得健壮的组培生根 苗，生根培养基配方为：MS基本培养基，1.0mg/L IBA，0.5mg/L AC，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0。
实施例3：
1)4-5月间从葡萄的地栽苗中选取带腋芽当年生幼嫩枝条，去除叶片，剪为5厘米长左右，清水冲洗2小时后作为外植体备用；
2)将清洗干净的外植体材料转移至超净工作台上，以腋芽为单位切为1厘米长左右的茎段，并将切好的茎段外植体用75％浸泡消毒1分钟，用0.2％升汞溶液浸泡消毒8分钟，每次浸泡消毒后用无菌水冲洗3-5遍，浸泡消毒期间不断摇动，倒掉升汞溶液用无菌水冲洗3-5次。
3)外植体消毒后用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子小心夹住，用无菌刀片将茎段两端接触消毒液的表面切掉，接入无菌的不定芽诱导固体培养基中；不定芽诱导培养基的配方为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.5mg/L IBA，2.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0；
4)暗培养9天后转到光照培养条件下,培养温度为25℃，光照时间为16小时，光强1800Lx，茎段外植体从暗培养转到光照培养2-3天后，腋芽开始萌动，呈嫩绿色或白绿色且茎段基部膨大，接入培养基15天后，腋芽萌发为再生不定芽，并进一步生长成幼嫩植株的上半部分。
5)茎段再生不定芽培养15天后，高度大约长到2厘米左右，将再生不定芽从茎段上切离下来，接种到培养殖培养中，增殖培养基的 配方为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.1mg/L IBA，3.00mg/L腺嘌呤，2.00g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0；
6)增殖培养30d后，将不定芽增殖生长形成的丛芽切下，转接入生根培养基培养中，进行生根培养，60天后获得健壮的组培生根苗，生根培养基配方为：MS基本培养基，1.0mg/L IBA，0.5mg/L AC，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH:6.0。
采用上述实施例的组织培养方法得到的葡萄组培苗不定芽再生率高、褐化率低、增殖系数达到5.6、生根率达到98.7％。
以下结合相应的试验数据对本发明作进一步说明。
茎段不定芽诱导培养：以MS为基本培养基，6-BA设置0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L 3个浓度梯度，IBA设置0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L 3个浓度梯度，附加2.0g/LVc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0，培养条件为25℃，先暗培养7天，后转到光照培养，光照强度为2000Lx。试验结果见表1。
表1不定芽诱导培养基中不同的激素配比
葡萄试管苗继代增殖培养：以MS为基本培养基，添加6-BA 1.0mg/L、IBA 0.1mg/L，Ad设置1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L 3个浓度梯度，附加30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0，培养条件为先暗培养7d，后转到光照培养。试验结果见表2。
表2不同浓度腺嘌呤对葡萄试管苗增殖的影响
葡萄试管苗生根培养：以MS为基本培养基，IBA设置0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L 6个浓度梯度，附加30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0，培养条件为先暗培养7天，后转到光照培养。试验结果见表3。
表3不同浓度IBA对葡萄试管苗生根的影响
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (2)
1.一种葡萄组织的再生培养方法，其步骤为：
1)从一周内未被打湿的葡萄地栽苗中选取带腋芽当年生幼嫩枝条，去除叶片，剪为4-6厘米长，清水冲洗2小时后作为外植体备用；
2)清洗干净的外植体用浓度为75％的酒精浸泡1分钟、浓度为0.1％的升汞溶液浸泡8分钟，浸泡期间不断摇动，每次浸泡消毒后用无菌水冲洗3-5遍；
3)用无菌滤纸将外植体表面水分吸干，用无菌镊子小心夹住，用无菌刀片将茎段两端接触消毒液的表面切掉，切成1厘米长左右的茎段，接入灭过菌的不定芽诱导固体培养基中；
4)外植体经过5-9天的暗培养，转移到温度为25±1℃，光照强度为1800-2000勒克斯下16小时；
5)接入不定芽诱导固体培养基培养15天后，将再生不定芽从茎段切下，转接入增殖培养基中进行继代增殖培养；
6)增殖培养30天后，将不定芽增殖生长形成的丛芽切下，转接入生根培养基中，进行生根培养，获得健壮的组培生根苗。
2.根据权利要求1所述的一种葡萄组织的再生培养方法，其特征在于：
所述的不定芽诱导固体培养基为：MS基本培养基，0.5-2.0mg/L6-BA，0.1-0.5mg/L IBA，2.0g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；
所述的继代增殖培养为：MS基本培养基，1.0mg/L 6-BA，0.1mg/LIBA，1.0-3.0mg/L Ad，2.0g/L Vc，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0；
所述的生根培养基为：MS基本培养基，0-1.0mg/L IBA，0.5mg/LAC，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，用蒸馏水定容至1L，灭菌前调节培养基的pH至6.0。2 -->
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150429 |