CN104855292A - 一种牛樟茎段组培快繁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛樟茎段组培快繁的方法，包括如下步骤：S1.诱导培养：将牛樟茎段外植体消毒后接种于诱导培养基中进行芽诱导培养；S2.增殖培养：依次接种于增殖培养基A和增殖培养基B上进行增殖培养；S3.壮苗培养；S4. 生根培养。本发明的方法有效解决了牛樟外植体在初代培养过程中易出现真菌、细菌污染的情况，减低污染率的同时保证出芽率。并且，本发明增殖培养基A的激素浓度稍高，诱导出丛芽；再接种于激素浓度较低的增殖培养基B中，减少叶片干枯死亡，分化出大量丛芽，月繁殖系数达到4~6倍，在繁殖过程中形态正常，完全适合大规模工业化生产，大大提高牛樟的繁育苗木效率。

Description

一种牛樟茎段组培快繁的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种牛樟茎段组培快繁的方法。

背景技术

牛樟（CinnamomumKanehirae Hay）隶属于樟科（Lauraceae）樟属(Cinnamomum)，又名黑樟，为中国台湾本土特有常绿阔叶树种。牛樟树干通直、树体高大及初生叶多变，具有良好的观赏价值，是一种极具发展潜力的景观树木。牛樟木材还具有特殊的香味，且不易腐朽、材质细致、纹理交错和刨削容易等特点，为著名的建筑、家具及雕刻工艺用材。牛樟全株均可提炼牛樟油。

牛樟树上寄生的真菌——牛樟芝，被称为“深林中的红宝石”，含有200多种三萜类化合物，对胃肠疼痛、癌症、糖尿病和酒精肝等有独特疗效，具有极高的科研和商业价值。如今牛樟芝价格飙升，市场供不应求。最新研究表明牛樟椴木可栽培出外观、香气、苦味和成分等能完全取代野生牛樟芝的樟芝，导致原本稀少的牛樟变得异常珍贵，牛樟需求量剧增，价格也随之飙升。

牛樟原本在中国南方分别较广，海拔200~2000公尺均有自然分布，但由于过去牛樟芝的采集导致牛樟已被过量采伐，现只在中国台湾的高山地区还有零星分布，且多为逾龄老树。牛樟花属黏质虫媒花，母树间授粉困难，且多开于树冠顶端，易遭风害，偶有种子形成在成熟前即遭鸟、兽食害，采种困难。在自然状态下，即使有成熟种子天然下种，也因林下光照不足，枯枝落叶过厚使种子不易着床发芽等原因，导致牛樟自然成苗困难。牛樟数量稀少，已列为保育类植物。快速而批量地繁殖濒危的牛樟树，供应市场需求，应当是林业工作的当务之急。

近年来，科研人员对牛樟的扦插育苗、嫁接育苗等无性繁殖方式进行了研究，但受季节和材料资源的限制，牛樟扦插苗成活率和出苗率较低，不能进行大规模的繁育。目前，已公布了以牛樟体胚为材料的牛樟体胚培养基及组培快繁方法（公开号 CN 101429489 A），但关于利用牛樟茎段组织为材料进行组培快繁的方法还未见报道。为满足牛樟的大量需求，适应大规模林业生产，拯救牛樟这种即将灭绝的的物种资源，成熟的牛樟茎段组培快繁技术具有极其重要的作用。

发明内容

针对牛樟物种濒危，目前已有的扦插和嫁接育苗技术不成熟，成活率低，不能进行大规模的繁育等问题，本发明提供了一种牛樟茎段组培快繁的方法。所述方法，能快速批量地繁殖牛樟，适应大规模林业生产，满足市场需求。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种牛樟茎段组培快繁的方法，包括如下步骤：

S1. 诱导培养：将牛樟茎段外植体消毒后接种于诱导培养基中进行芽诱导培养；

S2. 增殖培养：将S1萌发的芽依次接种于增殖培养基A和增殖培养基B上，分化出丛芽；

所述增殖培养基A包括：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，6-BA 2.5 mg/L，IBA 0.25 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8；

所述增殖培养基B包括：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，6-BA 1.5mg/L，IBA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8；

S3. 壮苗培养：将S2分化出的丛芽接种于壮苗培养基上培养；

S4. 生根培养：将S3经过壮苗的丛芽切成单株接种于生根培养基中培养，生根后继续培养获得牛樟苗。

本发明优化了增殖培养所用培养基的组分含量。发明人经过大量实验研究发现，用所述增殖培养基A培养牛樟一段时间后，腋芽萌发伸长快，且能分化出的大量的芽；后几代转接于增殖培养基B中培养，激素浓度降低，减少叶片干枯死亡，分化出大量丛芽，月繁殖系数达到4~6倍，在繁殖过程中形态正常，保证增殖的同时抑制了牛樟死苗，大大提高牛樟的繁育苗木效率。

本发明首次建立了一套完整的具有高诱导率及增殖倍数的诱导、增殖、生根和炼苗的快繁方法，形成批量快速的繁殖局面，极大提高牛樟繁育的效率，拯救了牛樟这种即将灭绝的的物种资源，为具有极高药用和经济价值的牛樟芝的生产和研发提供了大量原材料。

优选地，S2所述增殖培养基A培养时间为60天。

优选地，S2所述增殖培养基B培养时间为150~180天。

S2所述增殖培养使腋芽萌发伸长，随后分化出丛芽。

优选地，所述腋芽萌发伸长的时间为接种到增殖培养基A上20天后。优选地，所述分化出丛芽的时间为接种到增殖培养基A上40天后。

优选地，S1所述诱导培养基包括：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，6-BA 1.0mg/L，IBA 0.1 mg/L，活性炭0.5 g/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

S1所述诱导培养使牛樟茎段先萌发新芽，后展开叶片。优选地，所述萌发新芽的时间为接种到诱导培养基上15天后；所述展开叶片的时间为接种到诱导培养基上25天后。更优选地，牛樟茎段萌发出新芽后即可接种至S2所述增殖培养基上。

优选地，S3所述壮苗培养基包括：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，6-BA 1.0 mg/L ，VB1  0.1 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

S3所述壮苗培养使丛芽培养成健壮翠绿的植株。优选地，所述将丛芽培养成健壮翠绿的植株的时间为接种到壮苗培养基上30天后。

优选地，S1~S3所述的所有培养，培养条件为每天光照10~12h，温度为25°C。

优选地，S4所述生根培养基包括：1/2MS培养基，IBA  0.05mg/L、ABT生根粉0.20mg/L，活性炭1.0 g/L，蔗糖35g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

S4所述生根培养得到有根的完整植株。优选地，所述得到有根的完整植株的时间为接种到生根培养基上30天后。

优选地，S1所述牛樟茎段选自当年生牛樟嫩枝去叶留柄。更优选地，S1所述牛樟茎段选自健康牛樟母树当年生的腋芽饱满且尚未萌发的幼嫩侧枝，除去叶片并保留1~2 cm的叶柄，切成4~6 cm长的茎段进行后续处理。

优选地，S1所述外植体消毒为将牛樟茎段依次于甲基托布津、酒精和升汞溶液中进行处理，并用无菌水冲洗干净。更优选地，S1所述外植体消毒先将牛樟茎段于洗衣粉水中浸泡30 min后，再依次于甲基托布津、酒精和升汞溶液中进行处理。

所述S1将甲基托布津、酒精和升汞配合使用，可进行深度杀菌，达到比单一消毒剂或仅使用酒精和升汞时更好的消毒效果。其中，甲基托布津是一种光谱性的高效、低毒、低残留的内吸性杀菌剂，被植物吸收后转化为多菌灵，干扰真菌有丝分裂中纺锤体的形成，影响细菌细胞分裂，使细胞壁中毒，孢子萌发长出的芽管畸形，从而杀死病菌。现有技术中甲基托布津主要用于对苗床、栽培基质和组培苗等进行消毒，或预防并治疗植株栽培过程中出现的白粉病、烟煤病等真菌病，而本发明发现将甲基托布津用于诱导前的牛樟茎段消毒，有效解决了牛樟外植体在初代培养过程中易出现真菌、细菌污染的情况，减低污染率的同时保证出芽率。

需严格控制消毒剂的浓度和消毒时间，防止杀死外植体细胞，影响诱导率。优选地，S1所述甲基托布津的浓度为800~1200 mg/L，处理时间为8~12min。更优选地，所述甲基托布津的浓度为1000 mg/L，浸泡时间为10 min。

优选地，S1所述酒精体积分数为70~75%，处理时间为20~30 s。70~75%的酒精具有强渗透性，此时酒精进入细菌的细胞内使蛋白变性，将酒精消毒时间控制在30 s以内，避免杀死细菌的同时损伤植物细胞。更优选地，所述酒精的体积分数为75%，浸泡时间为30 s。

优选地，S1所述升汞的质量体积浓度为0.1~0.2 g/L，处理时间为5~15min。更优选地，所述升汞的质量体积浓度为0.1 g/L，浸泡时间为10 min。所述升汞使病菌的蛋白变性，且对细菌的消毒能力比真菌强。

优选地，S4所述生根的苗长至3~5cm，根数5条以上时，移栽到室外培养。

优选地，所述移栽为炼苗移栽：将生根成功的瓶苗置于温室中炼苗7~10天，开盖取苗，洗净并用1000倍多菌灵处理10min后于基质中栽培。

优选地，所述基质为泥炭土：沙子：珍珠岩按体积比1：1：1混合所得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明以带有腋芽的茎段为外植体，诱导萌发芽，先接种至激素浓度稍高的增殖培养基A，诱导出丛芽；再接种于激素浓度较低的增殖培养基B中，减少叶片干枯死亡，分化出大量丛芽，月繁殖系数达到4~6倍，在繁殖过程中形态正常，完全适合大规模工业化生产，大大提高牛樟的繁育苗木效率。

（2）本发明的方法有效解决了牛樟外植体在初代培养过程中易出现真菌、细菌污染的情况，减低污染率的同时保证出芽率。

（3）本发明快速批量地生产出牛樟树苗，为拯救和扩大该种植资源的同时还为绿化、用材和发展相应的林业经济提供坚实的物种保障；也为具有极高经济价值的樟芝的大量生产，提供了充足树材。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1  不同消毒剂处理和消毒时间对牛樟茎段消毒效果的影响

采集健康母树当年生的腋芽饱满且尚未萌发的幼嫩侧枝，除去叶片并保留1~2 cm的叶柄，切成4~6 cm长的茎段，先用洗衣粉水浸泡30 min，再用1000 mg/L甲基托布津浸泡10 min（空白：即不用1000 mg/L甲基托布津浸泡时，用自来水流水冲洗30 min替代）。在超净工作台上用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞处理5~15 min，无菌水冲洗4~6次。两端及叶柄各切去1 cm，并切成带1~2个腋芽的茎段，接种于备用培养基上。

每种处理接种30个芽茎段，试验重复3次。外植体诱导30天后，统计污染率和死亡率。

污染率（%）= 污染数/总接种数×100%

死亡率（%）= 死亡数/总接种数×100%

表1 不同消毒剂处理和消毒时间对牛樟茎段消毒效果的影响

如表1所示，0.1%升汞处理时间相同，使用甲基托布津处理的消毒效果明显比未使用的好，污染率明显降低，而死亡率却没有明显差异。两种处理方法的污染率均随着升汞消毒时间增加而下降，死亡率随着升汞消毒时间增加而增加。最适合的消毒时间为升汞消毒10 min，此时污染率为25.92%，死亡率为3.43%，达到理想状态。

至此，本发明建立了适用牛樟茎段组培快繁的消毒方法，即1000 mg/L甲基托布津浸泡10 min + 75%酒精浸泡0.5 min + 0.1%升汞消毒10 min配合使用，可进行深度杀菌，达到比单一消毒剂或仅使用酒精和升汞时更好的消毒效果，有效解决了牛樟外植体在初代培养过程中易出现真菌、细菌污染的情况，减低污染率的同时保证出芽率。

实施例2  不同诱导培养基对牛樟茎段诱导的影响

按照实施例1的消毒方法，采集健康母树当年生的腋芽饱满且尚未萌发的幼嫩侧枝，除去叶片并保留1~2 cm的叶柄，切成4~6 cm长的茎段，先用洗衣粉水浸泡30 min，再用1000 mg/L甲基托布津浸泡10 min。在超净工作台上用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞10 min，无菌水冲洗4~6次。两端及叶柄各切去1 cm，并切成带1~2个腋芽的茎段，接种于以下诱导培养基（诱导培养基的具体配方见表2）进行芽诱导培养。培养光照强度为1500~2000 lux，光照时间为12小时/天。

所述诱导培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，活性炭0.5 g/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

每种处理接种40个芽茎段，试验重复3次。外植体诱导培养30天后，统计出芽时间、平均诱导率和平均诱导芽数。

平均诱导率（%）= 诱导出不定芽的外植体数/（总接种数－污染数）×100

平均诱导芽数=不定芽总数/诱导出不定芽的外植体数

表2 不同激素组合对牛樟茎段诱导的影响

由表2可知，不同的激素浓度配比对平均出芽时间，诱导芽数和平均诱导率均有影响。在6-BA / IBA比值在5~10之间时，其相关指标均较高。且以6-BA为1.0 mg/L，IBA为0.1 mg/L时，在较短时间（10~13 d）内可获得平均为2.5个不定芽，诱导率为88.2%。

实施例3  不同增殖培养基对牛樟增殖培养的影响

把实施例2中诱导的芽接种到增殖培养基中（增殖培养基的具体配方见表3）进行增殖培养。培养光照强度为1500~2000 lux，光照时间为12小时/天。

所述增殖培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

每种处理接种40个芽茎段，试验重复3次。芽每增殖培养一代（即每30天），统计相应的增殖系数和芽的长势。

表3 不同激素组合对牛樟芽增殖的影响

据表3可知，牛樟组培苗在不同时期对培养基激素浓度的适应性不同。在前2代时， 6-BA /IBA浓度比值在10~20之间比较利于牛樟腋芽的萌发与抽长，且随着BA浓度的增加，不定芽的分化率和苗健壮程度增加。在后几代时，6-BA浓度高于2 mg/ml时，组培苗普遍出现新叶干枯，老叶脱落，且底部愈伤组织大的现象，且苗的死亡率逐渐提高。而6-BA浓度低于1.5 mg/ml，6-BA /IBA浓度比值在15~30时，不定芽的增殖情况较好，增殖系数较高，且苗株正常，叶片翠绿，不死亡。如果在增殖培养过程仅采用一种增殖培养基，往往会出现前两代苗健壮，产生大量从芽，但后几代芽微玻璃化，出现大量苗死亡的情况；或者前两代苗长势一般，丛芽诱导慢，造成总体芽体比较弱小、增殖系数低的情况。以上两种培养基均不能达到牛樟增殖培养的最佳效果，易产生牛樟死苗或芽体弱小的现象，使牛樟的繁育苗木效率偏低。所以，本试验牛樟增殖的最佳方案为先把芽接种于基础培养基+BA 2.5+ IBA 0.25培养基中培养60天，诱导出大量不定芽后，再接种于基础培养基+BA 1.5 + IBA 0.1中培养，这样既能提高增殖率又能使植株正常生长。

实施例4  不同生根培养基对牛樟组培苗生根的影响

丛生芽在壮苗培养基中培养30天后，分切成单株接种到生根培养基上（生根培养基的具体配方见表4）进行生根培养，培养光照强度为2000~2500 lux，光照时间为12小时 /天。每种培养基接种15株苗，试验重复3次。生根培养30天后，统计生根率、平均每株根数和植株长势。

所述生根培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：1/2MS培养基，活性炭1.0 g/L，蔗糖35g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

生根率=生根植株树/总植株树×100%

平均每株根数=总根数/生根植株树

表4 不同激素配比对牛樟组培苗生根的影响

如表4可知，ABT生根粉和IBA结合使用的生根效果比单一生根剂好；ABT生根粉或IBA的浓度为0.2~0.3 mg/L时，牛樟植株生根情况和长势均较好；浓度高于0.5 mg/L时不利于牛樟生根。综合各指标，选取ABT 0.20 mg/L 和IBA  0.05 mg/L为最优生根培养基，该组合下的生根达98.7%，平均每株根数为7.1条，植株健壮、生长、叶片大且绿、无掉叶现象。

对比例1  NAA和IBA对牛樟增殖培养效果的比较

以实施例3中所筛选出最佳增殖培养基为基础，基础培养基、细胞分裂素6-BA浓度和生长素浓度不变，更改生长素的种类（即以NAA替换IBA）配制增殖培养基。

把实施例2中诱导的芽先接种到增殖培养基序号1和2中（增殖培养基的具体配方见表5）增殖培养60天后，再接种于增殖培养基序号3和4中进行后续增殖培养。培养光照强度为1500~2000 lux，光照时间为12小时/天。

所述增殖培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

每种处理接种40个芽茎段，试验重复3次。每培养30天（即一代）后进行观察统计。

表5  NAA和IBA对牛樟增殖培养效果的比较

由表5可知：在两种不同增殖培养基中，相同浓度的NAA和IBA对牛樟增殖培养的影响有明显的差异。相同浓度的NAA较易使牛樟芽体底部产生大量愈伤组织导致芽体生长和分化受限，芽体细弱生长缓慢，丛生芽分化比较慢且数量少；而IBA明显比较利于牛樟芽快速正常地生长，植株健壮、叶片翠绿自然展开，且丛芽分化快且数量多，增殖系数比NAA的略高一些。

Claims (10)

1.一种牛樟茎段组培快繁的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 诱导培养：将牛樟茎段外植体消毒后接种于诱导培养基中进行芽诱导培养；

S2. 增殖培养：将S1萌发的芽依次接种于增殖培养基A和增殖培养基B上，分化出丛芽；

所述增殖培养基A包括：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，6-BA 2.5 mg/L，IBA 0.25 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8；

所述增殖培养基B包括：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，6-BA 1.5mg/L，IBA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8；

S3. 壮苗培养：将S2分化出的丛芽接种于壮苗培养基上培养；

S4. 生根培养：将S3经过壮苗的丛芽切成单株接种于生根培养基中培养，生根后继续培养获得牛樟苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述增殖培养基A培养时间为60天。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2所述增殖培养基B培养时间为150~180天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述诱导培养基包括：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，6-BA 1.0mg/L，IBA 0.1 mg/L，活性炭0.5 g/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述壮苗培养基包括：MS培养基，Vc 2.0 mg/L，生物素0.30 mg/L，L-半胱氨酸5.0 mg/L，6-BA 1.0 mg/L ，VB1  0.1 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述生根培养基包括：1/2MS培养基，IBA  0.05mg/L、ABT生根粉0.20mg/L，活性炭1.0 g/L，蔗糖35g/L，琼脂7 g/L，pH值5.8。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述外植体消毒为将牛樟茎段依次于甲基托布津、酒精和升汞溶液中进行处理，并用无菌水冲洗干净。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述生根的苗长至3~5cm，根数5条以上时，移栽到室外培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述移栽为炼苗移栽：将生根成功的瓶苗置于温室中炼苗7~10天，开盖取苗，洗净并用1000倍多菌灵处理10min后于基质中栽培。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述基质为泥炭土：沙子：珍珠岩按体积比1：1：1混合所得。