CN101429489A - 牛樟体胚培养基及组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

一种牛樟体胚培养基，含有MS为基本培养基或MS盐类和MT维生素，还含有BA、Picloram、ABA、NAA等生长调节剂，以及170mg/L的一水磷酸二氢钠、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、1.2％的琼脂、3％的蔗糖，分别配制成了体胚分化、体胚增殖及胚芽分化、胚芽生根的三种培养基。运用上述培养基对牛樟组培快繁方法按四个步骤进行：一是外植体的采集与消毒，二是体胚的诱导，三是体胚增殖与胚芽分化，四是诱导生根与移栽。本发明首创了牛樟体胚繁殖树苗的整套方法，拯救了这一几乎灭绝的物种资源，为进一步探索体胚的基因工程、拓宽外植体材料等奠定了基础。而且为具有极高经济价值的樟芝的大量生产，提供了充足树材。

Description

牛樟体胚培养基及组培快繁方法

【技术领域】

本发明涉及一种植物的体胚培养基及组培快繁方法。

【背景技术】

牛樟Cinnamomum kanehirae Hayata，又名樟牛、有樟，樟科(Lauraceae)、樟属(Cinnamomum)，是中国南方特有樟科植物，因其树形粗状坚实，故称为牛樟。牛樟木材芳香，为著名的建筑、家具及雕刻工艺用材，尤其是佛像雕刻，受佛家宠爱。牛樟全株可提炼牛樟油。另外牛樟树上寄生的真菌，被称为牛樟菇或牛樟芝。众人认为具有抗癌、强身等功效，其价格日扬。牛樟原本在中国南方分布较广，自海拔200公尺到2,000公尺有其自然分布，但是由于过去大量的伐采，现在只有在高山地区还有零星的分布，且多为逾龄老熟木，加上牛樟之花属黏质虫媒花，母树间受粉困难，又多开于树冠顶端，易遭风害，偶有种子亦未成熟前即遭鸟、兽食害，因此采种极为困难。在自然状态下，种子自落，也因林下光弱、枯枝落叶过厚而不易着床发芽成苗。因此牛樟数量极为稀少，已列为保育类植物。快速而批量地繁殖濒危的牛樟树，应成为林业工作的当务之急，经检索，至今未见用牛樟未成熟种子为外植体，配制有效的组织培养基，对牛樟进行快繁的方法的报道。为此，本申请人遂组织力量，进行组培快繁的科研攻关工作，已初见成效。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是用牛樟的未成熟种胚为外植体，配制一种有效的体胚培养基，进行诱导牛樟体胚分化、体胚增殖、发芽及生根，提供一套完整的组培及快繁方法。

针对现实状况，本发明的任务有四：一是提供一种诱导体胚分化的培养基，二是提供一种体胚增殖及胚芽分化培养基，三是提供一种胚芽生根培养基，四是提供整套牛樟组培快繁方法。

上述任务可通过如下措施实现：本牛樟组培快繁培养基，除MS基本培养基、MS盐类、MT维生素外，还含有作生长调节剂的0.01-1mg/L或1-5mg/L的BA即苄氨基腺嘌呤、0.0005-0.01mg/L或0.0001-0.01mg/L的Picloram即氨氯吡啶酸、0.03-1mg/L的ABA即脱落酸、0.01-1mg/L的NAA即α-奈乙酸、170mg/L的一水磷酸二氢钠、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、附加占各培养基总重量1.0-1.5％的琼脂和1.5-4.5％的蔗糖，配制成三阶段分别用的体胚分化培养基、体胚增殖及胚芽分化培养基和胚芽生根培养基，各培养基的pH值5.0-6.0。

所说的体胚分化培养基由MS盐类、MT维生素、0.01-1mg/L的BA、0.0005-0.01mg/L的Picloram、170mg/L的一水磷酸二氢钠、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、占培养基总重量1％-1.5％的琼脂和1.5-4.5％的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。

所说的体胚增殖及胚芽分化培养基由MS盐类、MT维生素、1-5mg/L的BA、0.0001-0.01mg/L的Picloram、0.03-1mg/L的ABA、170mg/L的一水磷酸二氢钠、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、占培养基总重量1％-1.5％的琼脂和1.5-4.5％的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。

所说的胚芽生根培养基由MS基本培养基、0.01-1mg/L的NAA、占培养基总重量(为简便起见，以下不再说明，只给出百分数)1％-1.5％的琼脂和1.5-4.5％的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。

用本牛樟体胚培养基进行组培快繁经过下列步骤：

(1)外植体的采集与消毒：采集开花授粉后4-5个月未成熟淡绿色幼果，用刀切去部分果皮及果肉，用手剥去果皮和果肉让呈淡褐至褐色的种子完全露出，逐一泡在蒸馏水内，最后统一用蒸馏水漂洗三次，再将种子置入稀释10倍的5％ NaCI0溶液中，真空条件下浸泡20min，用无菌水冲洗五次，置于无菌培养皿上，用刀剥开种子再置于显微镜下用刀尖挑取胚组织；

(2)体胚的诱导：将挑取胚组织接种于如权利要求2所述的诱导体胚分化的培养基上，置于暗柜中，温度25±2℃，培养40-60天后便能成功地诱导体胚分化；

(3)体胚增殖及胚芽分化：将上述开始分化的胚组织，移至人工光照条件下培养，光照强度2500Lux，光照16h/d，控制温度25±2℃，培养50-70天后，将材料转入如权利要求3所述的体胚增殖及胚芽分化培养基上培养30-50天，胚芽陆续分化；

(4)诱导生根与移栽：当胚芽长至1cm高时将其移植至如权利要求4所述的胚芽生根培养基中，光照强度3700Lux，光照16h/d，25±2℃条件下，2-3个月后再将带根试管苗置于驯化室，强光20000Lux下驯化2周移栽，先用清水洗去根部的培养基，种植于三者的体积比为蛭石:珍珠岩:泥炭＝1:1:1的混合而成的基质中，每个花盆套透明塑料袋，该袋每二天剪一小口，2-3周后弃袋移入温室栽种。

本发明的有益效果是：首创了牛樟体胚培养基及整套组培快繁方法，快速而批量地生产出牛樟树苗，为拯救和扩大该种质资源的同时，还为绿化、用材、发展相应的林业经济提供坚实的物质保障，又为进一步探索体胚的基因工程、拓宽外植体材料等奠定了基础，而且为具有极高经济价值的樟芝的大量生产，提供了充足树材。

【具体实施方式】

本发明下面结合实施例作进一步详述：

本牛樟体胚培养基主要由MS基本培养基或MS盐类、MT维生素，附加生长调节剂、凝固剂和营养剂等组成，凝固剂及其最佳添加量选定为占该培养基总重量的1.2％的琼脂，营养剂选定为3％的蔗糖。本培养基还含有170mg/L的一水磷酸二氢钠、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白，培养基的pH值5.0-6.0，最佳值5.7。按附加的生长调节剂的成分与添加量的不同，配制成三种不同阶段应用的培养基：一是诱导体胚分化的培养基，二是体胚增殖及胚芽分化培养基，三是胚芽生根培养基。

在配制三种不同阶段的培养基中，体胚诱导培养基采用了不同浓度的BA 0-10(单位：mg/L，下同)和不同浓度的Picloram 0-0.01配比的培养基，进行对比实验，筛选出诱导体胚分化效果较佳的生长调节剂浓度为BA0.01-1+Picloram 0.0005-0.01、最好的生长调节剂浓度为BA0.3+Picloram 0.01；体胚增殖及胚芽分化培养基采用不同浓度的BA 0-10、不同浓度的Picloram 0-0.1和不同浓度的ABA0-10配比的培养基，进行对比实验，筛选出增殖系数较好的生长调节剂浓度为BA 1-5+Picloram 0.0001-0.01+ABA 0.03-1、最好的生长调节剂浓度为BA 3+Picloram 0.0001+ABA 0.3。

现将三阶段分别用的三种培养基的四个实施例的原料及配比值列表如下：

下面用最佳方案的实施例1来说明本发明(见表中相应的原料及配比值)：

(1)外植体的采集与消毒：外植体的采集与消毒：采集开花授粉后4-5个月未成熟淡绿色幼果，用刀切去部分果皮及果肉，用手剥去果皮和果肉让呈淡褐至褐色的种子完全露出，逐一泡在蒸馏水内，最后统一用蒸馏水漂洗三次，再将种子置入稀释10倍的5％NaCI0溶液中，真空条件下浸泡20min，用无菌水冲洗五次，置于无菌培养皿上，用刀剥开种子再置于显微镜下用刀尖挑取胚组织；

(2)体胚的诱导：将挑取胚组织接种于用MS盐类+MT维生素+0.1mg/L BA+0.0001mg/L Picloram+1.2％琼脂+3％蔗糖配制成的体胚诱导的培养基上，pH值5.7，置于暗柜中，温度25±2℃，培养40-60天后便能成功的诱导体胚分化；

(3)体胚增殖及胚芽分化：将开始分化胚组织的材料，移至光下培养，光照强度2500Lux，光照16h/d，25±2℃条件下，培养50-70天后，将材料转入MS盐类+MT维生素+1mg/L的BA+0.001的Picloram+0.3mg/L的ABA+1.2％琼脂+3％蔗糖的体胚增殖及胚芽分化的培养基上，pH值5.7，培养30-50，小芽陆续分化；

(4)诱导生根与移栽：当小芽长至1cm高时将其移植至MS基本培养基+0.1mg/L的NAA+1.2％琼脂+3％蔗糖的生根培养基中，光照强度3700Lux，光照16h/d，25±2℃条件下，2-3个月后可将带根试管苗置于驯化室，强光20000Lux下驯化2周移栽，先用清水洗去根部的培养基，种植于三者的体积比为蛭石:珍珠岩:泥炭＝1:1:1的混合而成的基质中，每个花盆套透明塑料袋，该袋每二天剪一小口，一个月后弃袋移入温室栽种，成活率高达85％。

其余实施例2-4，照表中三种培养基相应原料及配比值，与实施例1相同步骤操作，也能解决本发明的技术问题。

Claims (5)

1、一种牛樟体胚培养基，含有MS基本培养基、MS盐类、MT维生素，其特征是还含有作生长调节剂的0.01-1mg/L或1-5mg/L的BA即苄氨基腺嘌呤、0.0005-0.01mg/L或0.0001-0.01mg/L的Picloram即氨氯吡啶酸、0.03-1mg/L的ABA即脱落酸、0.01-1mg/L的NAA即α-奈乙酸、170mg/L的一水磷酸二氢钠、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、附加占各培养基总重量1.0-1.5％的琼脂和1.5-4.5％的蔗糖，配制成三阶段分别用的体胚分化培养基、体胚增殖及胚芽分化培养基和胚芽生根培养基，各培养基的pH值5.0-6.0。

2、如权利要求1所述的牛樟体胚培养基，其特征是所说的体胚分化培养基由MS盐类、MT维生素、0.01-1mg/L的BA、0.0005-0.01mg/L的Picloram、170mg/L的一水磷酸二氢钠、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、占培养基总重量1％-1.5％的琼脂和1.5-4.5％的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。

3、如权利要求1所述的牛樟体胚培养基，其特征是所说的体胚增殖及胚芽分化培养基由MS盐类、MT维生素、1-5mg/L的BA、0.0001-0.01mg/L的Picloram、0.03-1mg/L的ABA、170mg/L的一水磷酸二氢钠、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、占培养基总重量1％-1.5％的琼脂和1.5-4.5％的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。

4、如权利要求1所述的牛樟体胚培养基，其特征是所说的胚芽生根培养基由MS基本培养基、0.01-1mg/L的NAA、占培养基总重量1％-1.5％的琼脂和1.5-4.5％的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。

5、一种用权利要求1-4任一项所述的牛樟体胚培养基进行组培快繁的方法，其特征是经过下列步骤：

(1)外植体的采集与消毒：采集开花授粉后4-5个月未成熟淡绿色幼果，用刀切去部分果皮及果肉，用手剥去果皮和果肉让呈淡褐至褐色的种子完全露出，逐一泡在蒸馏水内，最后统一用蒸馏水漂洗三次，再将种子置入稀释10倍的5％NaCI0溶液中，真空条件下浸泡20min，用无菌水冲洗五次，置于无菌培养皿上，用刀剥开种子再置于显微镜下用刀尖挑取胚组织；

(2)体胚的诱导：将挑取胚组织接种于如权利要求2所述的诱导体胚分化的培养基上，置于暗柜中，温度25±2℃，培养40-60天后便能成功地诱导体胚分化；

(3)体胚增殖及胚芽分化：将上述开始分化的胚组织，移至人工光照条件下培养，光照强度2500Lux，光照16h/d，控制温度25±2℃，培养50-70天后，将材料转入如权利要求3所述的体胚增殖及胚芽分化培养基上培养30-50天，胚芽陆续分化；

(4)诱导生根与移栽：当胚芽长至1cm高时将其移植至如权利要求4所述的胚芽生根培养基中，光照强度3700Lux，光照16h/d，25±2℃条件下，2-3个月后再将带根试管苗置于驯化室，强光20000Lux下驯化2周移栽，先用清水洗去根部的培养基，种植于三者的体积比为蛭石:珍珠岩:泥炭＝1:1:1的混合而成的基质中，每个花盆套透明塑料袋，该袋每二天剪一小口，2-3周后弃袋移入温室栽种。