CN105340749B - 一种澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于经济林木育苗技术领域，具体涉及一种澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法。所述的方法包含如下步骤：(1)外植体材料的选择与处理；(2)首次无菌株系的建立；(3)增殖培养；(4)生根培养；(5)移栽。本发明利用了扦插的技术，又利用了组织培养技术，因此扦插效率高，不受环境影响；通过自我离体繁殖，解决了扦插枝条来源的问题，无需消耗林地树木，不影响树木生长和精油提取，同时提高了繁殖效率。

Description

一种澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法

技术领域

本发明属于经济林木育苗技术领域，具体涉及一种澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法。

背景技术

澳洲茶油树，又名互叶白千层(Melaleuca alternifolia)，属桃金娘科，原产地为澳大利亚。我国于20世纪70年代开始引种栽培，在广东、广西、福建、云南等地均有推广种植，其新鲜枝叶可提取精油，称为互叶白千层油，俗称茶树油(Tea Tree oil)。其主要成分是桉树脑和萜品-4-醇，能高效、无毒、无刺激地杀死人体皮肤表面的真菌与细菌，并对某些病毒有抑制作用，是天然的芳香剂、抗菌剂和防腐剂，因而在医药、食品防腐、化妆护肤及保健品等方面广泛应用。澳洲茶油树除了能提炼用途广泛的精油外，其树木本身又有十分大的观赏价值，且较速生、抗性极好、可塑性强、耐修剪，因此被引用于园林造景中，将其美名为“黄金香柳”。

由于澳洲茶油树只适合在以南北回归线(23.5度)为中轴，南北各50公里亚热带气候环境的带状区域种植，种植区域十分有限。并且2005年至今，因澳洲受全球气候变暖的影响，澳洲茶油树种植区域连续遭受严重干旱且出现沙漠化现象，而导致面积急剧萎缩。加之澳洲的茶油树集团对种子的严格控制，我国最初的种植依靠进口种子繁殖，由于种子价格昂贵，造成澳洲茶油树引种扩种的速度受到一定的影响和制约。

目前国内各地开展了自主繁殖澳洲茶油树的研究和推广。主要表现为：

①种子育苗：培育实生营养杯苗，是目前我国澳洲茶油树应用最多的育苗技术。

每年春、秋两季播种，首先对苗圃地消毒，淋透水，对种子消毒，并用细河沙拌种后撒播，覆一层黄心土，塑料薄膜覆盖，定期检查水分和发芽情况，发芽后改拱棚覆盖，定期通风、喷水，保持适宜发芽温度(25～35℃)。1～2月后，移植到营养杯中(移植前需炼苗1周)，苗高至15cm，出圃。

优点：相对较易操作，技术含量不高，不需要设施。

缺点：购买进口种子非常昂贵，约70元/g；自己培育的树木留种，需要消耗一定的量的树木，不能再用于生产精油；通过种子培育的实生苗，其后代基因型存在分化现象，不能保证种植林生长及精油含量表现一致；育苗时间受外界气候影响，不能全年工厂化生产苗木；繁殖速度慢，繁殖系数低。

②扦插育苗：有一定的应用，是种子繁殖育苗的补充。

用种子实生苗做母株，需建立采穗圃，密植，定期除草，截顶和水肥管理。配制苗床基质并消毒，和淋透水，从截顶母株的萌芽条中选半木质化芽条作接穗，去掉基部叶片和侧芽，剪平断面并对伤口消毒处理，再用生根剂浸泡接穗，处理后扦插入苗床基质中，需要遮荫处理，定期淋水，施肥，病虫害防治，至苗木生长健壮，苗高15cm以上后出圃。

优点：生产的苗木可以是同一优良无性株系的后代，不需要设施，较种子育苗周期略短。

缺点：接穗来源，需要一定量的母本树；生根率低，种质资源浪费严重；繁殖速率较组培低，繁殖系数低，受外界气候影响较大。

③组织培养快繁技术：

其优点是：不受外界气候条件的制约和影响，繁殖速率高，繁殖系数高，可以是同一优良无性株系的后代，育苗周期短。

缺点是：需要设施，技术含量高，成本较高。技术研发周期长，需要多种激素配伍才能达到较好的快繁目的，且随继代培养代数增加，可能会出现玻璃化苗现象、无菌苗退化现象或苗势变弱，若通过愈伤组织途径，则可能影响芽分化等。由人工气候状态移栽入杯苗，需要炼苗时间长，成活率受影响。

澳洲茶油树无论从树木本身还是提取物均具有很高的经济价值，而产业发展的首要问题和瓶颈是如何快速、低成本的繁殖苗木。而目前澳洲茶油树的育苗主要依靠种子培育，其次扦插育苗。其不能形成全年、工厂化的、不需要依赖外界气候影响的、高繁殖系数的育苗技术。同时引入组织培养常规快繁途径(愈伤组织途径或不定芽途径)，技术要求高，由理论研究到真正工厂化育苗的研发周期长，在澳洲茶油树的育苗中还不能得以实现。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，该方法能缩短育苗周期和增加繁育系数，实现澳洲茶油树的快速繁育苗木的目的。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，包含如下步骤：

(1)外植体材料的选择与处理：

选取澳洲茶油树幼树上直径在1mm以下的幼嫩茎段进行消毒处理；

(2)首次无菌株系的建立：

将步骤(1)消毒处理后的幼嫩茎段截取成1～2cm长的茎段，按生长方向，插入培养基中，进行培养；

(3)增殖培养：

待步骤(2)中的无菌苗生长至3～5cm，截取中间的茎段部分，再次插入新的培养基中，进行增殖培养，得到3～5cm长的无菌扦插苗，无菌扦插苗可以用于继续继代培养或用于生根培养；

(4)生根培养：

从步骤(3)中增殖培养得到的无菌扦插苗上，截取1～2cm长的顶端枝梢或截取1～2cm长的侧枝(含顶端的1～2cm长的侧枝)，扦插于新的培养基中进行生根培养；培养一周后可生长出白色健壮的根，培养1个月后，苗高可达3～5cm；

(5)移栽

选取健壮的带根无菌苗移栽至混合基质中进行培养；待苗高10～15cm时，出圃；

步骤(1)中所述的幼嫩茎段优选为当年生、无病虫害、生长旺盛的、直径在1mm以下的幼嫩茎段；大于1mm的茎段，一则木质化程度高，难于培养，二则其内生菌较多，培养中也易污染，还需培养基中添加其他抗生素等物质，故选取相对幼嫩的直径在1mm以下的茎段作为外植体材料，较易建立无菌株系；

步骤(1)中所述的幼嫩茎段的长度优选为2cm～3cm；

步骤(1)中所述的消毒处理的具体操作优选为：将幼嫩茎段置于水中，冲洗1h～2h，然后用体积分数为70％～90％的酒精进行表面消毒30s～60s，再用质量百分比为0.1％的HgCl₂消毒6～7min，最后无菌水冲洗4～7次；

步骤(2)、(3)和(4)中所述的培养基的配方为：MS+40g/L蔗糖+1g/L活性炭+1mg/LNAA+8g/L琼脂，pH＝5.8～6.0；

步骤(2)、(3)和(4)中所述的培养的条件优选为：培养温度25℃±1℃，光照度1500～2000lx，每天10h光照/14h黑暗；

步骤(2)中所述的培养基中茎段的数目优选为3～5段；

步骤(2)中所述的培养的时间优选为1～2月；

步骤(3)中所述的中间的茎段部分的长度优选为每段1～2cm；

步骤(5)中所述的健壮的带根无菌苗优选为苗高3～5cm，有2～3条白色健壮根的无菌苗；

步骤(5)中所述的混合基质优选为：蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合得到；

步骤(5)中所述的培养的环境条件优选为：高湿度但叶片不积水、高光照、恒温25℃±1℃；

步骤(5)中所述的培养的环境条件进一步优选为：培养环境置有雾化装置，空气湿度85～95％以上，但叶片不积水；培养温度25℃±1℃，每天12h光照/12h黑暗；

步骤(5)中所述的培养的条件优选为：选取健壮的带根无菌苗移栽至混合基质中在人工气候环境中进行培养；生长15～20天后，放置于室外荫棚下进行培养，按花木杯苗的常规管理即可；待苗高10～15cm时，可以出圃；

所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，可以应用于澳洲茶油树的苗木快速繁育，以及筛选和保存澳洲茶油树优良无性系等方面；还可以应用于非难生根培养的其他经济林木树种的快速育苗生产；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法克服了现有技术中的各育苗方法中的主要缺点。

(2)本发明利用了扦插的技术，但又在无菌状态和人工气候环境下，因此扦插效率高，不受环境影响；通过自我离体繁殖，解决了扦插枝条来源的问题，无需消耗林地树木，不影响树木生长和精油提取，同时提高了繁殖效率。

(3)本发明利用了组织培养技术的优势，但又不同于常规组织培养，它不需要经过复杂的培养基配方探索，不需要形成复杂的培养基配方(主要表现在需要多种激素的配伍和高浓度激素的作用)以及形成的育苗途径较复杂等(主要表现在需要形成愈伤组织或形成不定芽，再通过两步分化培养，成苗和生根)。仅仅需要模拟扦插土壤的环境，同时提供一个生根的条件，即①利用常规的MS培养基提供扦插枝条生长的养分；②利用添加活性炭提供一个相对的暗环境，创造生根条件；③利用添加1mg/L的NAA提供促进生根需要的外源激素，同时由于添加的活性炭的吸附作用，保证了扦插枝条基部的NAA浓度较低，不会出现高激素的负面作用，例如组培中高激素作用后不定芽的玻璃化问题、愈伤组织难分化问题、增殖多代后退化问题等；④整个无菌扦插过程只有一个培养基配方，操作简单而有效；⑤生根培养和芽苗生长一步完成，节省培养基成本、人工成本和时间成本。

(4)本发明在移苗期引入了雾化装置，提供了一个高湿度但叶片不积水、高光照、恒温的环境，适用于幼嫩的无菌扦插苗，因此减少了炼苗的阶段(一周)，提高了移栽成活率(95～98％以上)，建立稳定的体系后，每次增殖至少3～4倍，年至少增殖6～8次，2个工人可年产20万株苗，10个工人可年产300～400万株以上苗。

附图说明

图1是本发明澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法的流程图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用培养基的配方为：MS+40g/L蔗糖+1g/L活性炭+1mg/L NAA+8g/L琼脂，pH＝5.8～6.0；

混合基质的配方为：蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合得到；

混合基质的消毒处理：高压湿热灭菌(121℃，20分钟)后装杯；或者用质量百分比为0.1％的多菌灵或高锰酸钾溶液消毒后装杯；并淋透水。

实施例1

(1)外植体材料的选择与处理：

天气晴朗时，在澳洲茶油树幼树上选取当年生、无病虫害、生长旺盛的、直径在1mm以下的幼嫩茎段；将幼嫩茎段剪成3cm长，置于自来水下，边搅拌边冲洗1h，在超净工作台上先用体积分数为75％的酒精进行表面消毒30s，然后用质量百分比为0.1％的HgCl₂消毒6min，用无菌水冲洗5次待用；

(2)首次无菌株系的建立：

将步骤(1)消毒处理后的幼嫩茎段截取成2cm长的茎段，然后按生长方向，垂直插入培养基中，每个培养基中扦插5段，置于温度25℃，光照度2000lx的环境中进行培养，每天10h光照/14h黑暗；培养8周；

(3)增殖培养：

待步骤(2)中的无菌苗生长至3～5cm，截取中间的茎段部分，每段2cm长，继续扦插于新的培养基中，每个培养基中扦插5段，置于温度25℃，光照度2000lx的环境中进行增殖培养，每天10h光照/14h黑暗，得到3～5cm长的无菌扦插苗；培养的无菌苗可用于继续继代培养或提供生根培养的材料；培养六周后，萌发侧枝数为平均3.96条/茎段，平均侧枝长度为1.68cm，获得能够用于生根培养的材料为平均4.96条/茎段，24.8条/瓶；

(4)生根培养：

从步骤(3)中增殖培养得到的无菌扦插苗上，截取2cm长的顶端枝梢或截取2cm长的侧枝(保留茎尖部分)，扦插于新的培养基中，然后置于温度25℃，光照度2000lx的环境中进行生根培养，每天10h光照/14h黑暗；培养一周后可生长出白色健壮的根，培养1个月后，生根率达92％，苗高可达平均3.76cm/株；未生根的无菌苗，继续培养，直至生根和达到移栽条件；

(5)移栽

选取健壮的带根无菌苗(苗高3～5cm，有2～3条白色健壮根的无菌苗)，无需炼苗步骤(即打开培养瓶的盖子，让无菌苗适应外界环境)，将无菌苗根部的培养基清洗干净，种植于营养杯的混合基质中，压实基质；然后将营养杯放置于室内装有雾化装置和照明装置的培养架上，保证空气湿度85％以上，但叶片不积水，培养温度25℃±1℃，每日光照12h/12h黑暗；生长20天后，可放置于室外荫棚下，按花木杯苗的常规管理即可；待苗高15cm时，可以出圃；此时的移栽成活率是95％。具体流程见图1。

实施例2

(1)外植体材料的选择与处理：

天气晴朗时，在澳洲茶油树幼树上选取当年生、无病虫害、生长旺盛的、直径在1mm以下的幼嫩茎段；将幼嫩茎段剪成2cm长，置于自来水下，边搅拌边冲洗2h，在超净工作台上先用体积分数为75％的酒精进行表面消毒60s，然后用质量百分比为0.1％的HgCl₂消毒7min，用无菌水冲洗4次待用；

(2)首次无菌株系的建立：

将步骤(1)消毒处理后的幼嫩茎段截取成1cm长的茎段，然后按生长方向，垂直插入培养基中，每个培养基中扦插5段，置于温度25℃，光照度1500lx的环境中进行培养，每天10h光照/14h黑暗；培养13周；

(3)增殖培养：

待步骤(2)中的无菌苗生长至3～5cm，截取中间的茎段部分，每段1.5cm长，继续扦插于新的培养基中，每个培养基中扦插5段，置于温度25℃，光照度1500lx的环境中进行增殖培养，每天10h光照/14h黑暗，得到3～5cm长的无菌扦插苗；培养的无菌苗可用于继续继代培养或提供生根培养的材料；培养六周后，萌发侧枝数为平均3.91条/茎段，平均侧枝长度为1.605cm，获得能够用于生根培养的材料为平均4.91条/茎段，24.55条/瓶；

(4)生根培养：

从步骤(3)中增殖培养得到的无菌扦插苗上，截取1.5cm长的顶端枝梢或截取1.5cm长的侧枝(保留茎尖部分)，扦插于新的培养基中，然后置于温度25℃，光照度1500lx的环境中进行生根培养，每天10h光照/14h黑暗；培养一周后可生长出白色健壮的根，培养1.5个月后，生根率达93％，苗高可达平均4.02cm/株；未生根的无菌苗，继续培养，直至生根和达到移栽条件；

(5)移栽

选取健壮的带根无菌苗(苗高3～5cm，有2～3条白色健壮根的无菌苗)，无需炼苗步骤(即打开培养瓶的盖子，让无菌苗适应外界环境)，将无菌苗根部的培养基清洗干净，种植于营养杯的混合基质中，压实基质；然后将营养杯放置于室内装有雾化装置和照明装置的培养架上，保证空气湿度90％以上，但叶片不积水，培养温度25℃±1℃，每日光照12h/12h黑暗；生长20天后，可放置于室外荫棚下，按花木杯苗的常规管理即可；待苗高15cm时，可以出圃；此时的移栽成活率是95％。

实施例3

(1)外植体材料的选择与处理：

天气晴朗时，在澳洲茶油树幼树上选取当年生、无病虫害、生长旺盛的、直径在1mm以下的幼嫩茎段；将幼嫩茎段剪成2.5cm长，置于自来水下，边搅拌边冲洗1.5h，在超净工作台上先用体积分数为75％的酒精进行表面消毒40s，然后用质量百分比为0.1％的HgCl₂消毒6.5min，用无菌水冲洗7次待用；

(2)首次无菌株系的建立：

将步骤(1)消毒处理后的幼嫩茎段截取成1.5cm长的茎段，然后按生长方向，垂直插入培养基中，每个培养基中扦插5段，置于温度25℃，光照度1800lx的环境中进行培养，每天10h光照/14h黑暗；培养10周；

(3)增殖培养：

待步骤(2)中的无菌苗生长至3～5cm，截取中间的茎段部分，每段1cm长，继续扦插于新的培养基中，每个培养基中扦插5段，置于温度25℃，光照度1800lx的环境中进行增殖培养，每天10h光照/14h黑暗，得到3～5cm长的无菌扦插苗；培养的无菌苗可用于继续继代培养或提供生根培养的材料；培养六周后，萌发侧枝数为平均3.45条/茎段，平均侧枝长度为1.33cm，获得能够用于生根培养的材料为平均4.45条/茎段，22.25条/瓶；

(4)生根培养：

从步骤(3)中增殖培养得到的无菌扦插苗上，截取1cm长的顶端枝梢或截取1cm长的侧枝(保留茎尖部分)，扦插于新的培养基中，然后置于温度25℃，光照度1800lx的环境中进行生根培养，每天10h光照/14h黑暗；培养一周后可生长出白色健壮的根，培养2个月后，生根率达95％，苗高可达平均3.93cm/株；未生根的无菌苗，继续培养，直至生根和达到移栽条件；

(5)移栽

选取健壮的带根无菌苗(苗高3～5cm，有2～3条白色健壮根的无菌苗)，无需炼苗步骤(即打开培养瓶的盖子，让无菌苗适应外界环境)，将无菌苗根部的培养基清洗干净，种植于营养杯的混合基质中，压实基质；然后将营养杯放置于室内装有雾化装置和照明装置的培养架上，保证空气湿度95％以上，但叶片不积水，培养温度25℃±1℃，每日光照12h/12h黑暗；生长20天后，可放置于室外荫棚下，按花木杯苗的常规管理即可；待苗高15cm时，可以出圃；此时的移栽成活率是94％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)外植体材料的选择与处理：

选取澳洲茶油树幼树上直径在1mm以下的幼嫩茎段进行消毒处理；

(2)首次无菌株系的建立：

将步骤(1)消毒处理后的幼嫩茎段截取成1～2cm长的茎段，按生长方向，插入培养基中，进行培养；

(3)增殖培养：

待步骤(2)中的无菌苗生长至3～5cm，截取中间的茎段部分，再次插入新的培养基中，进行增殖培养，得到3～5cm长的无菌扦插苗；

(4)生根培养：

从步骤(3)中增殖培养得到的无菌扦插苗上，截取1～2cm长的顶端枝梢或截取1～2cm长的侧枝，扦插于新的培养基中进行生根培养；

(5)移栽：

选取健壮的带根无菌苗移栽至混合基质中进行培养；待苗高10～15cm时，出圃；

步骤(2)、(3)和(4)中所述的培养基的配方为：MS+40g/L蔗糖+1g/L活性炭+1mg/L NAA+8g/L琼脂，pH＝5.8～6.0。

2.根据权利要求1所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于：

步骤(2)、(3)和(4)中所述的培养的条件为：培养温度25℃±1℃，光照度1500～2000lx，每天10h光照/14h黑暗。

3.根据权利要求1所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的混合基质为：蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合得到。

4.根据权利要求1所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的健壮的带根无菌苗为苗高3～5cm，有2～3条白色健壮根的无菌苗。

5.根据权利要求1所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的幼嫩茎段为当年生、无病虫害、生长旺盛的、直径在1mm以下的幼嫩茎段。

6.根据权利要求1所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的消毒处理的具体操作为：将幼嫩茎段置于水中，冲洗1h～2h，然后用体积分数为70％～90％的酒精进行表面消毒30s～60s，再用质量百分比为0.1％的HgCl₂消毒6～7min，最后无菌水冲洗4～7次。

7.根据权利要求1所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的幼嫩茎段的长度为2cm～3cm。

8.根据权利要求1所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的培养的环境条件为：高湿度但叶片不积水、高光照、恒温25℃±1℃。

9.根据权利要求8所述的澳洲茶油树无菌扦插快繁育苗的方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的培养的环境条件为：培养环境置有雾化装置，空气湿度85～95％以上，但叶片不积水；培养温度25℃±1℃，每天12h光照/12h黑暗。