CN105075858A - 一种白及种子的液体快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白及种子的液体快速繁殖方法，步骤包括：（1）外植体的选择与消毒，（2）种子萌发及幼苗培养，（3）成苗培养，（4）炼苗和移栽；所述种子萌发及幼苗培养步骤具体为：将白及种子在液体培养基中培养，培养条件为：温度26±2℃，光照强度3000-3500Lx，光照时间为14-16小时/天，培养时间为45-60天。本发明可以将白及的种苗繁殖工厂化，在短时间内获得满足大规模生产所需要要的种苗，还有具有成本低、种苗生长整齐、炼苗驯化成活率高等特点。

Description

一种白及种子的液体快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及一种植物的快速繁殖方法，特别涉及一种白及种子的液体快速繁殖方法。

背景技术

高等植物的组培技术是指通过无菌操作分离植物体的一部分，接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其生成完整的植株。组织培养是本世纪发展起来的一门新技术，由于科学技术的进步，外源激素的广泛应用，使得组织培养不仅从理论上为相关学科提供了可靠的实验依据，而且成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法。植物组织培养具有培养条件可以人为控制，生长周期短、繁殖率高、成本低廉，能够较好的保存母本性状，管理方便，利于工厂化生产和自动化控制等优点在生产上越来越得到广泛的应用。

白及为多年生草本植物，又名连及草、甘根、紫蕙，全世界白及属植物有九种，我国有4种，即华白及、黄花白及、小白及、白及。其中白及为《中国药典》（1995、2005年版）所收载，性温、味苦、甘、辛。具有补肺、止血、散风除湿、通窍止痛、收敛止血、消肿生肌等功效，主要用于治疗感冒头痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带、肺伤咳血、衄血、金疮出血、痈疽肿毒、溃疡疼痛、手足皱裂等。未经人工选育的野生白及植株矮小，紫花白及高30cm，白及叶3-6片，长披针形，中部稍宽，先端尖。白及3月份萌发，花期4-5月，果期8-10月。12月倒苗。白及虽然结果，却不能依靠种子繁衍，成熟的白及种子呈橄榄形，黄色粉末状，细小，种皮为单层细胞组成，侧壁加厚，细胞器及原生质体消失，胚椭圆形，未分化，胚柄退化，无胚乳。自然状态下极少萌发。目前白及繁殖主要依靠块茎，长期的无性繁殖，不仅繁殖周期长，速度慢，而且需要的种源大，与药争夺原料。长期的无性繁殖容易引起种性退化，土地连年耕作，白及假鳞茎积累大量病毒，严重影响产量和品质，因此这种方式很难满足规模化种植的需求。

目前白及人工繁育研究工作进展缓慢，植物生长环节的奥秘往往超越绝大多数生产者的认识水平，白及家种只能以假鳞茎为种苗，必然面临种子苗稀缺的困境，大规模产业化种植依然遥不可及。

为此，有学者通过组织培养的方式，解决白及繁殖效率低和病毒感染等问题，一般是以成熟的种子为外植体，在有激素或者无激素的培养基上萌发，诱导形成愈伤，继代扩增或者诱导丛生芽增殖，成苗。一般白及组培可以包括五个步骤：

（1）外植体的选择与消毒。

（2）种子萌发。

（3）丛生芽诱导。

（4）成苗培养。

（5）炼苗和移栽。

虽然白及组培研究取得了一定的成绩，但是仍然存在以下问题：1，以白及假鳞茎、茎段为外植体，由于其含有大量内生菌和病毒，组培污染率高，成功率很低。2，以白及茎尖生长点和种子为外植体成功率虽然相对较高，但是从脱分化、增殖、分化、炼苗、移栽过程周期长，至少需要半年以上，期间需要转接数次，工作量大，成本高。而且技术含量高，对于从业人员的要求高，一般企业和药农种植户很难做到。所以，仍然没有从根本上解决白及种质资源问题，至今白及价格呈现上涨趋势。为此，寻求更好、更经济、更快捷的繁殖技术方法，扩大生产满足市场需求依然十分必要。

发明内容

本发明的目的在于解决白及繁殖效率低，白及组培操作繁琐，周期长的问题,提供一种白及种子的液体快速繁殖方法，可以将白及的种苗繁殖工厂化，在短时间内获得满足大规模生产所需要要的种苗，还有具有成本低、种苗生长整齐、炼苗驯化成活率高等特点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种白及种子的液体快速繁殖方法，步骤包括：（1）外植体的选择与消毒，（2）种子萌发及幼苗培养，（3）成苗培养，（4）炼苗和移栽；所述种子萌发及幼苗培养步骤具体为：将白及种子在液体培养基中培养，培养条件为：温度26±2℃，光照强度3000-3500Lx，光照时间为14-16小时/天，培养时间为45-60天。延长种子萌发的时间，由原先的2周延长到45-60天，在液体培养基上，直接培养形成长1.5-2cm，有少许根须的小苗。

作为优选，所述液体培养基配方为1/2MS，pH为5.8-6.4；液体培养基装于规格为650mL的培养瓶中，控制培养瓶中的液体量为250-300mL，每个培养瓶接种量为300-400颗白及种子。

作为优选，步骤（1）外植体的选择与消毒具体为：选用9月中旬至11月中旬，成熟未开裂的白及果荚，首先用0.3%-0.5%浓度的洗衣粉水溶液浸泡15-30分钟，然后在超净台内用75%乙醇消毒2-3分钟，再用0.1%升汞溶液消毒20-25分钟，装入无菌纸袋中，33±2℃烘干。此方法可以较好保存种子活力，方便取用。

作为优选，步骤（3）成苗培养采用的培养基配方为：MS，1.0-2.0mg/LIAA，1.0-3.0mg/L6-BA，香蕉泥60-100g/L，pH为5.6-6.4；培养条件为：温度28±2℃，光照强度3000-3500Lx，光照时间10-12小时/天，培养时间15-20天。本发明的方法能减少成苗培养过程中，母瓶在温室中培养的时间，只要小苗在培养基中适应一段时间后，就可以进行驯化。

作为优选，步骤（3）成苗培养采用的培养基配方为：MS，1.0mg/LIAA，2.0mg/L6-BA，香蕉泥80g/L，pH为5.6-6.4。

作为优选，步骤（4）炼苗和移栽为：将步骤（3）培养获得的白及瓶苗放置在遮阴大棚中，控制昼夜温度在10-35℃之间，培养30天后，将白及瓶苗根部的培养基洗净，浸泡消毒（用0.01%-0.05%浓度的高锰酸钾、1000倍液的多菌灵或者1000倍液的甲基托布津浸泡5分钟），阴凉处晾16-20小时，然后将白及瓶苗栽种到人工介质中培养，控制培养温度10-40℃，湿度80±5%。培养一个月后开始每周施叶面肥，叶面肥每周施肥两次，每次间隔3天为宜。1000倍液指1g多菌灵或甲基托布津加1000ml水。这样驯化成活率高，驯化成活率可达85%以上。

作为优选，所述人工介质分为三层，最底层铺一层刨花，中间铺农家肥，最上面一层由营养土与蛭石或珍珠岩按照2:1的重量比混匀而成，三层介质从上到下依次厚度依次为2cm，6cm，2cm。

本发明的方法在现有的白及组培技术的基础上，减少步骤（3）丛生芽诱导，以提高繁殖效率。也就是说，本发明在现有五步骤：（1）外植体选择与消毒；（2）种子的萌发；（3）丛生芽诱导；（4）成苗培养；（5）炼苗和移栽的基础上，延长种子萌发的培养时间，直接在液体中形成小苗，取代丛生芽诱导步骤，待种子形成高1.5-2cm，有少许须根的小苗后，将其转接到成苗培养基上进行成苗培养。并缩短成苗培养时期在组培温室的培养时间，培养2周后就转移到遮阴大棚中进行驯化，大大节省了电能的消耗。

经过本发明的改良，可以使组培周期缩短2个月左右，大大减少了在组培温室中培养的时间，减少了生产成本，而且由于炼苗时间也比改良前要长，使得驯化成活率要高于改良前，使得白及大规模工厂化生产成为可能。本方法中，采用种子为材料，保存方便，一次处理之后，可以随时取用，并且种子数目繁多，保证了材料的充足。

本发明的有益效果是：

1、本发明方法克服了传统繁殖方式周期长，速度慢，很难满足大规模生产需求的不足。可以使白及种苗繁殖工厂化，在短时间内繁殖出满足大规模生产所需要的种苗。

2、本发明具有成本低，操作简单的特点。由于在组培温室中放置时间缩短，减少了大量的电能消耗。而且减少了操作步骤，降低了操作难度，易于上手操作。

3、果荚保存方便，可以一年四季繁殖，而且种子数目繁多，保证了原料的充足。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

MS为现有常规的标准培养基，1/2MS就是指大量元素减半，其余元素与MS相同。

实施例1：

（1）外植体的选择与消毒：选取安徽紫花白及的成熟果荚（9月中旬至11月中旬）为外植体，用洗衣粉将表面污垢洗净，在超净台内，用75%乙醇消毒2分钟，倾出乙醇后用无菌水清洗3次。用0.1%升汞溶液消毒25分钟，无菌水清洗3次。污染率小于5%。

（2）种子的萌发：将白及种子均匀播撒在1/2MS液体培养基表面。每瓶300颗种子，温度26℃，光照强度3000Lx，光照时间16小时/天，培养时间60天。种子萌发率大于90%。

（3）成苗培养：将漂浮的白及小苗从母瓶中转移到MS+2.0mg/L6-BA（市售）+1.0mg/LIAA（市售）+香蕉泥（市售）80g/L的固体培养基中（pH5.6-6.4），培养温度28℃，光照强度3000Lx，光照时间12小时/天，培养时间20天。

(4)炼苗有驯化：瓶苗在遮阴大棚中炼苗30天，控制昼夜温度在10-35℃之间，然后洗净培养基，多菌灵浸泡5分钟后，阴凉处晾干16小时。种植到人工介质中，人工介质由粗刨花、农家肥、营养土、蛭石或珍珠岩配比而成。具有分为三层，最底层铺一层刨花，中间铺农家肥6cm，最上面一层由营养土：蛭石（2:1）混匀而成，厚度在2cm左右。驯化温度在10-40℃之间，湿度80±5%。成活率达到95%以上。

实施例2：

（1）外植体的选择与消毒：选取安徽紫花白及的成熟果荚（9月中旬至11月中旬）为外植体，用洗衣粉将表面污垢洗净，在超净台内，用75%乙醇消毒3分钟，倾出乙醇后用无菌水清洗3次。用0.1%升汞溶液消毒20分钟，无菌水清洗5次。污染率小于5%。

（2）种子的萌发：将白及种子均匀播撒在1/2MS液体培养基表面。每瓶400颗种子，温度26℃，光照强度3500Lx，光照时间14小时/天，培养时间45天。种子萌发率大于90%。

（3）成苗培养：将漂浮的白及小苗从母瓶中转移到MS+1.0mg/L6-BA+2.0mg/LIAA+香蕉泥60g/L的固体培养基中（pH5.6-6.4），培养温度28℃，光照强度3500Lx，光照时间10小时/天，培养时间15天。

(4)炼苗有驯化：瓶苗在遮阴大棚中炼苗30天，控制昼夜温度在10-35℃之间，然后洗净培养基，多菌灵浸泡5分钟后，阴凉处晾干20小时。种植到人工介质中，人工介质由粗刨花、农家肥、营养土、蛭石或珍珠岩配比而成。具有分为三层，最底层铺一层刨花，中间铺农家肥6cm，最上面一层由营养土：珍珠岩（2:1）混匀而成，厚度在2cm左右。驯化温度在10-40℃之间，湿度80±5%。成活率达到95%以上。

实施例3：

（1）外植体的选择与消毒：选取安徽紫花白及的成熟果荚（9月中旬至11月中旬）为外植体，用洗衣粉将表面污垢洗净，在超净台内，用75%乙醇消毒2分钟，倾出乙醇后用无菌水清洗3次。用0.1%升汞溶液消毒25分钟，无菌水清洗4次。污染率小于5%。

（2）种子的萌发：将白及种子均匀播撒在1/2MS液体培养基表面。每瓶350颗种子，温度26℃，光照强度3000Lx，光照时间15小时/天，培养时间50天。种子萌发率大于90%。

（3）成苗培养：将漂浮的白及小苗从母瓶中转移到MS+3.0mg/L6-BA+1.0mg/LIAA+香蕉泥100g/L的固体培养基中（pH5.6-6.4），培养温度28℃，光照强度3000Lx，光照时间11小时/天，培养时间18天。

(4)炼苗有驯化：瓶苗在遮阴大棚中炼苗30天，控制昼夜温度在10-35℃之间，然后洗净培养基，多菌灵浸泡5分钟后，阴凉处晾干18小时。种植到人工介质中，人工介质由粗刨花、农家肥、营养土、蛭石或珍珠岩配比而成。具有分为三层，最底层铺一层刨花，中间铺农家肥6cm，最上面一层由营养土：蛭石（2:1）混匀而成，厚度在2cm左右。驯化温度在10-40℃之间，湿度80±5%。成活率达到95%以上。

经过本发明的改良，可以使组培周期缩短2个月左右，大大减少了在组培温室中培养的时间，减少了生产成本，而且由于炼苗时间也比改良前要长，使得驯化成活率要高于改良前，使得白及大规模工厂化生产成为可能。本方法中，采用种子为材料，保存方便，一次处理之后，可以随时取用，并且种子数目繁多，保证了材料的充足。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (7)

1.一种白及种子的液体快速繁殖方法，其特征在于，步骤包括：（1）外植体的选择与消毒，（2）种子萌发及幼苗培养，（3）成苗培养，（4）炼苗和移栽；所述种子萌发及幼苗培养步骤具体为：将白及种子在液体培养基中培养，培养条件为：温度26±2℃，光照强度3000-3500Lx，光照时间为14-16小时/天，培养时间为45-60天。

2.根据权利要求1所述的液体快速繁殖方法，其特征在于：所述液体培养基配方为1/2MS，pH为5.8-6.4；液体培养基装于规格为650mL的培养瓶中，控制培养瓶中的液体量为250-300mL，每个培养瓶接种量为300-400颗白及种子。

3.根据权利要求1或2所述的液体快速繁殖方法，其特征在于：步骤（1）外植体的选择与消毒具体为：选用9月中旬至11月中旬，成熟未开裂的白及果荚，首先用0.3%-0.5%浓度的洗衣粉水溶液浸泡15-30分钟，然后在超净台内用75%乙醇消毒2-3分钟，再用0.1%升汞溶液消毒20-25分钟，装入无菌纸袋中，33±2℃烘干。

4.根据权利要求1或2所述的液体快速繁殖方法，其特征在于：步骤（3）成苗培养采用的培养基配方为：MS，1.0-2.0mg/LIAA，1.0-3.0mg/L6-BA，香蕉泥60-100g/L，pH为5.6-6.4；培养条件为：温度28±2℃，光照强度3000-3500Lx，光照时间10-12小时/天，培养时间15-20天。

5.根据权利要求4所述的液体快速繁殖方法，其特征在于：步骤（3）成苗培养采用的培养基配方为：MS，1.0mg/LIAA，2.0mg/L6-BA，香蕉泥80g/L，pH为5.6-6.4。

6.根据权利要求1或2所述的液体快速繁殖方法，其特征在于：步骤（4）炼苗和移栽为：将步骤（3）培养获得的白及瓶苗放置在遮阴大棚中，控制昼夜温度在10-35℃之间，培养30天后，将白及瓶苗根部的培养基洗净，浸泡消毒，阴凉处晾16-20小时，然后将白及瓶苗栽种到人工介质中培养，控制培养温度10-40℃，湿度80±5%。

7.根据权利要求6所述的液体快速繁殖方法，其特征在于：所述人工介质分为三层，最底层铺一层刨花，中间铺农家肥，最上面一层由营养土与蛭石或珍珠岩按照2:1的重量比混匀而成，三层介质从上到下依次厚度依次为2cm，6cm，2cm。