CN104067939A - 一种龙胆的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

一种龙胆的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：(1)取龙胆为开裂果实作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体在超净工作台拨开，将种子抖落到MS培养基上诱导发芽得到无菌试管苗；(3)将所述无菌试管苗置于MS繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽；(4)将所述丛生芽置于MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；(5)取完整的带根苗进行炼苗后移植于苗床生长一个月，再移栽至大田。采用本发明所述的培养方法得到的龙胆丛生芽增殖系数达到15-20倍，获得的组培苗生根率达到99.5％，移栽苗床成活率达到98％，有效解决了龙胆的规模化育苗问题。

Description

一种龙胆的组织培养快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种龙胆的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
龙胆，拉丁学名Gentiana scabra Bunge，也称龙胆草，胆草、草龙胆、山龙胆，为龙胆科龙胆属多年生草本植物，为药材龙胆草的基源植物之一，以根与根茎入药，具有清肝胆、泻下焦湿热等功效，主要用于治疗能治头胀头疼、目赤肿疼、湿热黄疸、小便淋疼、阴肿阴痒、带下、抽搐、惊风等疾病。现代研究认为其主要有效成分为龙胆苦苷具有抗炎、镇痛、耐缺氧，以及抗疲劳等作用。
龙胆草是我国大宗常用中药材，市场需求量大，长期供不应求，在过去三十几年一直列入国家和省管理的统配品种，但鲜有人工种植，主要来源于野生资源。近年来，由于乱垦、乱牧、乱采挖致使野生资源遭到严重破坏，药材的蕴藏量越来越少，野生资源趋于枯竭，可能有绝种的危险，因此于1989年被列入国家重点发展的保护品种，是重点推荐发展的63种紧缺中药材之一。为了保护珍贵的野生资源，促进龙胆的可持续发展，满足市场的需求，需要加快推进龙胆的中药产业现代化进程，寻找更加快速的繁苗方法，以推动人工种植的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种龙胆的组织培养快速繁殖方法，它能够提高龙胆种苗的繁殖速度和质量，实现龙胆优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种龙胆的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取龙胆的成熟为开裂果实作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒10-12min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体在超净工作台上剥开，将种子抖落到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含0.2mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含0.5-2.5mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、0.1-0.3mg/L的吲哚乙酸IAA、0.0-0.2mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(4)丛生芽生根培养：将步骤(3)中得到的丛生芽切成带顶芽或叶芽的茎段，置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中1/2MS生根培养基中含0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.3mg/L的生根粉ABT、0-0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)炼苗与移栽：步骤(4)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到苗床中，在苗床中生长一个月后移栽大田。
移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率为60％。
本发明的突出优点在于：
(1)采用组织培养技术繁育龙胆种苗具有繁殖速度快、种苗质量均一，且不受时间、空间、季节限制等突出优点，缩短了种苗繁育周期，提高了种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
(2)在本发明所述的培养体系上得到的龙胆丛生芽增殖系数达到15-20倍，丛生芽健康粗壮，无玻璃化现象，接种到含有生根粉吲哚乙酸IAA、生根粉ABT的1/2MS生根培养基上，获得的组培苗生根率达到99.5％，炼苗后移栽苗床成活率达到98％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
本发明所述的龙胆的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取龙胆的成熟为开裂果实作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒10-12min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体在超净工作台上剥开，将种子抖落到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含0.2mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含表1所列的不同浓度的苄基腺嘌呤6-BA、吲哚乙酸IAA、和激动素KT，以及30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。由表1的结果看出，苄基腺嘌呤6-BA对龙胆丛生芽的亚增殖倍率具有显著影响，随着苄基腺嘌呤6-BA浓度的增加，亚增殖倍率迅速增加。三种激素对龙胆亚增殖倍率的影响顺序为A>C>B，最佳配比为A3B2C3，即MS培养基中添加2.5mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA和0.2mg/L的激动素KT增殖效果最好，增殖倍率达到20倍以上。
表1 不同激素对龙胆组织培养快速繁殖效果的影响
注：1.芽增殖倍数＝(30天后芽数－接种时芽数)/接种时芽数(4)试管苗生根培养：将步骤(3)中得到的丛生芽切成带顶芽或腋芽的茎段，置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株。其中1/2MS生根培养基中含表2所列的不同浓度的吲哚乙酸IAA、生根粉ABT和萘乙酸NAA，以及30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；由表2得到结果看出，不同的激素浓度对龙胆生根率的影响不同，三种激素对龙胆生根率的影响顺序为A>B>C，最佳配比为A3B2C1，即1/2MS培养基中添加0.5mg/L的吲哚乙酸IAA和0.2mg/L的生根粉ABT生根效果最好，生根率达99.5％。
表2 不同激素浓度对龙胆组培苗生根效果的影响
(5)炼苗与移栽：步骤(4)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到苗床中，在苗床中生长一个月后移栽大田。

Claims (1)

1.一种龙胆的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取龙胆的成熟为开裂果实作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒10-12min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水，
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体在超净工作台上剥开，将种子抖落到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含0.2mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含0.5-2.5mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、0.1-0.3mg/L的吲哚乙酸IAA、0.0-0.2mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(4)丛生芽生根培养：将步骤(3)中得到的丛生芽切成带顶芽或叶芽的茎段，置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中1/2MS生根培养基中含0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.3mg/L的生根粉ABT、0-0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(5)炼苗与移栽：步骤(4)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到苗床中，在苗床中生长一个月后移栽大田。
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