CN111165352A - 一种滇龙胆航天育种组培育苗新方法 - Google Patents

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杨绍兵
张金渝
左应梅
杨美权
杨天梅
简邦丽
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Abstract

本发明基于滇龙胆航天育种种子发芽率低、扦插繁殖率低的特点，提供一种滇龙胆组培育苗新方法，主要包括外植体的选择与消毒、丛生芽的诱导、丛生芽的增殖、生根苗的培养。本方法简单易行，具有繁殖周期短、繁殖率高、能有效稳定母株性状等优点，是规模化生产滇龙胆具稳定性状的太空种的最有效途径。

Description

一种滇龙胆航天育种组培育苗新方法
技术领域
本发明涉及花卉及中药材的生物技术领域，特别涉及一种滇龙胆航天育种的组织培养方法。
技术背景
滇龙胆（GentianarigescensFranch.）属于龙胆科龙胆属植物，是《中华人民共和国药典》收录药材龙胆的植物基源之一，亦是西南地区龙胆药材最主要的来源。滇龙胆以根入药，主产云南、四川等地，具有清热燥湿，泻肝胆火的功效，主要用于湿热黄疸，阴肿阴痒，带下，湿疹瘙痒，肝火目赤，耳鸣耳聋，胁痛口苦，强中，惊风抽搐等症。现代研究认为其主要有效成分为龙胆苦苷具有抗炎、镇痛、耐缺氧，以及抗疲劳等作用。
2013年6月滇龙胆种子随“神十”进入太空，经过不定向变异后获得200余个不同性状母本，通过花色、株型、药材产量以及有效成分含量筛选后，获得高质性状母本40余个，可用于高品质药材的生产。
虽然滇龙胆种子产量大，但龙胆种子小（千粒重仅20mg左右），种子成熟度非常低，使得种子发芽率极低，而滇龙胆航天育种种子结籽率及发芽率更低，使得滇龙胆航天种不能有效保存及扩繁，另一方面，由于滇龙胆属于异花杂交，子代与母本性状经异株杂交将存在较大差异，不能形成稳定性状，使得滇龙胆种子繁殖不能成为滇龙胆太空种繁殖的最佳方式，而扦插繁殖和分株繁殖亦存在繁殖率极低，繁殖周期长的劣势。因此利用传统技术无法在短期内获得性状稳定、数量充足的滇龙胆太空种。采用组培繁育技术进行滇龙胆航天育种育苗，不仅能在短期内获得充足苗，还可最大程度的保证母本性状的稳定性。
发明内容
本发明针对以上所述的滇龙胆航天育种传统繁殖方法的不足，发明了一种组分简单、成本低廉、操作简便、生产周期短，可直接批量生产不同滇龙胆航天育种变异种的组织培养技术。
本发明是通过以下方案实现的：
（1）外植体的选择：选择健康无病虫害枝条，采枝条端部20cm内的嫩枝作为外植体；
（2）外植体的清洁：将步骤（1）所得的外植体去叶，并剪成1~2cm的带芽茎段，置于饱和肥皂水中涮洗10min，后用自来水冲洗3~4次，最后用流水冲淋1h；
（3）外植体的消毒：将步骤（2）所得的外植体在超净工作台内，加入75%的酒精振摇15~20s，用无菌水涮洗3~4次，再加入饱和漂白粉溶液振摇28~32min，用无菌水涮洗3~4次，最后加入0.05%升汞溶液振摇9~11min，用无菌水涮洗6~7次，外植体培养7天污染率为17%；
（4）诱导培养：将步骤（3）所得的外植体去除两头伤口，接种于MS+KT 5.0~10.0mg/L+TDZ 0.05~0.15mg/L+NAA0.01~0.05mg/L诱导培养基中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养40天，丛生芽诱导率为68%；
（5）增殖培养：将步骤（4）所得的诱导芽接种于MS+KT5.0~10.0mg/L+ZT0.01~0.05mg/L增殖培养基中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养25天，增殖系数为6.0；
（6）生根培养：将步骤（4）或步骤（5）所得的诱导芽或增殖芽接种于1/2MS+NAA0.5~1mg/L+IAA0.5~1.0mg/L+IBA1.0~ 4.0mg/L+AC1.0g/L的生根培养基中，置于温度25℃，光强3000lx、光暗12:12h交替的环境下培养25天，获得生根组培苗，生根率为94%。
本发明的有益效果在于
（1）本发明采用组培快繁技术，组分简单，操作简便，成本低廉，在室内控温控光控营养条件下进行，繁殖育苗不受地域及季节限制；
（2）本发明采用的组培快繁技术，初代污染率为17%左右，较其他滇龙胆组培技术的初代污染率低10~20%,45天初代诱导率为68%左右，较其他滇龙胆组培技术的初代诱导率提高5~20%，25天继代增殖系数为6.0，较其他滇龙胆组培技术的增殖系数高0.5~1.5,25天根诱导率为94%，与其他滇龙胆组培技术类似，但苗更健壮、驯化移栽成活率更高；
（3）本发明针对的是滇龙胆的航天种，是搭载神十进入太空后经太空诱变获得的若干新种，与传统的滇龙胆的生理特征存在极大差异，具体表现为其种子结籽率、发芽率远低于传统滇龙胆，而现有的组培技术在滇龙胆航天种的应用不及本发明。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明做进一步的说明。
实施例1：在滇龙胆航天育种选育基地，将滇龙胆航天育种所选育的品种MB12提前一月用50%多菌灵1000倍液喷雾健康无病虫害植株并套袋以降低带菌量，采集外植体时将降到置于75%酒精中浸泡10s以上，剪取端部10cm以内枝条；
在实验室将枝条去叶并剪成1~2cm左右的带芽茎段，在饱和肥皂水中涮洗10min，并用自来水冲洗3~4次至表面无泡沫，后开小流水冲淋1小时；
将清洁好的茎段在超净工作台内转移至无菌瓶内，加入75%酒精并振摇20s，用无菌水涮洗3~4次，加入饱和漂白粉溶液并振摇30min，用无菌水涮洗3~4次，转移至另一无菌瓶中，加入0.05%升汞溶液并振摇10min，用无菌水冲洗7次，外植培养7天污染率为18.2%；
将消毒好的外植体按生理极性斜插于诱导培养基MS+KT 5.0mg/L+TDZ 0.05mg/L+NAA0.01mg/L中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养45天，获得健壮诱导芽，诱导率为64.6%；
将诱导出的丛生芽剪成具1~2芽茎段，按极性斜插于增殖培养基MS+KT 10.0mg/L+ZT0.01mg/L中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养25天，获得大量健壮丛生芽，增殖系数为5.91；
将增殖芽剪成具2~3芽茎段，按极性之差于生根培养基1/2MS+NAA1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+IBA 4.0mg/L+AC 1.0g/L中，置于温度25℃，光强3000lx、光暗12:12h交替的环境下培养25天，获得生根苗，根系一般为2~3根，根粗壮，生根率为93.3%。
实施例2：
在滇龙胆航天育种基地，将滇龙胆航天育种所选育的品种Z~1~2提前一月用50%多菌灵1000倍液喷雾健康无病虫害植株并套袋以降低带菌量，采集外植体时将降到置于75%酒精中浸泡10s以上，剪取端部20cm以内枝条；
在实验室将枝条去叶并剪成1~2cm左右的带芽茎段，在饱和肥皂水中涮洗10min，并用自来水冲洗3~4次至表面无泡沫，后开小流水冲淋1小时；
将清洁好的茎段在超净工作台内转移至无菌瓶内，加入75%酒精并振摇15s，用无菌水涮洗3~4次，加入饱和漂白粉溶液并振摇32min，用无菌水涮洗3~4次，转移至另一无菌瓶中，加入0.05%升汞溶液并振摇11min，用无菌水冲洗7次，外植培养7天污染率为16.5%；
将消毒好的外植体按生理极性斜插于诱导培养基MS+KT 8.0mg/L+TDZ 0.10mg/L+NAA0.05mg/L中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养45天，获得健壮诱导芽，诱导率为71.2%；
将诱导出的丛生芽剪成具1~2芽茎段，按极性斜插于增殖培养基MS+KT 10.0mg/L+ZT0.05mg/L中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养25天，获得大量健壮增殖芽，增殖系数为6.2；
将增殖芽剪成具2~3芽茎段，按极性之差于生根培养基1/2MS+NAA 0.5mg/L+IAA0.5mg/L+IBA 2.0mg/L+AC 1.0g/L中，置于温度25℃，光强3000lx、光暗12:12h交替的环境下培养25天，获得生根苗，根系大多为2~4根，根粗壮，生根率为95.4%。
实施例3：在滇龙胆航天育种基地，将滇龙胆航天育种所选育的品种MB24，提前一月用50%多菌灵1000倍液喷雾健康无病虫害植株并套袋以降低带菌量，采集外植体时将降到置于75%酒精中浸泡10s以上，剪取端部20cm以内枝条；
在实验室将枝条去叶并剪成1~2cm左右的带芽茎段，在饱和肥皂水中涮洗10min，并用自来水冲洗3~4次至表面无泡沫，后开小流水冲淋1小时；
将清洁好的茎段在超净工作台内转移至无菌瓶内，加入75%酒精并振摇20s，用无菌水涮洗3~4次，加入饱和漂白粉溶液并振摇30min，用无菌水涮洗3~4次，转移至另一无菌瓶中，加入0.05%升汞溶液并振摇10min，用无菌水冲洗7次，外植培养7天污染率为16.0%；
将消毒好的外植体按生理极性斜插于诱导培养基MS+KT 5.0mg/L+TDZ 0.05mg/L+NAA0.01mg/L中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养45天，获得健壮诱导芽，诱导率为71.2%；
将诱导出的丛生芽剪成具1~2芽茎段，按极性斜插于增殖培养基MS+KT 10.0mg/L+ZT0.01mg/L中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养25天，获得大量健壮丛生芽，增殖系数为6.8；
将增殖芽剪成具2~3芽茎段，按极性之差于生根培养基1/2MS+NAA1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+IBA 4.0mg/L+AC 1.0g/L中，置于温度25℃，光强3000lx、光暗12:12h交替的环境下培养25天，获得生根苗，根系大多为2~4根，根粗壮，生根率为94.8%。

Claims (5)

1.滇龙胆航天育种组培育苗新方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与清洁消毒：取滇龙胆太空种植株端部20cm以内健康茎，去叶后剪成1cm左右的带芽茎段，用肥皂水涮洗10min后自来水冲洗1小时以上，依次用75%酒精、饱和漂白粉溶液、0.05%升汞溶液消毒；
（2）丛生芽的诱导：将步骤（1）所得的外植体接种于含KT、TDZ、NAA的MS培养基中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养40天，诱导丛生芽；
（3）丛生芽的增殖：将步骤（2）所得的诱导芽接种于含KT、ZT的MS培养基中，置于温度25℃，光强2000lx、光暗12:12h交替的环境下培养45天，获得增殖芽；
（4）增殖芽的生根：将步骤（1）或步骤（2）所得的诱导芽或增殖芽接种于含NAA、IAA、IBA的1/2MS培养基中，置于温度25℃，光强3000lx、光暗12:12h交替的环境下培养35天，获得生根组培苗。
2.根据权利要求1所述的滇龙胆航天育种组培育苗新方法，其特征在于75%酒精振摇15~20s，饱和漂白粉溶液振摇28~32min，0.05%升汞溶液振摇9~11min。
3.根据权利要求1所述的滇龙胆航天育种组培育苗新方法，其特征在于步骤（2）所述的丛生芽诱导培养基为MS+KT 5.0~10.0mg/L+TDZ 0.05~0.15mg/L+NAA0.01~0.05mg/L。
4.根据权利要求1所述的滇龙胆航天育种组培育苗新方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为MS+KT5.0~10.0mg/L+ZT0.01~0.05mg/L。
5.根据权利要求1所述的滇龙胆航天育种组培育苗新方法，其特征在于步骤（4）所述的生根培养基为1/2MS+NAA0.5~1mg/L+IAA0.5~1.0mg/L+IBA1.0~ 4.0mg/L+AC 1.0g/L。
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