CN102301951B - 一种广豆根组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种广豆根的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：(1)取广豆根种子作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导发芽得到无菌试管苗；(3)将所述无菌试管苗置于MS繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽；(4)将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株；(5)将所述健壮植株置于MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；(6)取完整的带根苗进行炼苗后移植于沙床生长一个月，再移栽至大田。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量广豆根的优质种苗，有效解决了广豆根的规模化育苗问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种广豆根组织培养快速繁殖方法。
背景技术
广豆根，也称山豆根、南豆根，为豆科植物越南槐(Sophora tonkinensis Gapnep.)的干燥根及根茎，分布于我国南部，以广西产量最大。具有清火解毒、消肿止痛等功效，可以治疗喉痈、喉风、喉痹、牙龈肿痛、喘满热咳、肝炎、便秘、黄疸、下痢、痔疾、秃疮、疥癣及蚊、虫、犬咬伤等。医药工业用广豆根作为原料，大量研制开发治疗肝炎的针剂、咽喉肿痛的片剂以及抗肿瘤的中成药。
广豆根地域分布范围相当有限，且常零星生长于石山岩缝之中，随着市场需求量的不断增加，野生广豆根资源濒临枯竭。在自然条件下，广豆根主要依靠种子进行繁育，但在开花结荚期广豆根的病虫害严重，且种子成熟时自然脱落的特性常造成种子产量低，生产上难以实现大面积栽培。采用生物技术组织培养技术，可以有效快速地提高广豆根种苗的繁殖速度和质量，实现广豆根优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种广豆根组织培养快速繁殖方法，它能够快速繁殖出大量适合移栽的优良广豆根种苗、满足生产需要。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种广豆根组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取广豆根种子作为外植体，依次用洗洁精水溶液浸泡5min、自来水冲洗15-30min、2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含0.5mg/L的6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含1.5mg/L的6-BA、0.3mg/L的IAA、0.5mg/L的KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中含1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(5)健壮植株生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基中含1.5mg.L的IAA、0.5mg/L的ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(6)炼苗与移栽：步骤(5)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率为60％。
本发明的突出优点在于：
(1)广豆根的资源分布地域狭窄，常生长于石山岩缝之中，自然状态下繁殖能力非常低，在自然生长条件下，广豆根开花结荚期易受到病虫害的危害，而且种子成熟时容易自然脱落，种子产量低，以种子作为繁殖材料的人工栽培难以实现大面积栽培，致使野生资源蕴藏量不断降低。但市场需求却不断增加，过度的采挖造成广豆根野生资源濒临枯竭。因此进行广豆根的组织培养快速繁殖是解决广豆根种苗繁殖问题的有效途径。本发明通过生物技术对广豆根进行组织培养快速繁殖，在短时间内培育出大量可供大田栽培的广豆根幼苗，显著提高了广豆根种苗的繁殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
(2)在MS繁殖培养基中添加1.0-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA和0.3-0.5mg/L的激动素可促进丛生芽的分化；添加浓度为0.3-0.5mg/L的生长激素吲哚乙酸IAA可促进丛生芽的生长；
在MS壮苗培养基中添加浓度为1.0mg/L的6-BA和0.3-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA可促进丛生芽茎段木质化的发生及叶片的展开；
在MS生根培养基上组合使用浓度为1.5mg/L的生长激素IAA和0.3-0.5mg/L生根粉ABT，可获得带根的完整植株，这些植株经炼苗后可直接移栽沙床。
(3)采用本发明所述的培养方法，得到的单芽增殖系数达到8-10倍，获得的组培苗生根率在95％以上，每株平均带3-4个根，根长为3-5厘米，移栽沙床成活率在98％以上；快速、便捷、高效地进行广豆根组织培养，实现广豆根组培种苗的规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
一种广豆根组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取饱满的广豆根种植作为外植体，依次用洗洁精水溶液浸泡5min、自来水冲洗15-30min、0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分；其中每升0.1％升汞中加2-3滴吐温-20；
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)中得到的外植体接种到MS培养基中培养30天，种子发芽后获得无菌试管苗；培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天；其中MS培养基中含0.5mg/L的6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中培养30天得到大量试管苗丛生芽，培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天；其中MS繁殖培养基中含有不同浓度的6-BA、IAA、和KT，见表1，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂外，培养基的pH值为5.8。从表1数据分析看出，6-BA和IAA对广豆根丛生芽的生长率具有显著影响，根据生长率指标确定的最适培养基激素浓度为1.5mg/L的6-BA，0.5mg/L的IAA和0.5mg/L的KT；6-BA和KT对广豆根丛生芽的芽增殖倍率具有显著影响，根据芽增殖倍率确定的最适培养基激素浓度为1.5mg/L的6-BA，0.5mg/L的IAA和0.5mg/L的KT；
表1 不同激素对广豆根组织培养快速繁殖效果的影响
注：1.生长率＝(30天后材料重-接种时材料重)/接种时材料重
2.芽增殖倍数＝(30天后芽数-接种时芽数)/接种时芽数
(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中培养30天得到健壮植株，培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天；其中MS壮苗培养基中含1.0mg/L的6-BA和不同浓度的IAA，见表2，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。从表2结果看出，随着壮苗培养基中IAA浓度增加，广豆根植株的高度和分枝数均增加，而且经过壮苗后得到的植株叶片舒展，木栓化程度较高，适合进行生根培养；
表2 不同激素水平对广豆根丛生芽壮苗效果的影响
(5)试管苗生根培养：将步骤(4)中得到的丛生芽置于MS生根培养基中培养20天得到带根的完整植株，培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天；其中MS生根培养基中含1.5mg/L的IAA和不同浓度的ABT，见表3，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；从表3结果看出，随着培养基中ABT浓度增加，组培苗的生根率也增加；培养基中添加1.5mg/L的IAA和0.5mg/L的ABT生根效果最好，生根率达96.8％；
表3 不同激素水平对广豆根组培苗生根效果的影响
(6)炼苗与移栽：获得带根的完整植株后，在室温为25℃左右的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中；试管苗在沙床中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率60％。
Claims (1)
1.一种广豆根组织培养快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取广豆根种子作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含0.5mg/L的6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含1.5mg/L的6-BA、0.3mg/L的IAA、0.5mg/L的KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中含1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(5)健壮植株生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基中含1.5mg/L的IAA、0.5mg/L的ABT生根粉、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，
(6)炼苗与移栽：步骤(5)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽大田。
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