CN108552057B - 一种黄梁木高效再生体系建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄梁木高效再生体系建立的方法，包括外植体采集及处理、外植体启动培养及丛生芽诱导、丛生芽继代增殖、壮苗培养、生根培养、生根苗炼苗及移栽。本发明所提供的黄梁木高效再生体系建立的方法，步骤简单，苗木生长整齐健壮，增殖倍率高且稳定，生根苗移栽成活率高，所生产苗木造林效果良好。本发明以黄梁木离体培养技术为手段，通过培养基配方优化、培养环境控制及组培苗生长状态等方面的技术控制，实现了黄梁木离体高效再生，适用于黄梁木的商业化育苗生产。
Description
技术领域
本发明属于植物栽培领域，具体涉及一种基于黄梁木离体培养技术的高效再生体系建立方法。
背景技术
黄梁木为茜草科团花属阔叶乔木，为著名速生树种。在广东省肇庆市、广西壮族自治区百色市等地有原始分布，华南各省均有引种栽培。黄梁木幼树期生长迅速，7-8年可砍伐使用，其单位面积内木材有效材积为桉树的2倍以上。黄梁木原木木材基本密度略低于桉树，加工性能和用途与桉树类似，原木市场价格为桉树的1.2-1.5倍，单位面积经济效益为桉树的2.4-3.0倍。在适生区域应用黄梁木作为桉树人工林的搭配树种，可在保证林农经济利益前提下，迅速有效降低桉树单一树种大面积造林所带来的生态风险，具备广泛的推广应用前景。
黄梁木现行繁殖方法，多为种子播种实生苗，其采种树树体高大且种子产量低、采种困难；其次，异花授粉植物实生苗现状分离严重，高度参差不齐，造林整齐度差。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种能实现黄梁木优势单株无性系化、良种苗木稳定快速繁殖、适合集约化经营的黄梁木高效再生体系建立的方法。
本发明为了达到其目的，采用的技术方案如下，一种黄梁木高效再生体系建立的方法，其步骤包括：
(1)外植体采集
选择树龄4年以上黄梁木优选单株。回缩修剪，至主干离地0.8-1.2米高度。培养时间为35-45天。将主干潜伏芽萌发的萌芽条剪下，剪叶后，获得外植体。
优选的，采集时间为10月到11月。
优选的，所述萌芽条为顶芽苞片未打开的萌芽条，且所述萌芽条生长至8-12厘米。
优选的，主干潜伏芽萌发的萌芽条剪下，保留萌芽条的叶柄长度0.8-1.2厘米，剪叶后，获得外植体。
优选的，需要对获得的外植体进行保湿处理。
特别优选的，所述保湿处理为将外植体用洁净湿纱布包裹。
(2)外植体处理
将步骤(1)获得的外植体进行灭菌处理。将灭菌处理后的外植体进行切割，将顶芽接种于不含激素的MS培养基，培养时间为10-15天。保留未污染的顶芽。
优选的，所述切割，包括将带苞片的顶芽沿原叶柄处挖出，纵切，剥离苞片。
优选的，步骤(2)中所述灭菌处理，包括将所述外植体置于消毒液I中浸泡20-40分钟，不经漂洗，直接转移至消毒液II中浸泡15-25分钟，使用无菌水漂洗。
优选的，所述消毒液I为饱和漂白粉溶液或1％高锰酸钾溶液；所述消毒液II为0.1％升汞溶液。
(3)外植体培养及丛生芽诱导
将步骤(2)获得的未污染的顶芽，转移至启动培养基，培养温度25-28℃，光照时间每天10-14h，光照强度500-8001x，培养时间为25-35天。将外植体切割为带1-2对侧芽的茎段I，剔除愈伤组织分化形成的芽，将所述茎段I接种于启动培养基，培养时间为28-35天。茎段I腋芽或二级侧枝腋芽萌发形成丛生芽，剔除愈伤组织分化形成的芽，获得丛生芽。所述丛生芽呈簇生状。
优选的，所述启动培养基，其配方为3/4MS+6-BA 1.0mg/L+TDZ 0.1mg/L。
(4)丛生芽继代增殖
将步骤(3)获得的丛生芽，进行继代培养步骤，获得增殖丛生芽。
所述继代培养步骤，包括将丛生芽切碎成带1-2对芽的茎段II，接种于继代培养基培养；培养温度25-28℃，光照时间每天11-13h，光照强度500-8001x，培养周期25-35天。
优选的，所述继代培养步骤重复至少一次。
特别优选的，所述继代培养步骤重复4-10次，可以快速获得大量的增殖丛生芽。
所述丛生芽和所述增殖丛生芽均呈簇生状。
优选的，所述继代培养基，其配方为3/4MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L。
(5)壮苗培养
将步骤(4)获得的增殖丛生芽，切碎成带1-2对芽的茎段III，接种于壮苗培养基培养。培养温度25-28℃，光照时间每天11-13h，光照强度800-12001x，培养时间为25-35天。获得单芽。
优选的，所述单芽为茎段III萌发出高3-4厘米的芽。
所述壮苗培养基，其配方为改良MS+6-BA 0.02mg/L+AD 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L；所述改良MS，其配方为将MS培养基配方中KH2PO4的浓度设为330-350mg/L，KNO3的浓度设为940-960mg/L。
最优选地，所述改良MS，其配方为将MS培养基配方中KH2PO4的浓度设为340mg/L，KNO3的浓度设为950mg/L。所述壮苗培养基的配方中采用改良MS，可有效避免组培瓶苗玻璃化，苗木更健壮。
(6)生根培养
将步骤(5)获得的单芽顶部2-4厘米处切下，接种于生根培养基培养。培养温度25-28℃，光照时间每天11-13h，光照强度800-1200lx，培养时间为18-22天。获得生根苗。
优选的，所述生根苗为单芽基部膨大突起形成了白色根原基的生根苗。
所述生根培养基，其配方为改良MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+CCC 0.1mg/L；所述改良MS，其配方为将MS培养基配方中KH2PO4的浓度设为330-350mg/L，KNO3的浓度设为940-960mg/L。
最优选地，所述改良MS，其配方为将MS培养基配方中KH2PO4的浓度设为340mg/L，KNO3的浓度设为950mg/L。
(7)生根苗炼苗
将步骤(6)获得的生根苗，置于炼苗棚。炼苗棚温度20-30℃，培养时间为5-10天。获得苗木。
优选的，步骤(7)的光照条件为晴天，上午9点到下午4点半，炼苗棚棚顶遮阳，其余时间遮阳网全开透光；阴雨天，全天遮阳网全开透光。
优选的，所述苗木为生根5-8条，根系长度生长至0.5-1.0厘米的苗木。
(8)生根苗移栽
将步骤(7)获得的苗木，洗净其根部培养基，使用杀菌剂和植物生长调节剂浸泡苗木10-15分钟，不经漂洗即移栽；移栽基质使用混合的泥炭土、珍珠岩；定植前使用杀菌剂浇透基质，定植完成后浇定根水，培养时间为5-9天；使用杀菌剂和细胞赋活剂喷撒植株及基质表面；此后获得健壮的再生植株。
步骤(8)优选方案为：
将步骤(7)获得的苗木，洗净其根部培养基，使用多抗霉素800-1000倍液+s-诱抗素1500-2000倍液浸泡苗木10-15分钟，不经漂洗即可移栽。移栽使用72孔穴盘，基质使用泥炭土、珍珠岩(体积比为9∶1)混合均匀，定植前使用敌磺钠600-800倍液浇透基质，定植完成后使用500目以上花洒或喷雾器浇定根水，定植后7-10天使用多菌灵600-800倍液+复硝酚钠1500-2000倍液喷撒植株及基质表面。
本发明所提供的黄梁木高效再生体系建立的方法，以黄梁木优选单株幼态部位萌芽条顶芽为原始材料，通过茎段丛生芽增殖成苗，将黄梁木优选单株无性系化，保持采穗母树优良性状，有效保证了苗木的遗传稳定性，使苗木均一稳定，为造林整齐度及预期产量奠定了良好基础；继代增殖材料选择与控制，剔除了愈伤组织分化形成的芽，使用侧芽萌发的簇生状的丛生芽为继代材料，有效控制了生产过程中的变异；本发明只需少量母树萌芽条顶芽进入再生环节，即可呈几何倍数增殖，克服了种源数量对出苗数量的限制，有效降低了生产成本；在离体培养过程中，对真菌和细菌病害起到了较好的脱毒效果，有利于黄梁木健康种苗生产；本发明还通过培养基配方优化、培养环境控制及组培苗生长状态等方面的技术控制，实现了黄梁木离体高效再生，适用于黄梁木的商业化育苗生产。
本发明步骤简单，可操作性强，苗木生长整齐健壮，增殖倍率高且稳定，生根苗移栽成活率高，并且生产成本低，适用于黄梁木的商业化育苗生产。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明作进一步说明。以下实施例中所用的试验材料均为市售。
实施例一：
(1)外植体采集：十月初(具体时间为2014年10月10日)，对4年生黄梁木优势单株，重回缩修剪，至主干离地1米高度。43天后，在中午11时至下午2时采芽，此时主干潜伏芽已萌发，萌芽条长度8-12厘米。将顶芽苞片未打开的萌芽条带1对叶片剪下，保留叶柄长度1厘米左右，剪叶，萌芽条为外植体。将外植体用洁净湿纱布包裹，保湿带回实验室。
(2)外植体处理：将步骤(1)获得的外植体置于饱和漂白粉溶液中浸泡30分钟，不经漂洗，直接转移至0.1％升汞溶液浸泡20分钟，使用无菌水漂洗4次以上。将漂洗干净的外植体进行第二次切割，将带苞片的顶芽沿原叶柄处挖出，纵切，剥离苞片。将顶芽接种于装有不含激素的Ms培养基的植物组织培养瓶中。13天后，剔除污染的顶芽，保留未污染的顶芽。
(3)外植体启动培养及簇生状的丛生芽诱导：将步骤(2)获得的未污染的顶芽转移到含有启动培养基的植物组织培养瓶中培养，培养温度25-28℃，光照时间每天12h，光照强度500-8001x。31天后，检查记录接种材料长势，发现外植体的顶芽生长的同时，侧芽萌发，愈伤组织分化形成少量的芽；当日将外植体切割为带一对侧芽的茎段，剔除愈伤组织分化形成的芽，将茎段转移至含有启动培养基的植物组织培养瓶中培养。30天后，检查接种材料长势并剔除污染的接种材料。接种茎段腋芽及二级侧枝腋芽萌发形成簇生状的丛生芽，剔除愈伤组织分化形成的芽，获得簇生状的丛生芽。
所述启动培养基，其配方为3/4MS+6-BA 1.0mg/L+TDZ 0.1mg/L。
(4)丛生芽继代增殖：将步骤(3)获得的簇生状的丛生芽进行继代培养步骤。所述继代培养步骤，包括将所有簇生状的丛生芽切碎成带1-2对芽的茎段，平铺于继代培养基上，每个植物组织培养瓶接种35-40个小茎段，当日完成转接继代；培养温度25-28℃，光照时间每天11-13h，光照强度500-8001x；30天后检查，所有茎段均能形成簇生状丛生芽。每30天重复1次所述继代培养步骤，重复7次，获得增殖簇生状的丛生芽。经统计，每30天增殖倍率为7.5-8.5倍。本实施例中，一共重复7次继代培养步骤，通过重复继代培养步骤可以快速得获得大量的增殖簇生状的丛生芽。
所述继代培养基，其配方为3/4MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L。
(5)壮苗培养：将步骤(4)获得的增殖簇生状的丛生芽切碎成带1-2对芽的茎段，平铺接种于含有壮苗培养基的植物组织培养瓶中培养，每个植物组织培养瓶接种茎段35-40个。培养温度25-28℃，光照时间每天12h，光照强度800-12001x。30天后，检查接种材料长势。茎段萌发抽芽，形成2个高3-4厘米的单芽，获得单芽。
所述壮苗培养基，其配方为改良MS+6-BA.02mg/L+AD 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L。所述改良MS，其配方为将MS培养基配方中KH2PO4的浓度设为340mg/L，KNO3的浓度设为950mg/L。
(6)生根培养：将步骤(5)获得的单芽顶部2.5-3.5厘米切下，接种于含有生根培养基的植物组织培养瓶中培养。培养温度25-28℃，光照时间每天12h，光照强度800-12001x。20天后，检查接种材料长势。所接种单芽基部膨大突起形成白色根原基，获得生根苗。本实施例中，生根率100％。
所述生根培养基，其配方为改良MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+CCC 0.1mg/L。所述改良MS，其配方为将MS培养基配方中KH2PO4的浓度设为340mg/L，KNO3的浓度设为950mg/L。
(7)生根苗炼苗：将步骤(6)的生根苗，带着植物组织培养瓶，置于炼苗棚炼苗。炼苗棚温度20-30℃，晴天9：00-16：30炼苗棚棚顶遮阳，其余时间遮阳网全开透光，阴雨天全天透光。7天后，检查苗木生长情况。苗木生根5-8条，根系长度生长至0.5-1.0厘米，获得苗木。
(8)生根苗移栽：次日，将步骤(7)获得的苗木，洗净根部培养基，使用多抗霉素800-1000倍液+s-诱抗素1500-2000倍液浸泡苗木10-15分钟，不经漂洗即移栽。移栽使用72孔穴盘，移栽基质为混合均匀的泥炭土和珍珠岩，泥炭土、珍珠岩的体积比为9∶1。定植前使用敌磺钠600-800倍液浇透基质，定植完成后使用500目以上花洒或喷雾器浇定根水；7天后，使用多菌灵600-800倍液+复硝酚钠1500-2000倍液喷撒植株及基质表面。此后获得健壮的再生植株。本实施例中，再生植株的存活率为95％以上。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (2)
1.一种黄梁木高效再生体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体采集
选择树龄4年以上的黄梁木优选单株，回缩修剪；培养35-45天，将主干潜伏芽萌发的萌芽条剪下，获得外植体；
(2)外植体处理
将步骤(1)获得的外植体进行灭菌处理，将灭菌处理后的外植体进行切割，将顶芽接种于不含激素的MS培养基，培养时间为10-15天，保留未污染的顶芽；
(3)外植体培养及丛生芽诱导
将步骤(2)获得的未污染的顶芽，转移至启动培养基，培养温度25-28℃，光照时间每天10-14h，光照强度500-800lx，培养时间为25-35天；将外植体切割为带1-2对侧芽的茎段Ⅰ，剔除愈伤组织分化形成的芽，将所述茎段Ⅰ接种于启动培养基，培养时间为28-35天；茎段Ⅰ腋芽或二级侧枝腋芽萌发形成丛生芽，剔除愈伤组织分化形成的芽，获得丛生芽；
(4)丛生芽继代增殖
将步骤(3)获得的丛生芽，进行继代培养步骤，获得增殖丛生芽；
所述继代培养步骤，包括将丛生芽切碎成带1-2对芽的茎段Ⅱ，接种于继代培养基培养；培养温度25-28℃，光照时间每天11-13h，光照强度500-800lx，培养周期25-35天；
(5)壮苗培养
将步骤(4)获得的增殖丛生芽，切碎成带1-2对芽的茎段Ⅲ，接种于壮苗培养基培养；培养温度25-28℃，光照时间每天11-13h，光照强度800-1200lx，培养时间为25-35天，获得单芽；
(6)生根培养
将步骤(5)获得的单芽，其顶部2-4厘米处切下，接种于生根培养基培养；培养温度25-28℃，光照时间每天11-13h，光照强度800-1200lx，培养时间为18-22天，获得生根苗；
(7)生根苗炼苗；
(8)生根苗移栽；
所述启动培养基，其配方为3/4MS+6-BA 1.0mg/L+TDZ 0.1mg/L；
所述继代培养基，其配方为3/4MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
所述壮苗培养基，其配方为改良MS+6-BA 0.02mg/L+AD 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L；
所述生根培养基，其配方为改良MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+CCC 0.1mg/L；
所述改良MS，其配方为将MS培养基配方中KH2PO4的浓度设为330-350mg/L，KNO3浓度的设为940-960mg/L。
2.根据权利要求1所述一种黄梁木高效再生体系建立的方法，其特征在于，所述丛生芽和所述增殖丛生芽均呈簇生状。
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