CN108271693B - 一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法 - Google Patents

一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法，属于植株再生研究领域。选取成熟蒴果，漂洗干净以及消毒处理后，纵切果实，镊子夹取种子，在无菌条件下诱导原球茎生长培养，得到原球茎；将原球茎切割为2‑3cm方块接种于芽增殖培养基中，得到增殖培养幼苗；将继代增殖诱导培养出来带叶2～3片，株高3～4cm无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中诱导生根20‑25d，得到可移栽的寄树兰幼苗。解决现有技术中寄树兰野生资源少，观赏效果好，自然繁衍能力、传播扩散能力不强，自然更新困难、优良种苗稀缺等问题，是国家二级保护植物，具有较高的园艺观赏价值，为兰科植物园林装饰以及兰花公园装饰具有重要意义。

Description

一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法
技术领域
本发明属于植株再生研究领域，具体涉及一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法。
背景技术
寄树兰（学名：Robiquetia succisa(Lindl.)Seidenf.et Garay）：茎坚硬，圆柱形，长达1米，粗5毫米，节间长约2厘米，下部节上具发达而分枝的根。叶二列，长圆形，先端近截头状并且啮蚀状缺刻。花序与叶对生，比叶长，常分枝，圆锥花序密生许多小花；花不甚开放，萼片和花瓣淡黄色或黄绿色，质地较厚；花瓣较小，宽倒卵形，先端钝；唇瓣白色，3裂；侧裂片直立，耳状，长约4毫米，宽2毫米，先端钝并且带紫褐色，边缘稍波状。蒴果长圆柱形，成熟后倒垂。花期6-9月，果期7-11月。
生于海拔570-1150米的疏林中树干上或山崖石壁上。分布于中国、锡金、不丹、印度东北部、缅甸、泰国、老挝、柬埔寨、越南。具有较高的园艺观赏价值，为兰科植物园林装饰以及兰花公园装饰具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法，解决了现有技术中寄树兰野生资源少，观赏效果好，自然繁衍能力、传播扩散能力不强，自然更新困难、优良种苗稀缺等问题，是国家二级保护植物，具有较高的园艺观赏价值，为兰科植物园林装饰以及兰花公园装饰具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法，具体包括如下步骤：
1）材料选取与消毒：采摘当年80-90%成熟荚果用洗涤剂漂洗干净，再置于流水中冲洗20分钟；种子消毒处理：将荚果进行清洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，并用软毛刷刷洗荚果外部，冲洗干净后，自来水下滴冲0.5～1h，双蒸水冲荡2～3次，置超净工作台内用75%酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞处理8～10min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲3～4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分后即可进行接种；
2）原球茎诱导培养：取饱满经消毒处理后的荚果，用枪状镊夹住荚果，手术刀顺着荚果垂直方向剖开，取出荚果内种子，分别接种于经高温、高压灭菌的原球茎诱导培养基中；培养条件：培养温度为23±2℃，无光培养79d后，第80d光照时间设置3h，光照强度500～1000lx,之后10d光照时间5h，光照强度500～1000lx，培养时间90d，得到生长原球茎；
3）增殖培养：将经上述诱导培养，所得到原球茎切成2-3cm方块，分别接种于芽增殖培养基中，光照时间8h/d，光照强度100～1500lx，增殖培养时间20-30d，得到增殖培养幼苗；
4）诱导生根：将步骤3）培养出来的带有叶2～3片、株高3～4cm无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中；光照时间10h/d，光照强度1500～2000lx，诱导生根时间20-25d；
5）试管苗培养完成：当诱导生根培养试管苗生长至高5-6cm，根3～5条，叶5片，叶长2～3cm时完成寄树兰种子诱导发芽及快速繁殖培养；
6）将完成生根培养试管瓶苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1-2d，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗净附着在根系的残留培养基，移入腐殖土：水草：碎树皮:碎石子质量比例为1:2:2:2混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在15～30℃，湿度保持在75％～85％，避免阳光直射；2-3周后植株适应能力逐渐增强，获得自然生长健壮完整种苗。
所述原球茎诱导培养基为MS+0.5mg/LKT+0.5mg/LNAA+2g/L蛋白胨+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0 g/L活性炭；PH值为5.4-5.7。
所述增殖培养基 为MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.01mg/L TDZ+20g/L 蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0g/L活性炭，PH值为5.4-5.7。
所述生根培养基为1/2MS+1.0g/L花宝2号+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.5g·L-1活性炭；PH值为5.4-5.7。
本发明的优点在于：
与现有技术相比，本发明所具有的优点和有益效果，1、体系建立材料的选择：采摘当年成熟度为80-90%成熟饱满未开裂荚果；2、正确的消毒时间和材料的处理方法；3、准确合理的培养基成分构成；4、合理的光照时间光照强度的设置，提高了萌发率；诱导生根率可达100%，成活率可达96%以上；培养时间缩短成苗移植后成活率高，病虫害少，降低了大量成本，幼苗健壮挺拔，长势良好，整齐一致。
附图说明
图1 为生根诱导培养。
具体实施方式
实施例1
一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法，具体包括如下步骤：
1）材料选取与消毒：采摘当年90%成熟荚果用洗涤剂漂洗干净，再置于流水中冲洗20分钟；种子消毒处理：将荚果进行清洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，并用软毛刷刷洗荚果外部，冲洗干净后，自来水下滴冲1h，双蒸水冲荡3次，置超净工作台内用75%酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞处理9min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分后即可进行接种；
2）原球茎诱导培养：取饱满经消毒处理后的荚果，用枪状镊夹住荚果，手术刀顺着荚果垂直方向剖开，取出荚果内种子，分别接种于经高温、高压灭菌的原球茎诱导培养基中；培养条件：培养温度为23±2℃，无光培养79d后，第80d光照时间设置3h，光照强度800lx,之后10d光照时间5h，光照强度800lx，培养时间90d(全部萌发需要90d)，得到生长原球茎；
3）增殖培养：将经上述诱导培养，所得到原球茎切成3cm方块，分别接种于芽增殖培养基中，光照时间8h/d，光照强度1000lx，增殖培养时间25d，得到增殖培养幼苗；
4）诱导生根：将步骤3）培养出来的带有叶3片、株高4cm无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中；光照时间10h/d，光照强度2000lx，诱导生根时间24d；
5）试管苗培养完成：当诱导生根培养试管苗生长至高6cm，根4条，叶5片，叶长3cm时完成寄树兰种子诱导发芽及快速繁殖培养；
6）将完成生根培养试管瓶苗放在自然光下炼苗6天，打开瓶盖炼苗2d，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗净附着在根系的残留培养基，移入腐殖土：水草：碎树皮:碎石子质量比例为1:2:2:2混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在25℃，湿度保持在80％，避免阳光直射； 3周后植株适应能力逐渐增强，获得自然生长健壮完整种苗。
所述原球茎诱导培养基为MS+0.5mg/LKT+0.5mg/LNAA+2g/L蛋白胨+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0 g/L活性炭；pH值为5.6。
所述增殖培养基 为MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.01mg/L TDZ+20g/L 蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0g/L活性炭，PH值为5.6。
所述生根培养基为1/2MS+1.0g/L花宝2号+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.5g·L-1活性炭；pH值为5.6。
此方法成活率可达99%。
实施例2
1）材料选取与消毒：采摘当年85%成熟荚果用洗涤剂漂洗干净，再置于流水中冲洗20分钟；种子消毒处理：将荚果进行清洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，并用软毛刷刷洗荚果外部，冲洗干净后，自来水下滴冲0.5h，双蒸水冲荡2次，置超净工作台内用75%酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞处理8min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲3遍后，用消毒滤纸吸干表面水分后即可进行接种；
2）原球茎诱导培养：取饱满经消毒处理后的荚果，用枪状镊夹住荚果，手术刀顺着荚果垂直方向剖开，取出荚果内种子，分别接种于经高温、高压灭菌的原球茎诱导培养基中；培养条件：培养温度为23±2℃，无光培养79d后，第80d光照时间设置3h，光照强度500lx，之后10d光照时间5h，光照强度500lx，培养时间90d(全部萌发需要90d)，得到生长原球茎；
3）增殖培养：将经上述诱导培养，所得到原球茎切成2cm方块，分别接种于芽增殖培养基中，光照时间8h/d，光照强度500lx，增殖培养时间20d，得到增殖培养幼苗；
4）诱导生根：将步骤3）培养出来的带有叶2片、株高3cm无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中；光照时间10h/d，光照强度1500lx，诱导生根时间20d；
5）试管苗培养完成：当诱导生根培养试管苗生长至高5cm，根3条，叶5片，叶长2cm时完成寄树兰种子诱导发芽及快速繁殖培养；
6）将完成生根培养试管瓶苗放在自然光下炼苗5天，打开瓶盖炼苗1d，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗净附着在根系的残留培养基，移入腐殖土：水草：碎树皮:碎石子质量比例为1:2:2:2混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在15℃，湿度保持在75％，避免阳光直射；2周后植株适应能力逐渐增强，获得自然生长健壮完整种苗。
所述原球茎诱导培养基为MS+0.5mg/LKT+0.5mg/LNAA+2g/L蛋白胨+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0 g/L活性炭；pH值为5.4。
所述增殖培养基 为MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.01mg/L TDZ+20g/L 蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0g/L活性炭，pH值为5.4。
所述生根培养基为1/2MS+1.0g/L花宝2号+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.5g·L-1活性炭；pH值为5.4。
此方法成活率可达98%。
实施例3
1）材料选取与消毒：采摘当年80%成熟荚果用洗涤剂漂洗干净，再置于流水中冲洗20分钟；种子消毒处理：将荚果进行清洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，并用软毛刷刷洗荚果外部，冲洗干净后，自来水下滴冲1h，双蒸水冲荡3次，置超净工作台内用75%酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞处理10min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分后即可进行接种；
2）原球茎诱导培养：取饱满经消毒处理后的荚果，用枪状镊夹住荚果，手术刀顺着荚果垂直方向剖开，取出荚果内种子，分别接种于经高温、高压灭菌的原球茎诱导培养基中；培养条件：培养温度为23±2℃，无光培养79d后，第80d光照时间设置3h，光照强度1000lx,之后10d光照时间5h，光照强度1000lx，培养时间90d，得到生长原球茎；
3）增殖培养：将经上述诱导培养，所得到原球茎切成3cm方块，分别接种于芽增殖培养基中，光照时间8h/d，光照强度1500lx，增殖培养时间30d，得到增殖培养幼苗；
4）诱导生根：将步骤3）培养出来的带有叶3片、株高4cm无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中；光照时间10h/d，光照强度2000lx，诱导生根时间25d；
5）试管苗培养完成：当诱导生根培养试管苗生长至高6cm，根5条，叶5片，叶长3cm时完成寄树兰种子诱导发芽及快速繁殖培养；
6）将完成生根培养试管瓶苗放在自然光下炼苗7天，打开瓶盖炼苗2d，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗净附着在根系的残留培养基，移入腐殖土：水草：碎树皮:碎石子质量比例为1:2:2:2混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在30℃，湿度保持在85％，避免阳光直射；2-3周后植株适应能力逐渐增强，获得自然生长健壮完整种苗。
所述原球茎诱导培养基为MS+0.5mg/LKT+0.5mg/LNAA+2g/L蛋白胨+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0 g/L活性炭；pH值为5.7。
所述增殖培养基 为MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.01mg/L TDZ+20g/L 蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0g/L活性炭，pH值为5.7。
所述生根培养基为1/2MS+1.0g/L花宝2号+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.5g·L-1活性炭；pH值为5.7。
此方法成活率可达98%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种寄树兰再生体系快速建立及保存方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
1）材料选取与消毒：采摘当年80-90%成熟荚果用洗涤剂漂洗干净，再置于流水中冲洗20分钟；种子消毒处理：将荚果进行清洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min并用软毛刷刷洗荚果外部，冲洗干净后，自来水下滴冲0.5～1h，双蒸水冲荡2～3次，置超净工作台内用75%酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞处理8～10min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲3～4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分后即可进行接种；
2）原球茎诱导培养：取饱满经消毒处理后的荚果，用枪状镊夹住荚果，手术刀顺着荚果垂直方向剖开，取出荚果内种子，分别接种于经高温、高压灭菌的原球茎诱导培养基中；培养条件：培养温度为23±2℃，无光培养79d后，第80d光照时间设置3h，光照强度500～1000lx,之后10d光照时间5h，光照强度500～1000lx，培养时间90d，得到生长原球茎；
3）增殖培养：将经上述诱导培养，所得到原球茎切成2-3cm方块，分别接种于芽增殖培养基中，光照时间8h/d，光照强度100～1500lx，增殖培养时间20-30d，得到增殖培养幼苗；
4）诱导生根：将步骤3）诱导培养带有叶2～3片、株高3～4cm无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中；光照时间10h/d，光照强度1500～2000lx，诱导生根时间20-25d；
5）试管苗培养完成：当诱导生根培养试管苗生长至高5-6cm，根3～5条，叶5片，叶长2～3cm时完成寄树兰种子诱导发芽及快速繁殖培养；
6）将完成生根培养试管瓶苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1-2d，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗净附着在根系的残留培养基，移入腐殖土：水草：碎树皮:碎石子质量比例为1:2:2:2混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在15～30℃，湿度保持在75％～85％，避免阳光直射；2-3周后植株适应能力逐渐增强，获得自然生长健壮完整种苗；
所述原球茎诱导培养基为MS+0.5mg/LKT+0.5mg/LNAA+2g/L蛋白胨+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0 g/L活性炭；pH值为5.4-5.7；
所述增殖培养基 为MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LKT+0.1mg/LNAA+0.01mg/LTDZ+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.0g/L活性炭，pH值为5.4-5.7；
所述生根培养基为1/2MS+1.0g/L花宝2号+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.8g/L琼脂粉+1.5g·L-1活性炭；pH值为5.4-5.7。
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