CN104145814A - 一种高盆樱桃（原变种）茎段组织培养获得再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高盆樱桃(原变种)茎段组织培养获得再生植株的方法。该方法包括如下步骤：(1)外植体消毒；(2)诱导培养；(3)增殖培养；(4)生根壮苗培养；(5)炼苗移栽。本发明采用高盆樱桃(原变种)茎段为外植体进行组织培养，能够通过选择优良母本进行取材，快速获得大量高度一致同时具有优良表型的群体；而且由于组织培养不受季节限制，并且能保持通过有性繁殖不能保持的优良性状，能够满足园林绿化对其需求量的要求，为提高户外园林景观的周年观赏价值具有极其重要的意义。

Description

一种高盆樱桃(原变种）茎段组织培养获得再生植株的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及的是一种高盆樱桃（原变种）茎段 组织培养获得再生植株的方法。

背景技术

[0002] 高盆搜桃（原变种）（Cerasus cerasoides var. cerasoides)为舊薇科搜属 (Cerasus)落叶乔木，高达3 - 10米。高盆樱桃作为野生樱花资源中极为特殊的一个类群， 是樱属植物中惟一在冬季开花的原始种类，花期一般从11月〜翌年1月，几乎没有任何观 赏树木的自然花期与之重叠，团簇花相，花感强烈，其叶初发时为紫红色，舒展成熟后呈黄 绿色，秋季又逐渐变为黄色，是一种典型的具有明显季相变化的春色叶和秋色叶树种。其果 实由于成熟先后时间不同，呈现出五彩斑斓的色彩。高盆樱桃无论从花期、叶色、果实方面， 都具有很高的观赏价值，是极具应用潜力的优良园林观赏树种，自然花期填补了大自然深 冬无花盛开的空白期，这为提高户外园林景观的周年观赏价值具有极其重要的意义。

[0003] 高盆樱桃（原变种）广泛分布于中国云南、西藏等地，尼泊尔、日本、缅甸也有分 布，其中以云南为现代分布中心，天然分布范围为北纬2Γ 43'〜26°，东经96° 12'〜 104° 41'，生于沟谷密林中，海拔1300-2200米。高盆樱桃系阳性树，喜温暖湿润气候，适 宜生长区气候条件是年均气温13. 2 - 20. 9°C，最冷月（1月）均温>14. 6°C，且彡10°C，积 温应在3750°C以上，年降水量>609mm。花期繁盛程度与平均温度和光照相关，平均温度高 则开花率高，高盆樱桃（原变种）虽能忍耐荫庇环境，但在其生长发育时期则需要充足的光 照，阳光充足时，生长快且花繁而艳，反之则生长不良，花朵稀少。它对土质不甚选择，以排 水良好的肥沃的沙质酸性土壤为佳，不耐积水。

[0004] 高盆樱桃（原变种）种子具有寿命短、含水量大、油脂含量高、易失水，不易贮藏的 特点，采取随采随播的方法、但出苗率不高，由于种子产量低而不稳定，尚不能满足其园林 绿化的需求。而且高盆樱桃（原变种）自然生长耗时长、成型慢、采种困难，良种少，优质种 苗产量低，在一定程度上限制了栽培面积的扩大。因此，通过无性繁殖的手段提高高盆樱桃 的产量和质量显得比较重要，但高盆樱桃的扦插、嫁接的存活率一般仅为30% -50%，因而 其无性繁殖也受到一定限制。而组织培养结合相关生物技术，如基因工程、花药培养和原 生质融合等，在植物种质资源创新和品种选育等方面的作用日益突出。近20年来，植物组 织培养研究取得了很大的进展，尤其是脱毒技术和快速繁殖，其应用已涉及到观赏植物、果 树、农作物、林木、药用植物及工业原料植物等的繁殖。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种高盆樱桃（原变 种）茎段组织培养获得再生植株的方法。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] -种高盆樱桃（原变种）茎段组织培养获得再生植株的方法，其步骤如下：

[0008] (1)外植体消毒

[0009] 在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃（原变种）新稍，装入塑料袋中，带 回室内，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成 独立的带顶芽的小枝条，长度5cm ;将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h ;吸干外植体表面的 水分，再用0.2% (W/V)的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行 无菌消毒；在超净工作台下用体积百分浓度为75%的酒精消毒10-20S后，再用0. 1% (W/ V)的升汞浸泡4-6min，然后在无菌条件下用无菌水清洗4-6次，用无菌纱布吸干备用；

[0010] ⑵诱导培养

[0011] 从（1)中处理后的小枝条上截取2. 5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培 养基中，先置于黑暗培养箱中培养72-120h，再置于光照培养箱中培养，12d〜15d即有芽开 始膨大萌动，40d〜45d即长出丛生芽；

[0012] ⑶增殖培养

[0013] 将诱导产生的丛生芽分株，每株约含3个芽，接种到增殖培养基上，置于光照培养 箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养；

[0014] (4)生根壮苗培养

[0015] 在（3)中培养后的丛生芽中，剪取3-5cm带顶芽的材料，接种到生根培养基，置于 光照培养箱中培养25d〜30d后，获得生长健壮且具有效根的幼苗；

[0016] (5)炼苗移栽

[0017] 将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养10d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接 着打开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出（避免伤根）栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体 积比为1:1，28d〜30d后长出新的嫩芽，幼苗成活。

[0018] 所述的诱导培养基为 MS 基本培养基 +6-BA0. 6-1. Omg · P+IBAO. 04-0. 08mg · 1^+ 蔗糖3(^·Ι^+琼脂78·ΐΑ

[0019] 所述的增殖培养基为 MS 基本培养基 +6-ΒΑ0. 5-0. 8mg · P+IBAO. 02-0. 04mg · 1^+ 蔗糖3(^·Ι^+琼脂78·ΐΑ

[0020] 所述的生根培养基为1/2MS基本培养基+ΙΒΑ0. 05-0. lmg · Ι^+蔗糖30g · I/k琼 脂 7g · L-1。

[0021] 所述的方法，步骤⑷中，所述光照培养箱的温度为20_25°C，光照强度为 1500-2000LX，光照时间为 12-15h/d。

[0022] 本发明采用高盆樱桃（原变种）茎段为外植体进行组织培养，能够通过选择优良 母本进行取材，快速获得大量高度一致同时具有优良表型的群体；而且由于组织培养不受 季节限制，并且能保持通过有性繁殖不能保持的优良性状，能够满足园林绿化对其需求量 的要求，为提高户外园林景观的周年观赏价值具有极其重要的意义。

具体实施方式

[0023] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

[0024] 1、主要试剂及药品

[0025] 植物生长调节剂6-BA、IBA均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；基本培 养基配方中所有试剂、蔗糖、琼脂粉、以及消毒试剂等均为国产分析纯。

[0026] 2、仪器设备

[0027] (1)高压灭菌锅：主要用于植物组织培养操作中的培养基及其它多种需要无菌用 品的灭菌。高压灭菌时，要求的最低压力为l.〇6kg/cm 2,温度为121°C，灭菌时间为20min。

[0028] (2)超净工作台：超净工作台又称净化工作台，主要用于培养材料的接种等无菌 操作过程。由于它具有机动的滤菌装置，可以在工作人员与操作对象之间形成风幕，使工作 台面处于基本无菌的状态。在使用超净工作台前应先用70%的酒精棉将台面及周围擦净， 再用紫外灯照射30min左右对台面进行灭菌，同时启动风机把贮存于机体内的含菌空气排 出。经常使用的超净工作台每隔半年左右要把滤料清洗一次，否则会因滤料附着太多的灰 尘而影响正常的工作。滤料清洗后，超净工作台必须启动一个小时后才能进行正常的无菌 操作。由于从超净工作台中吹出的空气也不是绝对无菌的，因此操作时要借助于酒精灯进 行无菌操作，否则难以达到完全无菌的效果。本实施例所用的超净工作台型号为苏州安泰 空气技术有限公司生产的SW-CJ-ZFD。

[0029] (3)智能人工气候箱：具有光照、加湿功能的高精度冷热恒温设备。主要用于植物 材料的恒温培养、光照培养以及用于愈伤组织分化和植株再生过程的培养。气候箱的温度 变化范围为5-50°C (无光照）、10°C _50°C (有光照），组织培养时的使用温度常为20-30°C。 气候箱内通常有四层活动的金属网格，每层网格都可以放满培养瓶，但上下层培养物之间 必须保留一定的空隙，以保证箱内空气的流动和温度的恒定。本实施例所用的是宁波江南 仪器厂制造的RXZ型智能人工气候箱。

[0030] 除了上述仪器设备以外，还用到电子天平、电炉、冰箱、容量瓶、烧杯、玻璃棒、移 液管、洗耳球、量筒、酒精灯、试管、组培瓶、解剖刀、镊子、封口膜等。

[0031] 实施例1

[0032] (1)外植体消毒

[0033] 在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃（原变种）新稍，装入塑料袋中，带 回室内，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成 独立的带顶芽的小枝条，长度5cm。将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h。吸干外植体表面的 水分，再用0.2% (W/V)的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行 无菌消毒。在超净工作台下用75% (V/V)的酒精消毒10s后，再用0.1% (W/V)的升汞浸 泡6min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌纱布吸干备用。

[0034] (2)诱导培养

[0035] 从（1)中处理后的小枝条上截取2. 5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培 养基（诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0. 6mg · P+IBAO· 04mg · 1^+蔗糖30g · 1^+琼 脂7g · I71)中，先置于黑暗培养箱中培养100h，再置于光照培养箱中培养，15d即有芽开始 膨大萌动，45d长出丛生芽；

[0036] (3)增殖培养

[0037] 将诱导产生的丛生芽分株，每株含3个芽，接种到增殖培养基（增殖培养基为MS 基本培养基+6-BA0. 5mg · P+IBAO· 02mg · 1^+蔗糖30g · 1^+琼脂7g · L-1)上，置于光照 培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养；

[0038] (4)生根壮苗培养

[0039] 在（3)中培养后的丛生芽中，剪取4cm带顶芽的材料，接种到生根培养基（生根培 养基为1/2MS基本培养基+IBAO. 05mg · 1^+蔗糖30g · 1^+琼脂7g · L-1)，置于培养箱温度 为20°C、光照强度为15001x光照培养箱中培养30d，每天光照时间为12h，获得生长健壮且 具有效根的幼苗；

[0040] (5)炼苗移栽

[0041] 将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养l〇d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接 着打开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出（避免伤根）栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体 积比为1:1，30d后长出新的嫩芽，幼苗成活。

[0042] 实施例2

[0043] (1)外植体消毒

[0044] 在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃（原变种）新稍，装入塑料袋中，带 回室内，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成 独立的带顶芽的小枝条，长度5cm。将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h。吸干外植体表面的 水分，再用0.2% (W/V)的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行 无菌消毒。在超净工作台下用75% (V/V)的酒精消毒15s后，再用0.1% (W/V)的升汞浸 泡5min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌纱布吸干备用。

[0045] (2)诱导培养

[0046] 从（1)中处理后的小枝条上截取2. 5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培 养基（诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0. 6mg · P+IBAO· 08mg · 1^+蔗糖30g · 1^+琼 脂7g · I71)中，先置于黑暗培养箱中培养100h，再置于光照培养箱中培养，15d即有芽开始 膨大萌动，40d长出丛生芽；

[0047] (3)增殖培养

[0048] 将诱导产生的丛生芽分株，每株含3个芽，接种到增殖培养基（增殖培养基为MS 基本培养基+6-BA0. 8mg · P+IBAO· 04mg · 1^+蔗糖30g · 1^+琼脂7g · L-1)上，置于光照 培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养；

[0049] (4)生根壮苗培养

[0050] 在（3)中培养后的丛生芽中，剪取3cm带顶芽的材料，接种到生根培养基（生根培 养基为1/2MS基本培养基+ΙΒΑ0. 08mg · I/1-蔗糖30g · I/1-琼脂7g · Γ1)，置于培养箱温度 为20°C、光照强度为15001x光照培养箱中培养30d，每天光照时间为12h，获得生长健壮且 具有效根的幼苗；

[0051] (5)炼苗移栽

[0052] 将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养10d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接 着打开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出（避免伤根）栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体 积比为1:1，28d后长出新的嫩芽，幼苗成活。

[0053] 实施例3

[0054] (1)外植体消毒

[0055] 在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃（原变种）新稍，装入塑料袋中，带 回室内，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成 独立的带顶芽的小枝条，长度5cm。将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h。吸干外植体表面的 水分，再用0.2% (W/V)的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行 无菌消毒。在超净工作台下用75% (V/V)的酒精消毒20s后，再用0.1% (W/V)的升汞浸 泡4min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌纱布吸干备用。

[0056] (2)诱导培养

[0057] 从（1)中处理后的小枝条上截取2. 5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培 养基（诱导培养基为MS基本培养基+6-BA1. Omg · P+IBAO· 06mg · 1^+蔗糖30g · 1^+琼 脂7g · Γ1)中，先置于黑暗培养箱中培养100h，再置于光照培养箱中培养，12d即有芽开始 膨大萌动，40d长出丛生芽；

[0058] (3)增殖培养

[0059] 将诱导产生的丛生芽分株，每株含3个芽，接种到增殖培养基（增殖培养基为MS 基本培养基+6-BA0. 8mg · P+IBAO· 02mg · 1^+蔗糖30g · 1^+琼脂7g · L-1)上，置于光照 培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养；

[0060] (4)生根壮苗培养

[0061] 在（3)中培养后的丛生芽中，剪取3cm带顶芽的材料，接种到生根培养基（生根培 养基为1/2MS基本培养基+ΙΒΑ0. lmg · I/1-蔗糖30g · 1^+琼脂7g · Γ1)，置于培养箱温度 为20°C、光照强度为15001x光照培养箱中培养25d，每天光照时间为13h，获得生长健壮且 具有效根的幼苗；

[0062] (5)炼苗移栽

[0063] 将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养10d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接 着打开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出（避免伤根）栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体 积比为1:1，30d后长出新的嫩芽，幼苗成活。

[0064] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1. 一种高盆樱桃（原变种）茎段组织培养获得再生植株的方法，其特征是，其步骤如 下： (1) 外植体消毒 在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃（原变种）新稍，装入塑料袋中，带回室 内，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立 的带顶芽的小枝条，长度5cm ;将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h ;吸干外植体表面的水分， 再用0. 2 % W/V的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消 毒；在超净工作台下用体积百分浓度为75%的酒精消毒10-20S后，再用0. 1% W/V的升汞 浸泡4-6min，然后在无菌条件下用无菌水清洗4-6次，用无菌纱布吸干备用； (2) 诱导培养 从（1)中处理后的小枝条上截取2. 5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培养基 中，先置于黑暗培养箱中培养72-120h，再置于光照培养箱中培养，12d〜15d即有芽开始膨 大萌动，40d〜45d即长出丛生芽； (3) 增殖培养 将诱导产生的丛生芽分株，每株约含3个芽，接种到增殖培养基上，置于光照培养箱内 培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养； (4) 生根壮苗培养 在（3)中培养后的丛生芽中，剪取3-5cm带顶芽的材料，接种到生根培养基，置于光照 培养箱中培养25d〜30d后，获得生长健壮且具有效根的幼苗； (5) 炼苗移栽 将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养l〇d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接着打 开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体积比为1: 1，28d〜 30d后长出新的嫩芽，幼苗成活。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0. 6 -1. Omg · L klBAO· 04-0. 08mg · L 工+ 鹿糖 30g · L 工+ 琼脂 7g · L、

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述增殖培养基为MS基本培养基+6-BA0. 5 -〇· 8mg · L klBAO· 02-0. 04mg · L 工+ 鹿糖 30g · L 工+ 琼脂 7g · L、

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述生根培养基为1/2MS基本培养基 +ΙΒΑ0. 05-0. lmg · L-1+ 鹿糖 30g · L-1+ 琼脂 7g · I71。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（4)中，所述光照培养箱的温度为 20-25°C，光照强度为1500-2000LX，光照时间为12-15h/d。