CN103477988A - 轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，包括下述步骤：取轮叶蒲桃外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生试管苗，并进行栽种。本发明极大加快了轮叶蒲桃的繁殖速度，年繁殖系数为1：100000，成本由原来的每株500元，降低至每株2～3元，且不受季节限制，环境易控，适合全国各地，生产得到的轮叶蒲桃种苗品质高，一致性好。
Description
技术领域
本发明属于植物快繁方法技术领域，具体为轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖。
背景技术
轮叶蒲桃（Syzygium grijsii）系桃金娘科蒲桃属常绿灌木，树体矮小，冠形规则紧凑，叶片细小有光泽，全株无毛，枝叶浓密，花朵粉白色，雄蕊众多，花丝纤细优美，给人以干净清爽之感。嫩叶彩叶期较短，约6-8d，随着叶片的成熟，彩叶慢慢变为绿色，但由于轮叶蒲桃有多次抽梢的习性，自早春起至有冻害发生前，新梢几乎不间断的抽发，为此其嫩叶彩色效果也可持续很长的时间，具有很好的观赏效果，是传统常用的盆景制作材料。轮叶蒲桃病虫害少，适应性强，自然分布于长江中下游以南的湖北、湖南、江西、浙江、安徽、福建、广东、广西、贵州等地的干燥贫瘠山地中，习性喜阳亦耐阴，耐干旱瘠薄，是难得的集优良观赏性和环境适应性于一体的优良木本观赏植物资源。由于轮叶蒲桃特点明显，优点突出，受到园林植物研究人员的重视和园林工程人员的青睐。
轮叶蒲桃目前绝大多数种苗为籽播苗，个体间性状分离严重，形态差异显著，例如嫩叶叶色有深红色、橙红色、淡红色、嫩绿色等；叶形有长椭圆形、椭圆形、卵形、菱形；叶片的大小有米叶、细叶、小叶；不同个体间抗寒能力也不同，这为实生选种建立优良无性系提供了良好契机。
轮叶蒲桃枝条纤细，积累营养成分少，在不同季节进行扦插，成活率均不高，且受季节限制，结果不稳定，多代扦插引起种苗性状退化。到目前为止，未见国内其它研究机构或种苗企业有系统的繁育研究报道。
发明内容
本发明涉及一种轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，可在离体条件下快速繁殖轮叶蒲桃，且生产的轮叶蒲桃种苗品质高，一致性好。
本发明在单株选优的基础上，采用直接器官发生形式，通过对培养基成分、激素配比以及培养环境因子的确定，建立了轮叶蒲桃完整的再生体系，以芽繁芽进行组培快繁生产出来的试管苗无变异发生，可以保持母本的优良性状，为优良单株的繁育进而形成品系，为后期的推广应用奠定了坚实基础。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案包括下述步骤：取带腋芽的枝条作为外植体，并对外植体进行清洗消毒处理；将外植体接种到初代培养基中，进行初代培养；将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为改良WPM+BA0.1~1.5mg·L-1+NAA0.01~0.5mg·L-1+蔗糖20~40g·L-1+琼脂4~12 g·L-1，诱导不定芽；将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养；试管苗分切后，转移至生根培养基1/2改良WPM+IBA0.05~1.5 mg·L-1 +蔗糖15~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1；最后将生根试管苗清洗，移至基质中栽种。
其中所用到的培养基及激素包括：
改良WPM培养基（Woody Plant medium，以下简称WPM），本发明中使用的改良WPM培养基，主要是大量元素的调整，药品成分含量如下：
NH4NO3 100mg·L-1
Ca(N03)2·4H2O 226mg·L-1
CaCl2·2H2O 36mg·L-1
MgSO4·7H20 200mg·L-1
KH2PO4 100mg·L-1
K2SO4 190mg·L-1
其余微量元素、铁盐、有机元素含量以及培养基的配置为现有公开技术，在此不再赘述。
1/2改良WPM是指改良WPM培养基中大量元素减半，而其余药品成分不变。
附加的植物激素为6-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，简称为BA)、奈乙酸（naphthylene acetic acid，简称为NAA）、吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid，简称为IBA）。
方法包括下述步骤：
a、选择生长健壮，无病虫害轮叶蒲桃带腋芽的枝条做为起始外植体，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理。
b、将消毒处理后的外植体接种到初代培养基上，进行初代培养；
c、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为：改良WPM+BA0.1~1.5mg·L-1+NAA0.01~0.5mg·L-1+蔗糖20~40g·L-1+琼脂4~12 g·L-1，诱导不定芽；
d、将诱导出的丛生芽分切，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养；
e、将经壮苗培养生长到1.5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，该生根培养基为：1/2改良WPM+IBA0.05~1.5 mg·L-1 +蔗糖15~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1。
f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土的混合基质中进行栽种。
步骤a中，取轮叶蒲桃包含腋芽的枝条，切取成为长度0.5~2.5cm，腋芽位于中间的茎段，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，进行消毒处理。
步骤a中，先用72%浓度的酒精消毒30~60s，再用无菌水冲洗3~4次，然后用加有0.1~0.2%的升汞液浸泡15~30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
步骤b中，将步骤a中所得到的无菌外植体接种到初代培养基：
改良WPM+BA0.15~0.25mg·L-1+NAA0.15~0.25mg·L-1+蔗糖25~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1。
步骤c中，所述的最佳增殖培养基为：
改良WPM+BA0.4 mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6 g·L-1，丛芽月增殖率为1:4~5。
步骤d中，所述的壮苗培养基为：
改良WPM+BA0.15~0.25mg·L-1+IBA0.15~0.25mg·L-1+蔗糖25~35 g·L-1+琼脂4~12 g·L-1，培养20天，苗高可以达到2~6厘米，4～8对叶片。
步骤e中，所述的最佳生根培养基为：
1/2改良WPM +IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂6 g·L-1，生根率为85~95％，平均生根数4.5条，根长2~5厘米。
步骤b至e中，所述的初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为10~15h/d，光照强度1500~2500lx，培养温度为室温。
步骤b至e中，所述初代培养的周期为22~28天，增殖培养的周期为28~32天，壮苗培养的周期为18~22天，生根培养的周期为28~32天。
步骤f中，将生根试管苗置于自然环境中6~10天，取出洗净根部，用500~600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土:珍珠岩＝2:1的混合基质中，起始6~10天内保持苗的叶面湿润并适当遮阳，其后按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。
在上述方案的基础上，步骤a中，所述的外植体修切为长度0.5~2.5cm，腋芽位于中间的茎段，可以为0.5、0.7、0.9、1、1.5、2.0、2.5cm等该范围内的任一长度。
在上述方案的基础上，步骤a中，所述的清洗消毒处理的方法包括：取轮叶蒲桃包含腋芽的枝条，修切为长度0.5~2.5cm，腋芽位于中间的茎段，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，进行消毒处理。先用72%浓度的酒精消毒30~60s，再用无菌水冲洗3~4次，然后用加有0.1~0.2%的升汞液浸泡15~30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
具体的，72%浓度酒精消毒可以为30s、40s、50s、60s，升汞液浓度可以为0.1%、0.15%、0.2%，浸泡时间可以为15、18、20、25、28、30分钟。
在上述方案的基础上，步骤b中，所述初代培养基为：
改良WPM+BA0.15~0.25mg·L-1+NAA0.15~0.25mg·L-1+蔗糖25~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1。
具体的，在初代培养基中， BA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L-1，NAA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L-1，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35 g·L-1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L-1。
优选的初代培养基为：改良WPM+BA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1；在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10~15h/d，优选12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为22~28天，优选25天。
在上述方案的基础上，步骤c中，所述增殖培养基为：
改良WPM+BA0.1~1.5mg·L-1+NAA0.01~0.5mg·L-1+蔗糖20~40g·L-1+琼脂4~12 g·L-1。
具体的，BA的激素浓度可以为0.1、0.2、0.5、1.0、1.2、1.4、1.5mg·L-1，NAA的激素浓度可以为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1，蔗糖的浓度可以为20、25、28、30、32、35、40 g·L-1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12g·L-1。
所述的增殖培养基最佳的激素组合及浓度为：
改良WPM+BA0.4 mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6 g·L-1；
在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10~15h/d，优选12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为28~32天，优选30天，由此轮叶蒲桃试管苗的月增殖系数为1: 2.5~3。
在上述方案的基础上，步骤d中，所述的壮苗培养基为：
改良WPM+BA0.15~0.25mg·L-1+IBA0.15~0.25mg·L-1+蔗糖25~35 g·L-1+琼脂4~12 g·L-1。
具体的，在壮苗培养基中，BA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L-1，IBA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L-1，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35 g·L-1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L-1。
优选的壮苗培养基为：
改良WPM+BA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1；
在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10~15h/d，优选12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为18~22天，优选20天，由此试管苗长至2~6cm高，叶片4~8对，比较整齐。
在上述方案的基础上，步骤e中，所述生根培养基为1/2改良WPM+IBA0.05~1.5 mg·L-1 +蔗糖15~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1。
具体IBA的激素浓度可以为0.05、0.08、0.1、0.15、0.2、0.8、1.0、1.2、1.5mg·L-1，蔗糖的浓度可以为15、18、20、22、25、30、35 g·L-1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L-1。
所述的生根培养基最佳的激素和矿质元素及碳源组合浓度值为：最佳生根培养基为1/2改良WPM +IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂6 g·L-1；培养条件为无菌室内光周期为10~15h/d，优选12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，生根培养的周期为28~32天，优选30天。由此生根率最高可达95%，平均生根条数为4.5条，根长2~5厘米，诱导生成的根比较粗壮。
在上述方案的基础上，步骤f中，将生根试管苗置于自然环境中6~10天，一般为一周，取出洗净，用500~600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩的混合基质中，一般草炭土:珍珠岩＝2:1，起始6~10天（一般为一周）内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，其后（约二周后）按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照。
本发明的有益效果是：本发明极大加快了轮叶蒲桃的繁殖速度，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导增殖出大量不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系，年繁殖系数为1：100000，成本由原来的每株500元，降低至每株2～3元，且不受季节限制，环境易控，适合全国各地。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的轮叶蒲桃种苗品质高，一致性好。
附图说明
图1为本发明繁育优株之一；
图2为本发明诱导增殖培养；
图3为本发明生根试管苗；
图4为本发明炼苗移栽图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步具体的说明。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
一种轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，轮叶蒲桃外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得试管苗，进行移栽，包括下述步骤：
a：轮叶蒲桃优株长期生长于野外自然条件下，自身附带的污染物较多，表面消毒获得无菌材料具有难度。本技术采用浓度为1%的稀释洗洁精（质量体积比）浸泡擦洗，去掉枝条表面的毛，初步降低污染后，再流水冲洗20分钟。切取成为长度0.5~2.5cm，腋芽位于中间的茎段，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，在超净工作台上，先用72%浓度的酒精消毒30~60s，再用无菌水冲洗3~4次，然后用0.1~0.2%的升汞液浸泡15~30分钟，用无菌水冲洗至消毒液无残留，得到无菌的外植体，平均无菌率80%。其中升汞溶液过滤后可反复加以使用，消毒效果不变，可减少对环境的破坏。
步骤a中，所述的外植体修切为长度0.5~2.5cm，腋芽位于中间的茎段，可以为0.5、0.7、0.9、1、1.5、2.0、2.5cm等该范围内的任一长度。
步骤a中，所述的消毒处理的方法包括：先用72%浓度的酒精消毒30~60s，再用无菌水冲洗3~4次，然后用加有0.1~0.2%的升汞液浸泡15~30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
具体的，72%浓度酒精消毒可以为30s、40s、50s、60s等，升汞液浓度可以为0.1%、0.15%、0.2%等，浸泡时间可以为15、18、20、25、28、30分钟等。
b：步骤a中消毒所得到的无菌外植体接种到初代培养基：改良WPM+BA0.15~0.25mg·L-1+NAA0.15~0.25mg·L-1+蔗糖25~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1上。BA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L-1，NAA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L-1等，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35 g·L-1等，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L-1等。
培养基pH调为5.8左右，一个试管接种一个，避免交叉感染，于光周期为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为25℃的无菌室内培养25天。 无菌操作室在使用前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，紫外灯在关闭10分钟后，才可进行接种操作；接种用具在121℃条件下高压灭菌35分钟，培养基在121℃条件下高压灭菌18分钟。
优选的初代培养基为：改良WPM+BA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1；在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10~15h/d，优选12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为22~28天，优选25天。
c：将初代培养获得的健壮一致的无菌苗转到增殖培养基：改良WPM+BA0.1~1.5mg·L-1+NAA0.01~0.5mg·L-1+蔗糖20~40g·L-1+琼脂4~12 g·L-1。具体的，BA的激素浓度可以为0.1、0.2、0.5、1.0、1.2、1.4、1.5mg·L-1，NAA的激素浓度可以为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1等，蔗糖的浓度可以为20、25、28、30、32、35、40 g·L-1等，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12g·L-1等。
本发明中所述的增殖培养基最佳的激素组合及浓度为：改良WPM+BA0.4 mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6 g·L-1；在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选2000lx，培养温度优选25℃，培养周期优选30天，轮叶蒲桃试管苗的月增殖系数为1:2.5~3。诱导出的丛生芽发育正常，叶色浓绿，长势旺盛，可以做为轮叶蒲桃扩繁增殖的培养基。
d：在增殖培养基上，轮叶蒲桃试管苗生长高度参差不齐，将丛生芽分切后，转移至壮苗培养基：改良WPM+BA0.15~0.25mg·L-1 +IBA0.15~0.25mg·L-1+蔗糖25~35 g·L-1+琼脂4~12 g·L-1。具体的，在壮苗培养基中，BA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L-1，IBA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L-1等，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35 g·L-1等，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L-1等。
本发明优选的壮苗培养基为：
改良WPM+BA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1；在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选2000lx，培养温度优选25℃，培养周期优选20天，试管苗长至2~6cm高，叶片4~6对，比较整齐，可以用来诱导生根。
e：大量元素减半的1/2改良WPM比改良WPM更有利于生根，本发明中生根培养基为：1/2改良WPM+IBA0.05~1.5 mg·L-1 +蔗糖15~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1。具体IBA的激素浓度可以为0.05、0.08、0.1、0.15、0.2、0.8、1.0、1.2、1.5mg·L-1等，蔗糖的浓度可以为15、18、20、22、25、30、35 g·L-1等，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L-1等。
轮叶蒲桃生根培养时最佳的激素和矿质元素及碳源组合浓度值为：1/2改良WPM +IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂6 g·L-1；培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选2000lx，培养温度优选25℃，生根培养的周期28~32天，优选30天。由此生根率最高可达95%，平均生根条数为4.5条，根长2~5厘米。诱导生成的根比较粗壮。
f：将轮叶蒲桃生根试管苗置于自然环境中6～10天，一般为一周，取出洗净，用500~600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩的混合基质中，本发明中草炭土:珍珠岩＝2:1，起始6~10天（一般为一周）内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，其后（约二周后）按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照。轮叶蒲桃成活率可以达到90%。
采用本发明所提供的方法，对加快轮叶蒲桃的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导出不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。年繁殖系数为1:100000，成本由原来的优株每株500元，降低至每株2~3元。且不受季节限制，环境易控，适合全国各地生产，直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的轮叶蒲桃种苗品质高，一致性好。
本发明未涉及部分均与现有技术相同或采用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，取轮叶蒲桃外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生试管苗，并进行栽种，其特征在于按下列步骤进行：
a、选择生长健壮，无病虫害轮叶蒲桃带腋芽的枝条作为起始外植体，用洗洁精擦洗表面后，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理；
b、将消毒处理后的外植体接种到初代培养基上，进行初代培养；
c、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为：
改良WPM+BA0.1~1.5mg·L-1+NAA0.01~0.5mg·L-1+蔗糖20~40g·L-1+琼脂4~12 g·L-1，诱导不定芽；
d、将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养；
e、将经壮苗培养生长到2.5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，该生根培养基为：
1/2改良WPM+IBA0.05~1.5 mg·L-1 +蔗糖15~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1；
f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土的混合基质中进行栽种。
2.根据权利要求1所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于步骤a中，取轮叶蒲桃包含腋芽的枝条，切取成为长度0.5~2.5cm，腋芽位于中间的茎段，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，进行消毒处理。
3.根据权利要求1所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于步骤a中，所述的消毒处理的方法为：先用浓度为72%的酒精消毒30~60s，再用无菌水冲洗3~4次，然后用加有0.1~0.2%的升汞液浸泡15~30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
4.根据权利要求1所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于步骤b中，所述的初代培养基为：改良WPM+BA0.15~0.25mg·L-1+NAA0.15~0.25mg·L-1+蔗糖25~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1。
5.根据权利要求1所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于步骤c中，所述的增殖培养基为：改良WPM+BA0.4 mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6 g·L-1。
6.根据权利要求1所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于步骤d中，所述的壮苗培养基为：改良WPM+BA0.15~0.25mg·L-1+IBA0.15~0.25mg·L-1+蔗糖25~35 g·L-1+琼脂4~12 g·L-1。
7.根据权利要求1所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于步骤e中，所述的生根培养基为：1/2改良WPM +IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂6 g·L-1。
8.根据权利要求1所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：所述的初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为10~15h/d，光照强度1500~2500lx，培养温度为室温。
9.根据权利要求1或8所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：所述初代培养的周期为22~28天，增殖培养的周期为28~32天，壮苗培养的周期为18~22天，生根培养的周期为28~32天。
10.根据权利要求1所述的轮叶蒲桃离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于步骤f中，将生根试管苗置于自然环境中6~10天，取出洗净根部，用500~600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土：珍珠岩＝2:1的混合基质中，起始6~10天内保持苗的叶面湿润并适当遮阳，其后按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。
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