CN100586275C - 石斛属植物的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
石斛属植物的快速繁殖方法，取石斛果实内种子或茎尖或带腋芽的幼茎，果在纯乙醇中沾一下，然后在酒精灯火焰上燃烧然后用于接种；茎尖或幼茎在70%乙醇中浸一下，投入0.2%升汞8min，无菌水冲洗干净后接种在培养基中，待种子萌发或茎尖和幼茎长成拟原球茎，进行继代培养大量增殖，然后将原球茎放在分化芽的培养基上，待芽条高2-3cm时转入生根培养基，待试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm及以上时，出瓶移栽。
Description
所属领域：本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及石斛属植物的快速繁殖方法。
背景技术：云南省是商品石斛主要产地之一，种类多，资源丰富(全国76种，云南58种，占全国种类的76.3％)。石斛药材原植物包含石斛属植物39种，金石斛属植物2种和石仙桃属植物4种。石斛类植物是常见名贵中药材(具有滋阴清热，生津益胃。润肺止咳。明目强身等功效)。人们长期无限制，掠夺性和毁灭性的采挖和近年来大量深层次的研究开发(发现石斛属许多种还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用)。再加上石斛属物种在自然界结实率低，种子因无胚乳，萌发率5％以下。远不能满足目前国内外需求。我国和国际组织(IUCN)都明文规定，石斛属为禁止贸易的物种加以保护。现有技术中未见有云南药用石斛的快速繁殖方法的报道。
发明内容：本发明的目的在于为石斛属40种物种提供种苗快速繁殖方法，为挽救濒危的石斛类物种，使之成为可再生药源，为石斛类GAP种植提供数百万优良、一致种苗的技术有参考和实用价值，是目前保护和持续开发利用石斛类名贵中药的多、快、好、省的对策。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
石斛属的快速繁殖方法，取石斛果实内种子或茎尖或带腋芽的幼茎，果在纯乙醇中沾一下，然后在酒精灯火焰上燃烧然后用于接种；茎尖或幼茎在70％乙醇中浸一下，投入0.2％升汞8min，无菌水冲洗干净后接种在培养基中，待种子萌发或茎尖和幼茎长成拟原球茎，进行继代培养大量增殖，然后将原球茎放在分化芽的培养基上，待芽条高2-3cm时转入生根培养基，待试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm及以上时，出瓶移栽。
具体地，取野外采集或杂交授粉所结的果实，完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后，在无菌条件下将果皮打开，将种子播种在花宝1号(N∶P∶K＝7∶6∶19)3g.L-1的琼脂培养基上；而开裂果用尼龙布包裹散落种子，在0.2％Hgcl2中消毒6-8min，无菌水冲洗干净后播种在花宝1号(N∶P∶K＝7∶6∶19)3g.L-1的琼脂培养基上；未成熟的果内种子可播种在花宝1号3g.L-1+NAA1mg.L-1的琼脂培养基上，培养室温度25±2℃，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d，培养基PH为5，培养8-12天种子由黄色转绿，呈球形增大，基部有丝状毛的原球茎，继代培养在1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上，30天后，分化出1cm小芽和0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高约2-3cm芽条，转入1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的生根壮苗培养基培养1个月后加强光照至4000Lx，培养一个月，当试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔藓和陶粒等，基质要用20∶1的水∶甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在荫蔽度70％大棚内，棚内温度控制在20℃-28℃，注意保湿和排水，7-15天用1/10MS液喷施一次，待试管苗长出新根或新叶后便可定植，依石斛属种类不同，1-3年均可收护。
具体地，将野外采集到的石斛属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上，培养室温度保持为25±2℃，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d，培养基PH为5，培养30-60天，腋芽处可抽生新枝，新枝可切割重复培养，茎尖抽生新枝短呈丛芽状，在上述培养基上继续培养，长成完整试管苗供移栽；也可接种在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的琼脂培养基上，外植体基部可分化出大量拟原球茎，拟原球茎在1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上培养30天后，分化出1cm小芽和0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高2-3cm芽条，再转入1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的生根壮苗培养基培养1个月，此时光照加强至4000Lx，当试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔藓和陶粒等，基质要用20∶1的水∶甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在大棚内荫蔽度70％，棚内温度控制在20℃-28℃，注意保湿和排水，7-15天用1/10MS液喷施一次，待试管苗长出新根或新叶后，依石斛属种类不同，1-3年均可收护。
上述方法所涉及的石斛属种类优选长苏石斛Dendrobiumbrymerianum或球花石斛D.chysiflorum或鼓槌石斛D.chrysotoxume或铁皮石斛D.candidum或金钗石斛杂种选系D.phalaenosis×D.nobile或短棒石斛D.capillipes或兜唇石斛D.aphyllum或束花石斛D.chrysanthum或玫瑰石斛D.crepidatum或叠鞘石斛D.aurantiacumvar.deuneanum或密花石斛D.densiflorum流苏石斛D.fimbriatum或棒节石斛D.findlayanum美花石斛D.loddigesii或金钗石斛D.aobile或长距石斛D.longicorum或报春石斛D.primulinum或大苞鞘石斛D.wardianum或霍山石斛D.huoshanense或齿瓣石斛D.devonianum或矮石斛D.bellatulum或串珠石斛D.falooneri或疏花石斛D.henryi或细茎石斛D.moniliforme或黑毛石斛D.williamsonii或喉红石斛D.christyanum 或晶帽石斛D.crystallimun或杯鞘石斛D.gratiotissimum或小黄花石斛D.jenkinsii或苏唇石斛D.harveyanum或梳唇石斛D.strongylanthum或尖刀唇石斛D.heterocarpum或喇叭唇石斛D.lieniflorum或翅梗石斛D.trigonopus或草石斛D.compactum或秋石斛D.phalaenosis或石斛属一种Dendrobium.sp.或叉唇石斛D.stuposum或勐海石斛D.minutiflorum或肿节石斛D.pendulum。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
1材料与方法
1.1供试材料
[1]长苏石斛Dendrobium brymerianum西双版纳
[2]球花石斛D.chysiflorum(2个居群)景洪、昆明
[3]鼓槌石斛D.chrysotoxume(4个居群)勐海、保山、思茅、景洪
[4]铁皮石斛D.candidum(9个居群)广南、思茅、文山(3个居群)浙江、盈江、安宁、小哨
[5]金钗石斛杂种选系D.phalaenosis×D.nobile
[6]短棒石斛D.capillipes(2个居群)西双版纳、鲁甸
[7]兜唇石斛D.aphyllum(2个居群)腾冲、景洪
[8]束花石斛D.chrysanthum(3个居群)丽江、思茅、景洪
[9]玫瑰石斛D.crepidatum文山
[10]叠鞘石斛D.aurantiacum var.deuneanum(2个居群)昆明、勐海
[11]密花石斛D.densiflorum
[12]流苏石斛D.fimbriatum(9个居群)缅甸、越南、高黎贡山、西双版纳等
[13]棒节石斛D.findlayanum(2个居群)景洪、思茅
[14]美花石斛D.loddigesii
[15]金钗石斛D.aobile(8个居群)石屏、景洪(2个居群)、勐腊、保山、兰坪、勐海、昆明
[16]长距石斛D.longicorum
[17]报春石斛D.primulinum
[18]大苞鞘石斛D.wardianum(2个居群)昆明、景洪
[19]霍山石斛D.huoshanense
[20]齿瓣石斛D.devonianum(2个居群)屏边、景洪
[21]矮石斛D.bellatulum(2个居群)文山、景洪
[22]串珠石斛D.falooneri
[23]疏花石斛D.henryi
[24]细茎石斛D.moniliforme(2个居群)高黎贡山、丽江
[25]黑毛石斛D.williamsonii
[26]喉红石斛D.christyanum昆明
[27]晶帽石斛D.crystallimun(2个居群)腾冲、景洪
[28]杯鞘石斛D.gratiotissimum(3个居群)鲁甸、景洪、思茅
[29]小黄花石斛D.jenkinsii(2个居群)文山、景洪
[30]苏唇石斛D.harveyanum景洪
[31]梳唇石斛D.strongylanthum
[32]尖刀唇石斛D.heterocarpum(3个居群)昆明、景洪、思茅
[33]喇叭唇石斛D.lieniflorum(2个居群)腾冲、镇康
[34]翅梗石斛D.trigonopus
[35]草石斛D.compactum(2个居群)思茅、腾冲
[36]秋石斛D.phalaenosis(2个居群)泰国、安宁
[37]石斛属一种Dendrobium.sp.麻栗坡
[38]叉唇石斛D.stuposum
[39]勐海石斛D.minutiflorum
[40]肿节石斛D.pendulum
1.2方法
培养室温度25±2℃，保存室温度15-20℃，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d。培养基随培养目的和不同发育阶段有所不同。培养基PH为5。
外植体来源于石斛属各种的果实内种子或茎尖，果在纯乙醇中沾一下，然后在酒精灯火焰上烧后用于接种。茎尖或幼茎在70％乙醇中浸一下，投入0.2％升汞8min左右，无菌水冲洗干净后接种。
2结果
2.1组织培养和快速繁殖技术
在本发明收集保存的石斛属40个种中，为了保持遗传性稳定和规模化生产目的采用了种子无菌培养和茎尖、茎节分生组织培养两种方式。
2.1.1种子无菌培养
种子来源于野外采集和自己杂交授粉所结的果实。野外采集的开裂果，收集种子用尼龙布包裹，在0.2％Hgcl2中消毒7min，无菌水冲洗干净后播种在花宝1号(N∶P∶K＝7∶6∶19)3g.L-1的琼脂培养基上。完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后即可将果皮打开将种子播种在上述培养基上。未成熟的果内种子可播种在花宝1号3g.L-1+NAA1mg.L-1(单位下同)的琼脂培养基上。石斛属种子大多呈黄色，培养约10天左右即可转绿，增大，继而长成顶端有叶尖或冒出的芽，基部有丝状毛的原球茎，显示种子萌发且萌发率较高(达95％以上)。
2.1.2分生组织培养
将野外采集到的石斛属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上，培养30天左右，腋芽处可抽生新枝，新枝可切割重复培养，茎尖抽生新枝短呈丛芽状。在此培养基上，它们可长成完整试管苗，供移栽。
如果把茎尖和幼茎接种在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的琼脂培养基上，外植体基部可分化出大量拟原球茎。拟原球茎在1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上，也可以长成大苗供移栽。
2.1.3继代繁殖
石斛属原球茎增殖速度30天至60天(依种量)平均可达1∶6-10倍，由5个人组成的生产车间，年产石斛试管苗可达120万。
上一步骤原球茎和拟原球茎培养基培养30天左右，可得到10％1cm小芽和10％0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高约2-3cm芽条(占50％左右)，转入生根壮苗培养基(1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％)培养1个月后加强光照(4000Lx及以上)，培养一个月左右，试管苗可达到移苗标准。整个生产周期月4.5个月到6个月。
2.1.4试管苗移栽
当试管苗至少4-5片伸展叶根系正常，健康，高度达6cm左右时，即可出瓶供移栽，出瓶时要小心不能折伤叶片和根尖，清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔藓和陶粒等，基质要用20∶1的水∶甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒。栽后放在大棚内荫蔽度约70％，棚内温度控制在20℃-28℃，注意保湿和排水。待试管苗长出新根或新叶后，7-15天用1/10MS液，喷施一次，促进幼苗生长，和提前收护。依石斛属种类不同一般1-3年均可收护。
本发明的方法可概括为：取野外采集或杂交授粉所结的石斛属果实，完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后，在无菌条件下将果皮打开，将种子播种在花宝1号(N∶P∶K＝7∶6∶19)3g.L-1的琼脂培养基上；而开裂果用尼龙布包裹散落种子，在0.2％Hgcl2中消毒6-8min，无菌水冲洗干净后播种在花宝1号(N∶P∶K＝7∶6∶19)3g.L-1的琼脂培养基上；未成熟的果内种子可播种在花宝1号3g.L-1+NAA1mg.L-1的琼脂培养基上，培养室温度25±2℃，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d，培养基PH为5，培养8-12天种子由黄色转绿，呈球形增大，基部有丝状毛的原球茎，继代培养在1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上，30天后，分化出1cm小芽和0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高约2-3cm芽条，转入1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的生根壮苗培养基培养1个月后加强光照至4000Lx，培养一个月，当试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔藓和陶粒等，基质要用20∶1的水∶甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在荫蔽度70％大棚内，棚内温度控制在20℃-28℃，注意保湿和排水，7-15天用1/10MS液喷施一次，待试管苗长出新根或新叶后便可定植，依石斛属种类不同，1-3年均可收护。
本发明的方法可概括为：将野外采集到的石斛属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上，培养室温度保持为25±2℃，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d，培养基PH为5，培养30-60天，腋芽处可抽生新枝，新枝可切割重复培养，茎尖抽生新枝短呈丛芽状，在上述培养基上继续培养，长成完整试管苗供移栽；也可接种在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的琼脂培养基上，外植体基部可分化出大量拟原球茎，拟原球茎在1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上培养30天后，分化出1cm小芽和0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高2-3cm芽条，再转入1/2MS+NAA1+土豆泥3％+香蕉泥15％的生根壮苗培养基培养1个月，此时光照加强至4000Lx，当试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔藓和陶粒等，基质要用20∶1的水∶甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在大棚内荫蔽度70％，棚内温度控制在20℃-28℃，注意保湿和排水，7-15天用1/10MS液喷施一次，待试管苗长出新根或新叶后，依石斛属种类不同，1-3年均可收护。
Claims (3)
1、石斛属植物的快速繁殖方法，取野外采集或杂交授粉所结的石斛果实，在纯乙醇中沾一下，完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后，在无菌条件下将果皮打开，将种子播种在花宝1号N∶P∶K＝7∶6∶19 3g.L-1的琼脂培养基上；开裂果，用尼龙布包裹散落种子，在0.2％HgCl2中消毒6-8min，无菌水冲洗干净后播种在花宝1号N∶P∶K＝7∶6∶19 3g.L-1的琼脂培养基上；未成熟的果内种子播种在花宝1号3g.L-1+NAA1mg.L-1的琼脂培养基上，培养室温度25±2℃，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d，培养基pH为5，培养8-12天种子由黄色转绿，呈球形增大，基部有丝状毛的原球茎，继代培养在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上，30天后，分化出1cm小芽和0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高约2-3cm芽条，转入1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3％+香蕉泥15％的生根壮苗培养基培养1个月后加强光照至4000Lx，培养一个月，当试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔藓和陶粒，基质要用20∶1的水∶甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在荫蔽度70％大棚内，棚内温度控制在20℃-28℃，注意保湿和排水，7-15天用1/10MS液喷施一次，待试管苗长出新根或新叶后便可定植，依石斛属种类不同，1-3年均可收护。
2、石斛属植物的快速繁殖方法，将野外采集到的石斛属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上，培养室温度保持为25±2℃，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d，培养基pH为5，培养30-60天，腋芽处可抽生新枝，新枝可切割重复培养，茎尖抽生新枝短呈丛芽状，在上述培养基上继续培养，长成完整试管苗供移栽；或者接种在1/2MS或1/2MS+BA0.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1的琼脂培养基上，外植体基部可分化出大量拟原球茎，拟原球茎在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3％+香蕉泥15％的琼脂培养基上培养30天后，分化出1cm小芽和0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高2-3cm芽条，再转入1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3％+香蕉泥15％的生根壮苗培养基培养1个月，此时光照加强至4000Lx，当试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔藓和陶粒，基质要用20∶1的水∶甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在大棚内荫蔽度70％，棚内温度控制在20℃-28℃，注意保湿和排水，7-15天用1/10MS液喷施一次，待试管苗长出新根或新叶后，依石斛属种类不同，1-3年均可收护。
3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述石斛种类为长苏石斛Dendrobium brymerianum或球花石斛D.chysiflorum或鼓槌石斛D.chrysotoxume或铁皮石斛D.candidum或金钗石斛杂种选系D.phalaenosis×D.nobile或短棒石斛D.capillipes或兜唇石斛D.aphyllum或束花石斛D.chrysanthum或玫瑰石斛D.crepidatum或叠鞘石斛D.aurantiacum var.deuneanum或密花石斛D.densiflorum流苏石斛D.fimbriatum或棒节石斛D.findlayanum美花石斛D.loddigesii或金钗石斛D.aobile或长距石斛D.longicorum或报春石斛D.primulinum或大苞鞘石斛D.wardianum或霍山石斛D.huoshanense或齿瓣石斛D.devonianum或矮石斛D.bellatulum或串珠石斛D.falooneri或疏花石斛D.henryi或细茎石斛D.moniliforme或黑毛石斛D.williamsonii或喉红石斛D.christyanum或晶帽石斛D.crystallimun或杯鞘石斛D.gratiotissimum或小黄花石斛D.jenkinsii或苏唇石斛D.harveyanum或梳唇石斛D.strongylanthum或尖刀唇石斛D.heterocarpum或喇叭唇石斛D.lieniflorum或翅梗石斛D.trigonopus或草石斛D.compactum或秋石斛D.phalaenosis或石斛属一种Dendrobium.sp.或叉唇石斛D.stuposum或勐海石斛D.minutiflorum或肿节石斛D.pendulum。
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