CN103371100B

CN103371100B - 春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法

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Publication number: CN103371100B
Application number: CN201210113266.8A
Authority: CN
Inventors: 殷丽青; 汤桂钧; 周音; 李秀芬; 黄卫昌; 胡永红; 将建平; 刘炤; 胡海锋; 范晓芬
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-04-17
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2032-04-17
Also published as: CN103371100A

Abstract

本发明公开了一种春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：1)外植体的选择和消毒，2)原球茎的诱导培养，3)原球茎的增殖与分化，4)壮苗与生根培养，5)试管苗移栽。采用本发明方法进行春石斛兰组织培养快速繁殖种苗，培养程序简单，外植体无污染，繁殖系数大，生产成本低，种苗质量高，克服现有技术中繁殖系数低等缺陷。

Description

春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明属植物组织培养技术领域，具体涉及一种春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

石斛兰(Dendrobium)是兰科石斛兰属多年生花卉，石斛兰属是兰科植物中最大的一个属，原产地主要分布在亚洲热带和亚热带，澳大利亚和太平洋岛屿，全世界约有1000多种，我国有约76种，其中大部分分布于西南、华南、台湾等地。

在园艺学上石斛兰的品种一般以其开花期来划分春石斛系和秋石斛系两大类，春石斛兰(Dendrobium nobile)属落叶温带种，其花色鲜艳，豪华灿烂，常作为盆花栽种；秋石斛则为流行的切花。石斛兰花色繁多，有玫红、粉红、黄色、白色等，艳丽多彩，是珍贵的观赏名花，其中一些种类还具有药用价值。

近年来，春石斛兰在东南亚一带非常受欢迎，其需求量增长甚快。目前我国主要依靠从日本等国进口种苗，有关科学家开展了春石斛兰的组织培养研究。毛碧增等较早开展了春石斛的组织培养技术研究，研究了不同灭菌方式对成活率的影响，BA与NAA不同浓度组合对诱导不定芽及不定芽增殖的影响，GA₃和亚精胺对壮苗的作用。结果表明：0.1％HgCl₂6min组合嫩茎成活率最高，0.1％HgCl₂8min老茎成活率最高，0.5mg/L NAA和1.0mg/L BA组合最利于诱导不定芽，GA₃和亚精胺对不定芽的增殖和生长有促进作用【毛碧增等，春石斛组织培养技术研究，浙江大学学报(理学版)，2003，30(5)：580-583】。

韩磊等报道了不同激素对春石斛的组织培养影响研究，用1～3mm的春石斛茎尖为外植体，以1/2MS为基本培养基，调节不同激素水平诱导芽体萌发，进行繁殖培养。研究结果表明：萌芽诱导阶段：1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+椰子汁200mL/L+蔗糖30g/L+活性碳3g/L+琼脂5g/L中萌芽早，生长快；继代和增殖培养阶段：以1/2MS+6-BA 0.5mg/L+NAA2.0mg/L+椰子汁200mL/L+蔗糖15g/L+活性碳3g/L+琼脂5g/L效果最好；生根阶段培养基：1/2MS+NAA 0.1mg/L+蔗糖15g/L+活性碳3g/L+琼脂5g/L，每茎段可生根4条肉质健壮，在培养过程中达到了较好的效果【韩磊等，不同激素对春石斛的组织培养影响研究初报，北方园艺，2007(3)：177～178】。

张爱香等报道了通过拟原球茎发生途径建立春石斛兰的组织培养体系【张爱香等，通过拟原球茎发生途径建立春石斛兰的组织培养体系，北方园艺2009(7)：120～122】。

但是，由于外植体易污染，操作技术要求高、繁殖率低、成本高；春石斛品种间差异大等原因，至今未见利用组织培养技术进行规模化生产春石斛兰种苗的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法。以春石斛兰八分熟蒴果的种子为外植体，采用培养基诱导生成原球茎进行离体快速繁殖，试管苗成活率达100％。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

所述的春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)外植体的准备和消毒：将春石斛兰人工授粉后进行套袋，约90～110天待其八分成熟后，摘取其蒴果，在超净工作台上，将蒴果表面用75％(体积比)酒精消毒30～60s后，再依次用15～20％(体积比)次氯酸钠溶液浸泡15-20min后无菌水冲洗。

2)原球茎的诱导培养：用无菌吸水纸吸干消毒后春石斛兰蒴果表面水分，用解剖刀切开蒴果，挑取石斛兰种子，接种于诱导培养基上进行暗培养。20～30d后，春石斛兰种子开始萌动，将培养物转移至光照下继续培养40-50d后逐渐萌发成圆锥状的原球茎。其中所述的诱导培养基配方为：MS+BA0.2～2.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L+水解酪蛋白0.5～1.5g/L+香蕉泥20～80g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.6。

3)原球茎的增殖与分化：将上述培养获得的原球茎转接于增殖与分化培养基中，培养、萌发、分化成大量不定芽。其中所述的增殖与分化培养基配方为：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+KT 0.2～0.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+水解酪蛋白0.5～1.5g/L+香蕉泥20～80g/L+蔗糖30～40g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.6。

4)壮苗与生根培养：将上述获得的不定芽切成单芽，接种于壮苗与生根培养基中，培养得生根试管苗。其中所述的壮苗与生根培养配方为：1/2MS+6-BA 0.1～0.2mg/L+IBA 0.5～1.5mg/L+香蕉泥20～30g/L+蔗糖20～30g/L，pH＝5.4～5.6。

5)试管苗的移栽：将上述获得的生根试管苗带瓶盖常温条件下炼苗5～7d，然后打开瓶盖再炼苗2～3d，将生根试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗去基部残留的培养基，移栽于以苔藓为基质的穴盘，浇水后保持温度25±2℃，空气湿度70～80％。

6)统计成活率：上述试管苗移栽45天后，统计成活率。

如无特殊说明，本发明所述的g/L是指在1L培养基中各组分的含量(单位为克)；1/2MS是指MS培养基中的无机盐成分减半。

有益效果：

1)本发明将春石斛兰授粉后进行套袋，并采用八分成熟的蒴果带果皮先后用70％(体积比)酒精和浓度为15-20％(体积比)的次氯酸钠溶液消毒后，切开蒴果挑取其种子进行组织培养。避免使用组织培养过程中常用的剧毒消毒剂--氯化汞，简化了消毒方法，大大降低了消毒液对外植体的影响，且所用消毒剂对人体健康和环境安全危害小。

2)采用本发明方法进行春石斛兰原球茎诱导培养，可有效控制污染现象，从未出现外植体污染状况，大大提高了工作效率并节省了研究成本。

3)采用本发明方法进行春石斛兰试管苗壮苗与生根时，不定芽在壮苗及生根的同时，还低倍增殖，可进一步增加繁殖系数，提高种苗繁殖效率。

4)采用本发明方法进行春石斛兰组织培养快速繁殖种苗，繁殖系数大(高达12.6)，种苗质量好，移栽成活率高(100％)，因此可以降低种苗繁殖成本，克服现有技术中繁殖系数低(常规春石斛兰分株繁殖，一年只能得到2～3倍的增殖速度)的缺陷。

附图说明

图1为春石斛兰原球茎的培养。

图2为春石斛兰原球茎的增殖与萌发。

图3为春石斛兰不定芽。

图4为春石斛兰生根试管苗。

图5为移栽前的春石斛兰试管苗。

图6为移栽成活后的春石斛兰试管苗。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1

1)外植体的准备和消毒：将春石斛兰人工授粉后进行套袋，100天左右摘取其蒴果。在超净工作台上，将蒴果表面用75％(体积比)酒精消毒30～60s后，再用15～20％(体积比)次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗3次。

2)原球茎的诱导培养：用无菌吸水纸吸干消毒后的春石斛兰蒴果表面水分，用解剖刀切开蒴果，挑取石斛兰种子，将其接种于诱导培养基上进行暗培养(诱导培培养基配方为：MS+BA 0.6mg/L+NAA 0.1mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+香蕉泥40g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.4～5.6)；20～30d后，春石斛兰种子开始萌动，将培养物转移至光照下继续培养，光培养40-50d后培养物逐渐萌发成圆锥状的原球茎(参看图1)。

3)原球茎的增殖与分化：将上述培养获得的原球茎转接于增殖与分化培养基中，进行增殖与分化培养(增殖与分化培养基配方为：MS+6-BA1.0mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+香蕉泥40g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.4～5.6)。35d左右，原球茎增殖系数达12.6，先形成的原球茎不断萌发成芽(参看图2)。

4)将上述获得的春石斛兰芽培养于新鲜的增殖与分化培养基中，培养物分化成大量不定芽(参看图3)。

5)壮苗与生根培养：将上述获得的不定芽切成单芽，接种于壮苗与生根培养基中，进行试管苗的壮苗与生根(壮苗与生根培养基配方为：1/2MS+6-BA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L+香蕉泥20g/L+蔗糖20g/L，pH＝5.4～5.6)；30d后形成生根试管苗(参看图4、图5)。

6)试管苗的移栽：将生根试管苗带瓶盖置于常温条件下炼苗5d，然后打开瓶盖再炼苗2d，将生根试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗去基部残留的培养基，移栽于以苔藓为基质的穴盘，浇水后保持温度25℃左右，空气湿度70～80％左右。

7)统计成活率：移栽45天后，统计得试管苗成活率为100％(参看图6)。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims

1.一种春石斛兰种苗的组织培养快速繁殖方法，以春石斛兰八分熟的蒴果种子为外植体，采用培养基诱导生成原球茎从而进行离体快速繁殖，具体包括以下步骤：

1)外植体的准备和消毒：将春石斛兰人工授粉后进行套袋，90～110天后待其八分成熟，摘取其蒴果，在超净工作台上，用75％(体积比)酒精消毒30～60s后，再用15～20％(体积比)次氯酸钠溶液浸泡、无菌水冲洗；

所述的春石斛兰八分熟的蒴果种子，其个体大小接近成熟的春石斛蒴果，颜色为青绿色，种壳不硬、不裂开；

2)原球茎的诱导培养：用无菌吸水纸吸干消毒后的春石斛兰蒴果表面水分，用解剖刀切开蒴果，挑取石斛兰种子，接种于诱导培养基上进行暗培养，20～30d后转移至光照下培养，继续培养40-50d后逐渐萌发成圆锥状的原球茎；

所述的诱导培养基配方为：MS+BA0.2～2.0mg/L+NAA0.05～0.5mg/L+水解酪蛋白0.5～1.5g/L+香蕉泥20～80g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.6；

3)原球茎的增殖与分化：将原球茎转接于增殖与分化培养基中，萌发、分化成大量不定芽；

所述的增殖与分化培养基配方为：MS+6-BA0.5～1.0mg/L+KT0.2～0.5mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+水解酪蛋白0.5～1.5g/L+香蕉泥20～80g/L+蔗糖30～40g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.6；

4)壮苗与生根培养：将不定芽切成单芽，接种于壮苗与生根培养基中，培养得生根试管苗；

所述的壮苗与生根培养基培养为：1/2MS+6-BA0.1～0.2mg/L+IBA0.5～1.5mg/L+香蕉泥20～30g/L+蔗糖20～30g/L，pH＝5.4～5.6；

5)试管苗的移栽：将生根试管苗带瓶盖置于常温条件下炼苗5～7d，打开瓶盖再炼苗2～3d，将生根试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗去基部残留的培养基，移栽于以苔藓为基质的穴盘，浇水后保持温度25±2℃，空气湿度70～80％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的暗培养温度为24～26℃，黑暗，无光照。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，光照培养温度为24～26℃，光照强度为1500～2500勒克斯。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)、步骤4)是在光照下培养。