CN109329047B - 一种提高玉铃花组织培养容器苗效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种提高玉玲花组织培养容器苗效率的方法，包括以下步骤：1）对优选玉玲花种子进行浓硫酸处理，洗净后置入萌发培养基中进行无菌培养，发芽后截取带芽茎段作为外植体；2）将外植体接种到诱导培养基中培养；3）优选带不定芽的愈伤组织，截取后接种到诱导培养基中培养；4）优选无根芽苗接种到生根培养基中培养；5）待根长到4‑5cm时，将组培苗先移栽至以蛭石基质的容器中，通过浇营养液进行过度培养，经过18‑21d的环境适应性驯化后移至以泥炭土为基质的容器中。该方法通过改进无菌外植体获取的途径，改良组织培养基的配置方案，优化组织培养幼苗的训化方法，提高了组织培养容器苗的效率。
Description
技术领域
本发明属于植物种苗繁殖技术领域，具体涉及一种玉铃花的组织培养快速繁育方法。
背景技术
玉铃花(styrax abassia)，野茉莉科，野茉莉属，小乔木或灌木。花朵芳香、树资优美，是一种优良的园林绿化观赏树种。并且，玉铃花花朵可提取芳香油；种子富含油脂可制作润滑油等；木材致密可供制作器具等。目前市场对玉铃花的需求量逐年增加，但苗木供应稀少。
玉铃花种子外皮坚硬透水性差，内皮有一层致密保护膜包裹种胚，造成玉铃花播种育苗周期长且发芽率低。扦插繁殖技术目前成活率较低，且前期需要营建大量的采穗用苗，增加生产成本同时延长了生产周期，难以满足日益增大的市场需求量。王奎玲(玉铃花的组织培养与快速繁殖，植物生理学通讯，2010,9(46),959-960)，李俊卿(崂山野生玉铃花引种与繁育研究，青岛农业大学，2008，36-43)，陈甜甜(玉玲花高效快繁技术研究，时代农机，2017,6(44),109-110)等研究了玉铃花的组织培养技术。
但在实际操作过程中，发现还存在以下问题：(1)从母树上截取的外植体(带芽茎段)表面消毒困难，通过升汞进行灭菌处理时，所用剂量和处理时间较难掌握，污染不易根除的同时易对外植体造成伤害，导致外植体褐化、死亡；(2)不定芽在MS培养基上较易褐化；(3)生根苗直接移栽至土壤中成活率较低；表现为幼苗从实验室环境过渡到适应田间环境的过程中容易死亡，导致玉铃花组织培养方法难以应用于生产。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的不足而提供一种提高玉铃花的组织培养效率和移栽驯化的方法，该方法通过改进无菌外植体获取的途径，改良组织培养基的配制方案，优化组织培养幼苗的训化方法，提高了组织培养容器苗的效率。因而，本发明提供一种提高玉铃花组织培养容器苗效率的方法，可以提高玉铃花组织快繁效率和移栽成活率，弥补了玉铃花繁殖周期长、效率低的现状，同时也缓解了市场对玉铃花苗木需求的问题。
具体地，本发明提供一种提高玉铃花组织培养容器苗效率的方法，其特征在于通过以下步骤进行：
1)消毒处理玉铃花种子后置于种子萌发培养基中培养；
2)截取萌发的幼苗的带芽茎段作为外植体，在诱导培养基中进行培养；
3)截取带愈伤组织的小不定芽，置入新的诱导培养基中继续继代培养；
4)将无根不定芽定植在生根培养基中进行生根培养。
进一步包括下述步骤，5)将根长达4-5cm的幼苗移植锥形穴盘中，以蛭石为基质，每2-3天浇一次营养液，18-21d后移植到无纺布容器中以泥炭土和珍珠岩(优选比例为2:1)为基质。
其中，步骤1)中所述的种子萌发培养基配制方法：以1/2MS培养基为基础培养基，添加60-80mg/L的赤霉素，60-80mg/L的Vc，10－20g/L的蔗糖，400－600mg/L的活性炭和8－12g/L的琼脂粉，并调节培养基pH值至5.6－6.0，优选为5.8；其中，进一步优选地，赤霉素浓度为60mg/L和Vc浓度在80mg/L，和/或15g/L的蔗糖，500mg/L的活性炭，10g/L的琼脂粉。
种子萌发培养基中添加的赤霉素、Vc和活性炭对种子萌发期间，营养物质的分解、合成、转化均有重要作用，可以有效促进种子的萌发。其中，赤霉素可以打破种子休眠，促进种子萌发，并缩短萌发时间。Vc作为还原剂可以和醌类物质发生反应，降低褐化程度，提高种子萌发率。活性炭可以吸附酚类、醌类物质、缓释激素，从而提高种子的萌发率。
步骤1)的具体操作是将优选的种子置入浓硫酸中浸泡1h，倒掉浓硫酸后自来水冲洗，晾干；随后在超净台中，用70％的乙醇浸泡30s，0.1％的升汞中灭菌3min，无菌水清洗4-5次，接种在种子萌发培养基中：每个培养瓶放置3-4粒种子。4℃低温处理3d后置入组培室中(温度25℃，光暗节律为：光16h/d，暗8h/d，光照强度4000lux)。
步骤2)和步骤3)中所述的诱导培养基配制方法：以WPM培养基为基础培养基，添加0.03-0.08mg/L的TDZ，0.3-0.8mg/L的BA，以及蔗糖和琼脂粉，调节培养基pH值至5.6－6.0，优选为5.8，进一步优选地，TDZ的浓度为0.05mg/L，BA的浓度为0.5mg/L，和/或15g/L的蔗糖，10g/L的琼脂粉。对比已有技术，玉铃花组织培养的基础培养基一般为高盐浓度的MS或1/2MS培养基，该培养基的有益之处是外植体的不定芽发生率较高，但其弊端是外植体在MS培养基上会出现褐变、死亡现象，且该现象会随着培养时间的增加而增加。本案选用低盐浓度的WPM培养基，虽然不定芽的诱导率较低，但褐化率低从而提高了外植体的保存率，因此在不定芽的后期生长促进方面具有很大的潜力。
步骤2)中具体是选择萌发10-13d的幼苗，截取0.8-1.2cm的带腋芽的茎段，按植物形态学将下端插入诱导培养基中。
步骤4)中所述的生根培养基配制方法：以1/2WPM培养基为基础培养基，添加0.05-0.1mg/L的IBA，0.03-0.05mg/L的NAA，1－3mg/L的活性炭和7-8g/L琼脂粉，调节培养基pH值至5.6－6.0，优选为5.8，进一步优选地0.05mg/L的IBA，0.03mg/L的NAA，2mg/L的活性炭，或者0.1mg/L的IBA，0.05mg/L的NAA。本发明中的生根培养基以1/2WPM培养基为基础培养基，降低外植体褐化的同时，通过按一定比例添加IBA和NAA促进了不定根发生，并且添加活性炭和降低琼脂粉含量，也可促进了根的生长。其中活性炭可以降低褐化率，而适当浓度的琼脂粉有益于根的生长发育。
步骤5)中所述的营养液配制方法：以Hoagland营养液为基础，添加0.005－0.02mg/L的壳寡糖，优选为0.01mg/L的壳寡糖；调节培养基pH值至6.8－7.2，优选为7.0。
步骤5)中组培苗移栽具体操作为：将生根苗从组培瓶中取出后移至锥形穴盘中，用蛭石掩埋，之后用营养液浇透。穴盘置于人工气候室中(湿度60％，温度25℃，光照)，每2-3天浇营养液一次，培养8-12d时喷施一次叶面肥(KH2PO4)。培养18-21d后将幼苗从穴盘中取出。之后置入泥炭土基质(泥炭土：珍珠岩＝2:1)中培养，用水浇透，置于大棚中培养。所述的营养液配制方法：以Hoagland营养液为基础，添加0.01mg/L的壳寡糖，用1mol/L的NaOH或HCl调节培养基pH值至7.0。相较于现有技术，本发明采用蛭石配合营养液的方法过度培养组织培养幼苗，蛭石松软保水能力较强，可以最大程度的保护幼根的完整性。Hoagland营养液中添加的壳寡糖不仅可以提高幼苗的抗病性，同时作为一种微肥促进幼苗的生长发育。
其中，调节培养基pH值根据情况采用1mol/L的NaOH或HCl调节至所需pH值。各术语说明：所述的TDZ为噻苯隆，IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸，6-BA为6-苄基氨基嘌呤，壳寡糖为寡聚氨基葡糖。
本发明还提供一种用于玉铃花组织培养的种子萌发培养基，其特征在于：以1/2MS培养基为基础培养基，添加60-80mg/L的赤霉素，60-80mg/L的Vc，10－20g/L的蔗糖，400－600mg/L的活性炭和8－12g/L的琼脂粉，并调节培养基pH值至5.6－6.0，优选为5.8；其中，进一步优选地，赤霉素浓度为60mg/L和Vc浓度在80mg/L，和/或15g/L的蔗糖，500mg/L的活性炭，10g/L的琼脂粉。
本发明也提供了一种用于玉铃花组织培养的诱导培养，其特征在于：以WPM培养基为基础培养基，添加0.03-0.08mg/L的TDZ，0.3-0.8mg/L的BA，以及蔗糖和琼脂粉，调节培养基pH值至5.6－6.0，优选为5.8，进一步优选地，TDZ的浓度为0.05mg/L，BA的浓度为0.5mg/L，和/或15g/L的蔗糖，10g/L的琼脂粉。
本发明进一步提供一种用于玉铃花组织培养的生根培养基，其特征在于：以1/2WPM培养基为基础培养基，添加0.05-0.1mg/L的IBA，0.03-0.05mg/L的NAA，1－3mg/L的活性炭和7-8g/L琼脂粉，调节培养基pH值至5.6－6.0，优选为5.8，进一步优选地0.05mg/L的IBA，0.03mg/L的NAA，2mg/L的活性炭，或者0.1mg/L的IBA，0.05mg/L的NAA。
除上述描述中已提及的本发明改进效果，相对现有技术的有益效果还包括：
1、本发明在无菌苗体系建立过程中，采用浓硫酸销蚀种子外皮，并利用种子萌发培养基提高种子萌发率，缩短了种子萌发所需要的时间。并且种子表面消毒相较于外植体消毒更简便易行，有效降低污染率的同时减少了乙醇、升汞等对外植体的伤害。
2、本发明的诱导培养基针对性强、适用性好，外植体经诱导分化培养基培养腋芽生长速度快且枝条健壮，茎段经增殖培养基培养后增值效果好，极少出现不定芽褐化的情况。经生根培养基培养后生根快，根量多且粗壮，生根率高。
3、组培苗移栽培养过程中，选用蛭石加营养液的中间过渡方案。蛭石轻且保水能力较强，最大限度的保持幼苗根系的完整性。添加的营养液可以促进了幼苗的生长发育，达到壮苗的目的，提高了后期幼苗大田移栽的成活率。
具体实施方式
根据下述实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例一
无菌苗体系建立：挑选饱满的种子，置入浓硫酸中1h，期间轻摇3-4次。将浓硫酸倒入回收瓶中，自来水冲洗种子，之后置于滤纸上晾干。将晾干的种子置入70％的乙醇溶液中，摇动30s后在超净台中取出，吹干。将种子置入0.1％的升汞溶液中灭菌3min，置入无菌水中清洗4-5次，吹干，之后置入种子萌发培养基中。每个培养瓶放置3-4粒种子。4℃低温处理3d后置入组培室中(温度25℃，光暗节律为：光16h/d，暗8h/d，光照强度4000lux)。每天观察种子污染萌发情况，如果有种子污染，可将其余未污染的种子重新消毒处理后，置入新的培养瓶中。
所述种子萌发培养基配制方法根据表1所示：以1/2MS培养基为基础培养基，添加40-80mg/L的赤霉素，60-80mg/L的Vc，15g/L的蔗糖，500mg/L的活性炭和10g/L的琼脂粉，并用1mol/L的NaOH或HCl调节培养基pH值至5.8。
表1种子萌发培养基的配置方法
由表1的试验结果可知，赤霉素浓度在60-80mg/L，Vc浓度在60-80mg/L时种子萌发率较高。其中赤霉素浓度为60mg/L，Vc浓度在80mg/L时种子萌发率最高可达46.2％。
实施例二
外植体诱导：优选萌发10-13d的幼苗，超净台中截取带腋芽的茎段1.0cm。将截选好的茎段按植物形态学将下端插入诱导培养基中，每瓶插一个。所述诱导培养基配制方法如表2所示：以MS或WPM培养基为基础培养基，添加0.03-0.08mg/L的TDZ，0.3-0.8mg/L的BA，15g/L的蔗糖和10g/L琼脂粉，用1mol/L的NaOH或HCl调节培养基pH值至5.8。
不定芽扩繁：优选长出小不定芽的愈伤组织，切割后置入诱导培养基中继代培养。
表2诱导培养基的配置方法
由表2的试验结果可知，在相同激素浓度下MS培养基的不定芽诱导率要高于WPM培养基，但褐化率WPM培养基较低。激素的不同组合与褐化率差异不大，但以MS培养基为基础培养基时，TDZ的浓度为0.05mg/L，BA的浓度为0.8mg/L时诱导率最佳；以WPM培养基为基础培养基时，TDZ的浓度为0.05mg/L，BA的浓度为0.5mg/L时诱导率最佳。
实施例三
不定根发生：经继代培养的芽苗达到2-3cm时，移至生根培养基中继续培养。所述生根培养基配制方法如表3所示：以1/2WPM培养基为基础培养基，添加0.05-0.1mg/L的IBA，0.03-0.05mg/L的NAA，1-2mg/L的活性炭和6-10g/L琼脂粉，用1mol/L的NaOH或HCl调节培养基pH值至5.8。
表3生根培养基的配置方法
由表3的试验结果可知，以1/2WPM培养基为基础培养基，IBA的浓度为0.05-0.1mg/L时，NAA浓度为0.03-0.05mg/L时生根率较好。琼脂粉的浓度在7-8g/L时生根率要高于其它浓度。活性炭浓度在2mg/L的褐化率要低于1mg/L。
实施例四
组培苗移栽：生根苗根长达4-5cm时，从组培瓶中取出，移至锥形穴盘中用干蛭石掩埋，之后用营养液浇透，表面覆盖一层保鲜膜。穴盘置于人工气候室中(温度25℃，光暗节律为：光16h/d，暗8h/d，光照强度4000lux)，5d之后揭掉覆膜，之后每2-3天浇营养液一次。培养8-12d后喷施一次叶面肥(KH2PO4)。培养18-21d后将幼苗从穴盘中取出，轻轻抖掉基质(不需要抖干净)。移栽至泥炭土基质中(泥炭土：珍珠岩＝2:1)，用水浇透，置于温室中继续培养。所述的营养液配制方法：以Hoagland营养液为基础，添加0.2mg/L的壳寡糖，用1mol/L的NaOH或HCl调节培养基pH值至7.0。
因此，根据上述实施例可知，本发明提供一种提高玉铃花组织培养容器苗效率的方法，可以提高玉铃花组织快繁效率和移栽成活率，弥补了玉铃花繁殖周期长、效率低的现状，同时也缓解了市场对玉铃花苗木需求的问题。
Claims (7)
1.一种提高玉铃花组织培养容器苗效率的方法，其特征在于通过以下步骤进行：
1) 用浓硫酸处理玉铃花种子，清洗后置于种子萌发培养基中培养；其中所述的种子萌发培养基配制方法：以1/2MS培养基为基础培养基，添加60-80 mg/L的赤霉素，60-80 mg/L的Vc，10－20 g/L的蔗糖，400－600mg/L的活性炭和8－12g/L的琼脂粉，并调节培养基pH值至5.6－6.0；
2) 截取萌发的幼苗的带芽茎段作为外植体，在诱导培养基中进行培养；
3) 截取带愈伤组织的小不定芽，置入新的诱导培养基中继续继代培养；
4) 将无根不定芽定植在生根培养基中进行生根培养；
5) 将根长达4-5cm的幼苗移植锥形穴盘中，以蛭石为基质，每2-3天浇一次营养液，18-21天后移植到以泥炭土和珍珠岩为基质的无纺布容器中；
其中，步骤2）和步骤3）中所述的诱导培养基配制方法：以WPM培养基为基础培养基，添加0.03-0.08mg/L的TDZ，0.3-0.8 mg/L的BA，以及蔗糖和琼脂粉，调节培养基pH值至5.6－6.0；
步骤4）中所述的生根培养基配制方法：以1/2WPM培养基为基础培养基，添加0.05-0.1mg/L的IBA，0.03-0.05 mg/L的NAA，1－2mg/L的活性炭和7-8g/L琼脂粉，调节培养基pH值至5.6－6.0；
步骤5）中所述的营养液配制方法：以Hoagland营养液为基础，添加0.005－0.02mg/L的壳寡糖；调节营养液pH值至6.8－7.2。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）的种子萌发培养基中，添加60mg/L的赤霉素，80 mg/L的Vc，15 g/L的蔗糖，500mg/L的活性炭和10g/L的琼脂粉，并调节培养基pH值至5.8；所述步骤2）和步骤3）的诱导培养基中，添加0.05mg/L的TDZ，0.5 mg/L的BA，以及15 g/L的蔗糖和10g/L的琼脂粉，调节培养基pH值至5.8；所述步骤4）的生根培养基中，添加0.05mg/L或者0.1mg/L的IBA，0.03 mg/L或者0.05mg/L的NAA，2mg/L的活性炭和7-8g/L琼脂粉，调节培养基pH值至5.8；所述步骤5）的营养液中，添加0.01 mg/L的壳寡糖并调节营养液pH值至7.0；步骤5）所述基质为泥炭土：珍珠岩=2:1。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤1）是将种子置入浓硫酸中浸泡0.5－1.5h，倒掉浓硫酸后水冲洗，晾干；随后在超净台中，用70%的乙醇浸泡20－40s，升汞中灭菌，无菌水清洗，接种在种子萌发培养基中，每个培养瓶放置3-4粒种子，4℃低温处理3d后置入组培室中，于下述条件培养：温度25℃，光暗节律为：光16h/d，暗 8h/d，光照强度4000lux。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤2）中是选择萌发10-13d的幼苗，截取0.8-1.2cm的带腋芽的茎段，按植物形态学将下端插入诱导培养基中。
5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：调节培养基pH值根据情况采用1mol/L的NaOH或HCl调节至所需pH值。
6.一种用于玉铃花组织培养的培养基，其特征在于：所述培养基是由种子萌发培养基、诱导培养基和生根培养基组成，其中，种子萌发培养基：以1/2MS培养基为基础培养基，添加60-80 mg/L的赤霉素，60-80 mg/L的Vc，10－20 g/L的蔗糖，400－600mg/L的活性炭和8－12g/L的琼脂粉，并调节培养基pH值至5.6－6.0；诱导培养基：以WPM培养基为基础培养基，添加0.03-0.08mg/L的TDZ，0.3-0.8 mg/L的BA，以及蔗糖和琼脂粉，调节培养基pH值至5.6－6.0；生根培养基：以1/2WPM培养基为基础培养基，添加0.05-0.1mg/L的IBA，0.03-0.05 mg/L的NAA，1－2mg/L的活性炭和7-8g/L琼脂粉，调节培养基pH值至5.6－6.0。
7.按照权利要求6所述的培养基，其特征在于：其中，种子萌发培养基：添加60 mg/L的赤霉素，80 mg/L的Vc，15 g/L的蔗糖，500mg/L的活性炭和10g/L的琼脂粉，并调节培养基pH值至5.8；诱导培养基：添加0.05mg/L的TDZ，0.5 mg/L的BA，以及15 g/L的蔗糖和10g/L的琼脂粉，调节培养基pH值至5.8；生根培养基：添加0.05mg/L或者0.1mg/L的IBA，0. 03 mg/L或者0.05mg/L的NAA，2mg/L的活性炭和7-8g/L琼脂粉，调节培养基pH值至5.8。
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