CN108739370B - 一种利用成熟莲胚进行快繁的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用成熟莲胚进行快繁的方法，将带壳莲子进行预处理后，进行了两次表面消毒，并用PPM溶液浸泡，莲子吸胀后自然萌发胀破，取出莲胚作为外植体，进行了初代培养，增殖培养以及生根培养，炼苗、移栽，实现了莲的快繁，本发明能轻易取出萌发的莲胚，在莲子吸胀过程中，PPM溶液渗入莲子内部，对莲子内部组织进行消毒，消灭莲子内部的内生菌，实现外植体零污染，获取的莲胚芽生活力强，成苗率可达100％，褐化率极低；增殖能力强，采用固液双相培养基增殖，组培苗生长矮壮、叶片多能展开、苗不会干枯，且出芽快、增殖系数高，本发明使莲的快繁过程更为简易、高效。

Description

一种利用成熟莲胚进行快繁的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用成熟莲胚进行快繁的方法。

背景技术

荷花，为莲科莲属多年生草本挺水植物，现存两种，即分布于亚洲各地及澳大利亚北部的亚洲莲(Nelumbo nucifera)和分布于北美洲及南美洲北部的美洲莲(Nelumbolutea)。

荷花是我国传统十大名花之一，也是印度国花。荷花具有极高的观赏价值，其膨大的地下茎—莲藕是优良水生蔬菜；其种子莲子可作为滋补食品；莲叶、莲胚可制成茶；全株皆可入药。

荷花主要通过分藕进行繁殖，但是，该繁殖方式耗种量大，运输难，且长期无性繁殖会导致种性降低，对生产造成影响；采用组织培养技术，快速繁殖无性系，不仅能解决上述生产上的问题，也能为荷花基因工程育种奠定基础。

荷花组织培养研究起始于上个世纪80年代，主要集中在以地下茎上的芽或幼胚为外植体进行直接再生，然而，地下茎上的芽处在淤泥中，污染严重，幼胚的取材受到时间限制。采用成熟莲胚能避免这些问题，然而，成熟莲胚被坚硬的果皮和子叶包被，难以取材，因此，成熟莲胚的应用很少。

孔德政等(孔德政，李艳妮，杨秋生，刘广甫，荷花胚组织培养的初步研究，河南科学，2007，25(4)：593–595)使用浓硫酸浸泡使果皮变软，剥除果皮后再消毒，胚芽受到严重伤害，萌发率仅32％，污染率50％以上，且并没有观察到芽的增殖现象。

蔡颖新等(蔡颖欣，汤宇环，邵晓宇，黄霞，莲子胚培养再生植株及原生质体分离的研究，种子，2017，36(3)：125-134)直接用枝剪剪去全部果皮，消毒后再用手术刀剖开坚硬的子叶取出干燥的胚芽，虽然胚芽萌发率能达到100％，但是，该方法操作麻烦，且增殖系数也不高，最终增殖系数仅能达到3.4。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用成熟莲胚进行快繁的方法，不仅能简易获取无菌成熟莲胚，实现外植体零污染，且获取的莲胚芽生活力强，成苗率可达100％，褐化率极低；采用初代丛芽直接快繁，并使用固液双相培养基，使增殖系数提高，经过2-3个月培养的单个胚芽外植体，最终能形成含20-30个芽的丛芽，为莲组培快繁提供技术支持，为莲遗传转化体系的建立奠定基础。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用成熟莲胚进行快繁的方法，包括以下步骤：

1)预处理

带壳莲子洗净，在莲子壳基部破孔，不可伤害内部子叶；

2)制备外植体

将有孔的带壳莲子先进行常规的表面消毒，之后用无菌水润洗3-4次，再用体积分数为1-2％的PPM溶液浸泡16-24h进行二次表面消毒，再转至体积分数为0.05-0.1％的PPM溶液中浸泡24-48h进行萌发；

待莲子萌发破壳后，剖开子叶，取出莲胚，切除莲胚的第一片幼叶，保留顶点及第二片幼叶，得到外植体；

3)初代培养

将得到的外植体接种至初代培养基中，进行初代培养，培养40-50天，获得初代丛芽；培养条件为：25±2℃，光强2500-3000lx，光照14-16h/d；

4)增殖培养

将得到的初代丛芽接种至增殖培养基中，进行增殖培养，培养40-60天，获得增殖丛芽，培养条件同3)；

其中，所述的增殖培养基为由无菌水和固体培养基组成的固液双相培养基，无菌水的用量约为固体培养基体积的1/3-1/2；

5)生根培养

将获得的增殖丛芽分离成单芽接种至生根培养基中，进行生根培养，培养条件同3)，获得生根的荷花组培苗；

6)炼苗、移栽

将组培苗洗净后，浸泡在水中，于弱光下放置2-3天后，栽至灭菌塘泥中，弱光下覆膜保湿培养，一周后去掉覆膜并转移至正常光下培养，获得荷花幼苗。

优选地，步骤1)中，冲洗干净的带壳莲子经过紫外照射10-15min。

进一步，步骤3)中，所述的初代培养基中含有：MS基础培养基，6-BA 2.5-3.5mg/L，NAA 0.05-0.1mg/L，蔗糖25-30g/L，Phyta gel 3-4g/L，pH＝5.75-5.85。

又，步骤4)中，所述的增殖培养基中含有：MS基础培养基，6-BA1-1.5mg/L，NAA0.05-0.1mg/L，蔗糖25-30g/L，Phyta gel 3-4g/L，pH＝5.75-5.85。

进一步，步骤5)中，所述的生根培养基中含有：1/2MS基础培养基，NAA 0.1-0.2mg/L，蔗糖10-15g/L，Phyta gel 3-4g/L，pH＝5.75-5.85。

本发明将带壳莲子清洗后，在莲子壳基部破孔，去除少许果皮，再将壳基部破孔的莲子分步浸泡至体积分数为1-2％、0.05-0.1％的PPM(PlantPreservative Mixture，植物组织培养抗菌保护剂)溶液中，莲子在吸胀后自然萌发胀破，胚芽最终撑破坚硬子叶和果皮，从而能轻易取出胚芽。同时，本发明在莲子壳基部破孔后，PPM能在莲子吸胀过程中，渗入莲子内部，对组织进行消毒，消灭莲子内部的内生菌，使污染率得到极大控制，可达零污染，且获取的莲胚芽生活力强，成苗率可达100％，褐化率极低。

本发明在初代培养基中，添加了2.5-3.5mg/L的6-BA，较高浓度的6-BA有利于组培苗成丛芽生长，初代培养6周即有3-5个芽，但是浓度太高时(如4mg/L)，虽能长出多个芽点，但很难成苗；而在低浓度(如1-2mg/L)的6-BA条件下，组培苗会以走茎的形式生长。

本发明在增殖培养中，采用了固液双相培养基，无菌水的用量为固体培养基体积的1/3-1/2，固液双相培养基与荷花自然生境类似，避免组培苗的生长受干旱胁迫，利于组培苗生长，使组培苗生长健壮、促进组培苗增殖。

本发明在莲的增殖培养中发现，成丛培养比切割成单芽更有利于增殖，可能由于群体效应，先长出的芽生长健壮能将吸收的营养传递给新芽，从而有利于新芽的生出。

本发明中获得的外植体生活力强，将其在高浓度6-BA的培养基中进行初代培养，结合固液双相培养基中的增殖培养，这些因素共同作用使增殖系数提高，最终1个胚芽能形成20-30个芽，增殖系数达到20-30。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明在莲子壳基部破孔，带壳莲子吸胀后自然萌发胀破，能较轻易地沿子叶裂开方向切开，从而能轻易取出莲胚，较以往直接用枝剪破开坚硬的莲子获取莲胚的方法，更简单易行，且能突破采取幼嫩莲胚时的季节限制。

本发明对带壳莲子进行了两次消毒，在莲子吸胀过程中，PPM能渗入莲子内部，对组织进行消毒，消灭莲子内部的内生菌，实现外植体零污染。

与前人研究中使用的干燥胚芽相比，本发明获取的莲胚芽自然萌发，刚刚突破果皮，生活力强，成苗率可达100％，褐化率极低；增殖能力强，可采用初代丛芽直接快繁，无需切割成单芽，采用固液双相培养基增殖，增殖系数高，组培苗生长矮壮、叶片多能展开、苗不会干枯，且出芽更快更多，使莲的快繁过程更为简易、高效。

附图说明

图1为本发明实施例中基部破孔的带壳莲子。

图2为本发明实施例中萌发的莲子。

图3为本发明实施例中接种至初代培养基上的外植体。

图4为本发明实施例中增殖培养时固液双相培养基的组培苗生长状况。

图5为增殖培养时固体培养基对照组的组培苗生长状况。

图6为对比例4-5中初代培养中组培苗培养6-8周的生长状况。

图7为对比例6中初代培养中组培苗培养6-8周的生长状况。

图8为本发明实施例1中初代培养中组培苗培养6-8周的生长状况。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例本发明的一种利用成熟莲胚进行快繁的方法，包括以下步骤：

1)预处理

挑选饱满的成熟带壳莲子，将带壳莲子在3％洗衣粉溶液(w/v)中振荡润洗30min，于流水下冲洗，去除残留洗衣粉溶液，用吸水纸吸净表面水分，置于超净工作台内紫外照射10-15min，用无菌修枝剪剪去莲子基部一小部分果皮，能产生一个小孔即可，不可伤害内部子叶，参见图1；

2)制备外植体

将有孔的带壳莲子经75％乙醇1min、2％NaClO 10min的表面消毒，用无菌水润洗3-4次，用体积分数为1-2％的PPM溶液浸泡16-24h进行二次表面消毒，再转至体积分数为0.05-0.1％的PPM溶液中浸泡24-48h进行萌发，参见图2，实施例1-3的具体处理方式参见表1；

分别以0.2％PPM溶液、0.5％PPM溶液浸泡消毒作为二次表面消毒及浸泡的对比例1-2；以调整常规表面消毒(3min 75％乙醇，10min 5％NaClO)结合无菌水浸泡作为对比例3。

待莲子萌发破壳后，剖开子叶，取出莲胚，切除胚根和第一片幼叶，保留顶点及第二片幼叶，得到外植体；

3)初代培养

每个处理设置30个外植体，将得到的外植体接种至初代培养基中，参见图3，进行初代培养，培养条件：25±2℃，光强3000lx，每天光照16h，培养42天，获得丛芽；

其中，所述的初代培养基为MS基础培养基+6-BA 3mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+Phyta gel 3％，pH＝5.8。

在初代培养基中培养1周后，统计实施例和对比例1-3的污染率，污染率＝污染外植体数/总外植体数×100％，结果见表1。

表1不同的二次表面消毒及浸泡处理方法及结果

由表1可见，仅对莲子进行表面消毒后直接浸泡在无菌水中，并不能得到无菌外植体；浸泡在低浓度0.2％PPM溶液中二次消毒并不能控制污染；随着PPM浓度升高，污染率降低；当PPM体积分数为1-2％时，莲子浸泡24h，再转至低浓度0.05-0.1％PPM溶液中浸泡，外植体可实现零污染。

4)增殖培养

将得到的丛芽接种至增殖培养基中，进行增殖培养，培养条件：25±2℃，光强3000lx，每天光照16h，培养42天，获得增殖丛芽，增殖系数20-30。

其中，所述的增殖培养基为由无菌水和固体培养基组成的固液双相培养基，其中，所述的固体培养基为：MS基础培养基+6-BA 1.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel3％，pH＝5.8，无菌水的用量为20ml，以不添加无菌水的固体培养基作为对照，培养结果参见图4-5。

由图4-5可以看出，固体培养基中生长的苗叶柄细弱、苗易干枯；而在本发明的固液双相培养基中，组培苗生长矮壮、叶片多能展开、苗不会干枯；且出芽更快更多，经过42天的增殖培养，芽能增殖到20-30个。

5)生根培养

将获得的组培苗接种至生根培养基中，进行生根培养，培养条件：25±2℃，光强3000lx，每天光照16h，培养15天，获得生根组培苗；生根率93％。

其中，所述的生根培养基为1/2MS基础培养基+0.1mg/L NAA+10g/L蔗糖+3％Phytagel，pH＝5.8。

6)炼苗、移栽

将生根小苗洗净后，浸泡在水中，于弱光下放置2天后，栽至灭菌塘泥中，弱光下覆膜保湿培养，一周后去掉覆膜并转移至正常光下培养，获得荷花幼苗，成苗率86％。

对比例4-6

在初代培养中，除初代培养基中6-BA的含量不同外，其它条件同本发明实施例1，根据6-BA的含量设置3个浓度的对比例4-6，见表2，培养结果参见图6-8。

表2初代培养基中激素成分及含量

由图6-8可见，在6-BA的添加量为1-2mg/L时，组培苗呈走茎生长。当6-BA的添加量为2.5-3.5mg/L时，组培苗呈丛芽生长，培养6周约有3-5个芽；当6-BA的添加量为4mg/L时，组培苗虽能长出多个芽点，但很难成苗，可见，在不同6-BA浓度下，组培苗的生长方式差异明显。

Claims (2)

1.一种利用成熟莲胚进行快繁的方法，包括以下步骤：

1)预处理

带壳莲子洗净，在莲子壳基部破孔，不可伤害内部子叶；

2)制备外植体

将有孔的带壳莲子先进行常规的表面消毒，之后用无菌水润洗3-4次，再用体积分数为1-2％的PPM溶液浸泡16-24h进行二次表面消毒，再转至体积分数为0.05-0.1％的PPM溶液中浸泡24-48h进行萌发；

待莲子萌发破壳后，剖开子叶，取出莲胚，切除莲胚的第一片幼叶，保留顶点及第二片幼叶，得到外植体；

3)初代培养

将得到的外植体接种至初代培养基中，进行初代培养，培养40-50天，得到初代丛芽；培养条件为：25±2℃，光强2500-3000lx，光照14-16h/d；所述的初代培养基中为：MS基础培养基，6-BA2.5-3.5mg/L，NAA 0.05-0.1mg/L，蔗糖25-30g/L，Phyta gel 3-4g/L，pH＝5.75-5.85；

4)增殖培养

将得到的初代丛芽接种至增殖培养基中，进行增殖培养，培养条件同3)，培养40-60天，获得增殖丛芽；

其中，所述的增殖培养基为由无菌水和固体培养基组成的固液双相培养基，无菌水的用量为固体培养基体积的1/3-1/2；所述的固体培养基为：MS基础培养基，6-BA 1-1.5mg/L，NAA 0.05-0.1mg/L，蔗糖25-30g/L，Phyta gel 3-4g/L，pH＝5.75-5.85；

5)生根培养

将获得的增殖丛芽分离成单芽接种至生根培养基中，进行生根培养，培养条件同3)，培养15-30天，获得生根的荷花组培苗；所述的生根培养基为：1/2MS基础培养基，NAA 0.1-0.2mg/L，蔗糖10-15g/L，Phyta gel 3-4g/L，pH＝5.75-5.85；

6)炼苗、移栽

将组培苗洗净后，浸泡在水中，于弱光下放置2-3天后，栽至灭菌塘泥中，弱光下覆膜保湿培养，一周后去掉覆膜并转移至正常光照下培养，获得荷花幼苗。

2.根据权利要求1所述利用成熟莲胚进行快繁的方法，其特征在于，步骤1)中，洗净的带壳莲子经过紫外照射10-15min后再破孔。

Images