CN102138528A - 一种红翅槭腋芽途径组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了红翅槭(Acer fabri Hance)腋芽途径组织培养繁殖方法，包括以下步骤：首先进行外植体消毒，消毒后接种于诱导培养基中进行芽的分化诱导，控制培养温度在20-26℃，光照时间10-16h/天、光照强度为1600-2000lx下进行正常培养25-35天，接着将所得红翅槭嫩梢切割后接入继代培养基中进行继代培养25-35天，最后将红翅槭无菌苗接入生根培养基中进行生根培养10-15天，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000lx。获得生根无菌苗后，移至苗床驯化培养30-60d。通过该方法能够有效的解决红翅槭快速推广的问题。
Description
技术领域
本发明涉及红翅槭(Acer fabri Hance)组织培养繁殖方法，属于木本植物种苗繁殖的技术领域。
背景技术
红翅槭(Acer fabri Hance)属槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer)植物。又名罗浮槭(广西植物名录)，常绿乔木，高6-10米；叶革质，披针形，长7-11厘米，宽2-3厘米，上面深绿色，下面浅绿色；翅果嫩时紫色，成熟时黄褐色或淡褐色，小坚果突起，直径约5毫米，翅宽8-10毫米，连同小坚果长3-3.4厘米，张开呈钝角，花期3-4月，果期5-9月。主要自然分布于我国的广西、广东、江西、湖北等省。从江苏、浙江、安徽、上海等地的引种栽培情况看，冬季能抗-10℃的最低温，夏季能耐40℃的高温，由此可见其适应性很强。由于红翅槭树姿婆娑，小乔木树型美观，叶常绿而翅果紫色或红色，春季鲜红的嫩叶，夏季紫红色的果实缀满枝头，让人感受到清雅、温馨、心旷神怡。因此，该树种无论栽植于何处，无不感到引人入胜，在园林中既可以像落叶类槭树一样作为很好的有色树种植于草坪、土丘、溪边、池畔等地，又可以作为常绿行道树利用。此外，红翅槭木材纹理清晰，结构细而均匀，木质重、硬、耐腐，易加工，切面光滑，弹性好，是制作高档家具、乐器、农具和胶合板的上好材料。
目前国内对红翅槭的研究与开发应用较少。对于其快速繁殖和栽培管理的研究尚处于空白。红翅槭目前以种子繁育为主，扦插与嫁接还在试验之中，这样不仅繁殖系数小，而且成苗时间长，很难形成规模。
木本植物组织培养研究起步于20世纪50年代初，直到70年代后期才得到较大的发展。组织培养获得再生植株主要分为两种途径，其一为器官途径组织培养，即从植物体分离出符合需要的器官等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株；其二为遇上途径组织培养，即在培养过程中从各器官上产生愈伤组织，培养愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
目前，不完全统计有90多属300多种木本植物经组织培养获得再生植株。而关于槭树属植物组织培养的研究，国内外报道很少。近5年，仅见有报道对红翅槭以嫩茎(见北方园艺，2010年第9期，红翅槭的组织培养及快繁技术)和嫩叶(见中南林业科技大学学报，2010年第4期，景观树种红翅槭愈伤组织诱导培养)为外植体进行愈伤组织途径的培养，而关于红翅槭的腋芽(器官)途径离体快繁研究尚未见有报道。
综上所述，采取组织培养繁殖红翅槭是解决红翅槭资源短缺的重要途径之一，对红翅槭的开发和推广利用都具有着非常重要的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是公开红翅槭的腋芽途径组织培养繁殖方法。
为解决该技术采用如下的技术方案：
A)外植体消毒；
B)芽的分化诱导：取消毒后的外植体切割为1.0-1.5cm长的茎段，其中每个茎段带一个腋芽，将茎段接种于诱导培养基中进行芽的分化诱导，控制培养温度在20-26℃，进行光照培养25-35天，所述光照培养为：光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix；
C)继代培养与增殖：将步骤B)中所得红翅槭嫩梢切割后接入继代培养基中进行继代培养25-35天，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix；
D)根的诱导：将步骤C)所得红翅槭试管苗接入生根培养基中进行生根培养10-15天，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix。
E)无菌苗驯化：将步骤D)所得红翅槭生根无菌苗在打开瓶盖的环境下培养3-5d，然后移至苗床基质培养30-60d。
外植体可选择红翅槭的一年生扦插苗当年生枝条上带腋芽的茎段；步骤A)中的外植体消毒过程为：用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min，流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。
步骤B)和步骤C)中可采用WPM基本培养基添加激素细胞分裂素、植物生长素和赤霉素等三类激素，其中步骤B)中采用的诱导培养基为：WPM+6-BA3.0mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.5mg/L，步骤C)中采用的继代培养基为：WPM+6-BA0.4mg/L+IBA 0.04mg/L+GA30.3mg/L；步骤D)中可采用的生根培养基为：1/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L；同时步骤B)、C)、D)中采用的培养基中还可添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.8-6.0。
步骤E)中的苗床基质配方为泥炭土∶珍珠岩∶黄沙体积比为3∶1∶1，另加入20-30g多菌灵/m3。
本发明相对现有技术的有益效果为：采用腋芽途径组织培养的方法对红翅槭进行繁殖，能够有效的得到大量的红翅槭无菌苗，解决红翅槭资源短缺的问题；通过对外植体、诱导培养基、继代培养基及生根培养基的选取，能够使得3次继代增殖率达到100-115倍，驯化生根率达到90-95％，能够高效的得到红翅槭种苗。
具体实施方式
实施例一
1、选取40株茁壮的红翅槭一年生扦插苗。剪取当年生嫩梢部分，去除叶片，以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长约2cm。将外植体用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15min。流水冲洗20min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3min。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养基WPM+6-BA3.0mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.5mg/L中。每瓶接3或4株，共接入13瓶。在温度24℃，光照时间10h/天，光强2000lx的条件下，进行培养。
2、外植体接入培养基7d后，腋芽开始萌动。至30d时，污染10株，剩余30株萌发率达75％，共获得23株不带根的初代无菌苗。无菌苗株高约4cm，每株茎上带有已萌动的腋芽3至6个。将叶片去除，主干切为带芽茎段，每段带一个腋芽，共得92段。接入继代增殖培养基WPM+6-BA0.4mg/L+IBA 0.04mg/L+GA30.3mg/L中，培养条件同上。培养15d后，腋芽开始陆续出梢，30d后，增殖率达到7.6倍，即每株继代苗上平均含有7.6个腋芽，共得到腋芽700个。
3、将第1次继代增殖得到的继代无菌苗切为带2个或3个腋芽的茎段，得到茎段330段。进行第2次继代，10d后腋芽开始出梢，30d后得到平均带有8个腋芽的无菌苗300株(其余10株污染，20株未萌动)。重复进行第3次继代，得到茎段2300段，30d后获得平均带有6个腋芽的继代无菌苗约2000株(其余100株污染，200株未萌动)。
4、将经过3次继代的无菌苗切成带3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养基1/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L，共接入4000株，培养条件同上。培养10d后，开始生根，15d后生根率达100％，至此获得带根无菌苗4000株。将4000株带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，放置于室温、通风条件良好的环境下培养3d，移栽至苗床培养，苗床中基质条件为泥炭土∶珍珠岩∶黄沙体积比为3∶1∶1，另加入20g多菌灵/m3。30d后，幼苗成活率达到90％，获得种苗3600株。
以上培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.8-。
实施例二
1、选取40株茁壮的红翅槭一年生扦插苗。剪取当年生嫩梢部分，去除叶片，以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长约2cm。将外植体用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒20min。流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒60s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡5min。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养基WPM+6-BA3.0mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.5mg/L中。每瓶接3或4株，共接入13瓶。在温度26℃，光照时间16h/天，光强1600lx的条件下，进行培养。
2、外植体接入培养基7d后，腋芽开始萌动。至30d时，污染8株，剩余32株萌发率达80％，共获得26株不带根的初代无菌苗。无菌苗株高约4cm，每株茎上带有已萌动的腋芽3至6个。将叶片去除，主干切为带芽茎段，每段带一个腋芽，共得106段。接入继代增殖培养基WPM+6-BA0.4mg/L+IBA 0.04mg/L+GA30.3mg/L中，培养条件同上。培养15d后，腋芽开始陆续出梢，30d后，增殖率达到7.6倍，即每株继代苗上平均含有7.6个腋芽，共得到腋芽806个。
3、将第1次继代增殖得到的继代无菌苗切为带2个或3个腋芽的茎段，得到茎段350段。进行第2次继代，10d后腋芽开始出梢，30d后得到平均带有8个腋芽的无菌苗320株(其余15株污染，15株未萌动)。重复进行第3次继代，得到茎段2400段，30d后获得平均带有6个腋芽的继代无菌苗约2300株(其余30株污染，70株未萌动)。
4、将经过3次继代的无菌苗切成带3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养基1/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L，共接入4600株，培养条件同上。培养10d后，开始生根，15d后生根率达100％，至此获得带根无菌苗4600株。将4600株带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，放置于室温、通风条件良好的环境下培养5d，移栽至苗床培养，苗床中基质条件为泥炭土∶珍珠岩∶黄沙体积比为3∶1∶1，另加入30g多菌灵/m3。30d后，幼苗成活率达到95％，获得种苗4370株。
以上培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为6.0。
Claims (8)
1.红翅槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)外植体消毒；
B)芽的分化诱导：取消毒后的外植体切割为1.0-1.5cm长的茎段，其中每个茎段带一个腋芽，将茎段接种于诱导培养基中进行芽的分化诱导，控制培养温度在20-26℃，光照培养25-35天，所述光照培养为：光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix；
C)继代培养与增殖：将步骤B)中所得红翅槭嫩梢切割后接入继代培养基中进行继代培养25-35天，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix；
D)根的诱导：将步骤C)所得红翅槭试管苗接入生根培养基中进行生根培养10-15天，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix。
E)无菌苗驯化：将步骤D)所得红翅槭生根无菌苗在打开瓶盖的环境下培养3-5d，然后移至苗床基质培养30-60d。
2.根据权利要求1所述的红翅槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤A)中的外植体选自红翅槭一年生扦插苗的当年生带腋芽茎段。
3.根据权利要求1或2所述的红翅槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤A)中的外植体消毒过程为：用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min，流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。
4.根据权利要求1所述的红翅槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤B)中采用的诱导培养基为：WPM+6-BA3.0mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.5mg/L。
5.根据权利要求1所述的红翅槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤C)中采用的继代培养基为：WPM+6-BA0.4mg/L+IBA 0.04mg/L+GA30.3mg/L。
6.根据权利要求1所述的红翅槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤D)中采用的生根培养基为：1/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L。
7.根据权利要求4至6中任何一项所述的红翅槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的培养基中还含有琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，培养基pH为5.8-6.0。
8.根据权利要求1所述的红翅槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤E)中的苗床基质配方为泥炭土∶珍珠岩∶黄沙体积比为3∶1∶1，另加入20-30g多菌灵/m3。
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