CN102668980A

CN102668980A - 一种山胡椒的组织培养方法

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Publication number: CN102668980A
Application number: CN2012101414096A
Authority: CN
Inventors: 邹克琴; 李素芳; 王为民; 徐晓晖; 刘军
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-05-09
Also published as: CN102668980B

Abstract

本发明公开了一种山胡椒组织培养方法，以山胡椒幼嫩的腋芽作为外植体，建立一种通过组织培养的快速离体繁殖方法,所述的方法包括无菌材料的获得，不定芽的诱导分化和增殖，芽的生根和移栽等步骤；本发明对培养基进行了改良，添加了谷胺酰胺调节剂，大大提高了分化率，省略了组培中的无菌诱导生根环节，采用开放式操作，利用NAA诱导生根形成完整植株；本发明方法克服了山胡椒常规育种周期长、繁殖系数低等缺点，并提高了其性状的稳定性，可实现育苗的工厂化大批量生产，并有效解决山胡椒优质种苗的供应问题。

Description

一种山胡椒的组织培养方法

（一）技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，涉及一种山胡椒的组织培养和快速繁苗方法。通过这种方法，可以进行优良种苗规模生产。

（二）背景技术

山胡椒（Lindera glauca）属于樟科植物，落叶灌木或小乔木，又名毕澄茄、野胡椒、山鸡椒、山香椒、木姜子等。主要分布于山东、安徽、浙江、江西、福建、台湾、河南、湖南、广东、广西、四川、云南等地。山胡椒不但可用作园林点缀树种，配植于草坪、花坛和假山隙缝，而且山胡椒果实芳香，果及叶可提取芳香油，用作食品及化妆品香精，其种子含脂肪油，可制肥皂及机械润滑油。更重要的是山胡椒的根、枝、叶、果实可供药用，有祛风湿、消肿、解毒、止痛的功效，是我国卫生部公布的药食兼用植物材料。

近几年研究又发现，山胡椒果实挥发油中还含有大量的具有多种生物活性的单萜和倍半萜类芳香油，例如罗勒烯、α-及β蒎烯、樟烯、壬醛、癸醛和柠檬醛等。这些挥发油对常见的多种革兰氏阳性细菌、阴性细菌、新型隐球菌和白色念珠真菌均有抑菌作用。新的研究还发现山胡椒具有防癌、抗肿瘤等功效。因此，山胡椒除了作为新型的香料、食品保健品和食品保鲜剂以外，还被开发为新型的抑菌抗癌药物，受到越来越广泛的关注。

目前山胡椒的繁殖主要采用常规的种子繁殖和分株繁殖，繁殖时间长，繁殖系数低，无法满足日益高涨的生产和市场需求，许多山胡椒的优良品种资源得不到利用。生物技术的快速发展，特别是植物组织和细胞培养技术，为山胡椒的快速繁殖育种研究提供了重要基础。因此，发明一种快速高效的山胡椒繁殖方法是必然的需要。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种山胡椒的组织培养和离体快速繁殖的方法，使得在短期内可以获得大量的优质山胡椒种苗，满足市场的需要。

本发明采用的技术方案是：

一种山胡椒组织培养方法，所述方法按如下步骤进行：

（1）无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的山胡椒幼嫩的腋芽，用自来水冲洗0.5～2h，然后在体积浓度为1%洗洁精的水溶液中振摇2～5mins，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75%乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用混合消毒液浸泡20～30mins，再用无菌水冲洗3～5遍；将腋芽分切成0.5～2cm的节段，然后将节段接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养15～25天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA 1.0～4.0mg/L和NAA 0.1～0.5mg/L的MS基本培养基；

（2）芽的分化和增殖：观察步骤（1）所述24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养15～25天后的节段，切口部位开始膨大，出现绿色突起，20～40天后出现不定芽，再培养10～20天，当不定芽长到2～4cm时，将不定芽切下转接到芽增殖培养基中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-BA0.5～2.0mg/L、NAA 0.05～0.2mg/L和谷氨酰胺80～120mg/L的MS基本培养基；

（3）壮苗培养：将步骤（2）获得的丛生苗切割成单个，并转接到壮苗培养基中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养15～25天，发育成3～5cm的分化苗；所述壮苗培养基为添加6-BA 0.5～2mg/L和NAA0.1～0.3mg/L的MS基本培养基；

（4）分化苗的生根：将经壮苗培养的分化苗从基部切下，将芽苗基部切口在30～50mg/L的NAA水溶液中浸泡20～40mins，然后直接扦插入已消毒的移栽基质中，再在移栽基质中施以1/4MS无机盐含量的培养基作为养分，扦插苗盖上薄膜，保持湿度90%以上，置通风阴凉处，在24～26℃、光照1500～2500lx条件下培养10～20天后长出3～6条细根，形成完整植株，最终的生根率为90～95%；所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再曝晒基质1～3天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再在烘箱中60℃下烘2天，完成对移栽基质的消毒。

进一步，步骤（1）所述丛生芽诱导培养基优选为添加6-BA 2.0mg/L和NAA 0.3mg/L的MS基本培养基。

进一步，步骤（2）所述的芽增殖培养基优选为添加6-BA1.5mg/L、NAA 0.1mg/L和谷氨酰胺100mg/L的MS基本培养基。

进一步，步骤（3）所述壮苗培养基优选为添加6-BA 1.0mg/L和NAA0.2mg/L的MS培养基。

进一步，所述的MS基本培养基终浓度组成为：NH₄NO₃1.65克/升、KNO₃1.9克/升、CaCl₂·2H₂O 0.44克/升、MgSO₄·7H₂O 0.37克/升、KH₂PO₄0.17克/升、KI 0.83毫克/升、H₃BO₃5.2毫克/升、MgSO₄·7H₂O 22.3毫克/升、ZnSO₄·7H₂O 3.6毫克/升、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25毫克/升、CuSO₄·5H₂O0.025毫克/升、CoCl₂·6H₂O 0.025毫克/升、Na₂EDTA 37.3毫克/升、FeSO₄·7H2O 27.8毫克/升、肌醇100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、盐酸硫胺素0.1毫克/升、盐酸吡哆醇0.5毫克/升、烟酸0.5毫克/升、蔗糖20～40克/升、琼脂粉3～12克/升，溶剂为水，pH为5.6~6.0。

更进一步，本发明所述一种山胡椒组织培养方法推荐按照以下步骤进行：

（1）野外选种，选择浙江临安山胡椒基地中长势良好、无病虫害的山胡椒。

（2）无菌材料的获得：切取上述山胡椒幼嫩的腋芽，用自来水冲洗1h，在体积浓度1%洗洁精的水溶液中振摇3mins，无菌水冲净。在超净工作台上用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡40s进行表面灭菌，然后用100ml的混合消毒液消毒25mins，所述混合消毒液为99.5ml的84消毒液与0.5ml的吐温20的混合液，无菌水冲洗4遍后，将嫩芽分切成1cm的节段，然后将节段接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中，封口膜封住瓶口后，置于培养箱中，在25℃，光照2000lx条件下培养20天；所述丛生芽诱导培养基为MS基本培养基添加6-BA 2.0mg/L和NAA0.3mg/L，MS基本培养基中蔗糖30g/L、琼脂粉6g/L、溶剂为水，pH5.8。

（3）芽的分化和增殖：观察步骤（2）所述25℃，光照2000lx条件下培养20天后的节段，切口部位开始膨大，出现绿色突起，30天后出现芽分生组织（即不定芽），再培养15天，当不定芽长到3cm时，将不定芽切下转接到芽增殖培养基中在25℃，光照2000lx条件下进行增殖培养，建立丛芽增殖体系，获得丛生苗；所述的芽增殖培养基为添加6-BA1.5mg/L、NAA0.1mg/L、谷氨酰胺100mg/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖30g/L、琼脂粉6g/L、溶剂为水，pH5.8。

（4）壮苗培养：将丛生苗切割成单个，转入壮苗培养基中，分化苗基本不发生分化，而以较快速度加粗伸长生长，在25℃，光照2000lx条件下培养20天，发育成4cm的健壮无根苗，获得分化芽；所述壮苗培养基为添加6-BA1.0mg/L、NAA0.2mg/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖30g/L、琼脂粉6g/L、溶剂为水，pH5.8。

（5）分化苗的生根：将经壮苗培养的分化苗从基部切下，将芽苗基部切口在40mg/L的NAA水溶液中浸泡30mins，然后直接扦插入已消毒的移栽基质中，再在移栽基质中施以1/4MS无机盐（包含MS大量元素、微量元素和铁盐）的培养基作为养分，扦插苗盖上薄膜，保持湿度90%以上，置通风阴凉处，在25℃、光照2000lx条件下培养15天后长出5条细根，形成完整植株，最终的生根率为92%。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再曝晒基质2天，完成对移栽基质的消毒。

本发明所述MS基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖和琼脂粉。所述大量元素组成是在配置1升（1000毫升）培养基时，加硝酸铵(NH₄NO₃)1.65克、硝酸钾（KNO₃）1.9克、氯化钙（CaCl₂·2H₂O）0.44克、硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.37克、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.17克。所述微量元素组成是在配置1升（1000毫升）培养基时，加碘化钾（KI）0.83毫克、硼酸（H₃BO₃）5.2毫克、硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）22.3毫克、硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）3.6毫克、钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）0.25毫克、硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）0.025毫克、氯化钴（CoCl₂·6H₂O）0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置1升（1000毫升）培养基时，加乙二胺四乙酸二钠（Na₂EDTA）37.3毫克，硫酸亚铁（FeSO₄·7H2O）27.8毫克。所述有机物组成是在配置1升（1000毫升）培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素（VB₁）0.1毫克，盐酸吡哆醇（VB₆）0.5毫克，烟酸（VB₅）0.5毫克。蔗糖浓度是20～40克/升，琼脂粉浓度是3～12克/升。

本发明所述山胡椒幼嫩腋芽选自浙江临安山胡椒基地中长势良好、无病虫害的山胡椒。

本发明所述1/4MS无机盐含量的培养基是指将MS基本培养基中大量元素、微量元素和铁盐的含量降低为1/4的含量，有机物、蔗糖和琼脂粉均不添加，即终浓度组成为：NH₄NO₃0.4125克/升、KNO₃0.475克/升、CaCl₂·2H₂O 0.11克/升、MgSO₄·7H₂O 0.0924克/升、KH₂PO₄0.0425克/升、KI 0.2075毫克/升、H₃BO₃1.3毫克/升、MgSO₄·7H₂O 5.575毫克/升、ZnSO₄·7H₂O 0.9毫克/升、Na₂MoO₄·2H₂O 0.0625毫克/升、CuSO₄·5H₂O 0.00625毫克/升、CoCl₂·6H₂O 0.00625毫克/升、Na₂EDTA9.325毫克/升、FeSO₄·7H2O 6.95毫克/升，溶剂为水，pH为5.6~6.0。

本发明所述洗洁精是市售的各种洗洁精，作为清洗剂使用时通常以体积比1：100添加水。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

（1）以嫩芽为外植体，应用组织培养的方法进行快速繁殖，克服了山胡椒常规育种周期长、繁殖系数低等缺点；该方法还具有生产出的种苗病毒少,遗传性稳定等特点；

（2）改进外植体消毒方法：用毒性小并且易降解的84消毒液代替传统的不可降解的氯化汞消毒剂，氯化汞属于重金属有相当大的腐蚀性，并含有剧毒；长期接触更可能引起皮肤过敏或肾病综合症，进入环境对人类食物链也有相当大的破坏性，采用84消毒液对生态环境更安全环保；

（3）对培养基进行了改良，添加了谷胺酰胺植物营养调节剂，大大提高了山胡椒芽分化和增殖率；

（4）改进了组培程序，省略诱导生根的环节，具体做法是把高度达4～5厘米的健壮的芽苗从基部切下，将芽苗基部切口在30～50mg/L的NAA溶液中浸泡后，直接扦插入已消毒的细沙中，并施以1/4MS无机盐含量的培养基作养分；所述改进可以减少综合生产成本，并提高了其性状的稳定性，可实现育苗的工厂化大批量生产，可有效解决山胡椒的优质种苗的供应问题。

（四）附图说明

图1山胡椒不定芽在未添加谷氨酰胺的芽增殖培养基（MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.1mg/L）上生长（20天）情况；

图2山胡椒不定芽在添加谷氨酰胺（100mg/L）的芽增殖培养基（MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L）上生长（20天）情况；

图3山胡椒不定芽在液体芽增殖培养基（琼脂0g/L）上生长情况；

图4山胡椒不定芽在半固体芽增殖培养基（琼脂6g/L）上生长情况；

图5山胡椒不定芽在固体芽增殖培养基（琼脂12g/L）上生长情况。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述MS基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖和琼脂粉：所述大量元素组成是在配置1升（1000毫升）培养基时，加硝酸铵(NH₄NO₃)1.65克、硝酸钾（KNO₃）1.9克、氯化钙（CaCl₂·2H₂O）0.44克、硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.37克、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.17克；所述微量元素组成是在配置1升（1000毫升）培养基时，加碘化钾（KI）0.83毫克、硼酸（H₃BO₃）5.2毫克、硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）22.3毫克、硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）3.6毫克、钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）0.25毫克、硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）0.025毫克、氯化钴（CoCl₂·6H₂O）0.025毫克；所述铁盐元素组成是在配置1升（1000毫升）培养基时，加乙二胺四乙酸二钠（Na₂EDTA）37.3毫克，硫酸亚铁（FeSO₄·7H2O）27.8毫克；所述有机物组成是在配置1升（1000毫升）培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素（VB₁）0.1毫克，盐酸吡哆醇（VB₆）0.5毫克，烟酸（VB₅）0.5毫克；蔗糖浓度是20～40克/升，琼脂粉浓度是3～12g/L，溶剂为水，pH为5.6~6.0。

所述1/4MS无机盐含量的培养基终浓度组成为：NH₄NO₃0.4125克/升、KNO₃0.475克/升、CaCl₂·2H₂O 0.11克/升、MgSO₄·7H₂O 0.0924克/升、KH₂PO₄0.0425克/升、KI 0.2075毫克/升、H₃BO₃1.3毫克/升、MgSO₄·7H₂O 5.575毫克/升、ZnSO₄·7H₂O 0.9毫克/升、Na₂MoO₄·2H₂O0.0625毫克/升、CuSO₄·5H₂O 0.00625毫克/升、CoCl₂·6H₂O 0.00625毫克/升、Na₂EDTA 9.325毫克/升、FeSO₄·7H2O 6.95毫克/升，溶剂为水，pH为5.6~6.0。

实施例1

（1）野外选种：选择浙江临安山胡椒基地中长势良好、无病虫害的山胡椒。

（2）无菌材料的获得：切取上述山胡椒幼嫩的腋芽，用自来水冲洗0.5h，在体积浓度为1%洗洁精（传化洗洁精）（体积比W/W）的水溶液中振摇2mins，无菌水冲净。在超净工作台上用体积浓度70%乙醇水溶液浸泡30s进行表面灭菌，然后用混合消毒液100ml消毒20mins (所述混合消毒液是99.5ml的84消毒液与0.5ml的吐温20的混合液)，无菌水冲洗3遍后，将嫩芽分切成0.5cm的节段，然后将节段接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24℃，光照1500lx条件下培养15天。所述丛生芽诱导培养基为MS基本培养基添加6-BA 1.0mg/L和NAA0.1mg/L，MS基本培养基中蔗糖20g/L、琼脂粉3g/L、溶剂为水，pH5.6。

（3）芽的分化和增殖：观察步骤（1）所述24℃，光照1500lx条件下培养15天后的节段，切口部位开始膨大，出现绿色突起，20天后出现芽分生组织（即不定芽）。再培养10天，当不定芽长到2cm时，将不定芽切下转接到芽增殖培养基中在24℃，光照1500lx条件下进行增殖培养，建立丛芽增殖体系，获得丛生苗。所述的芽增殖培养基为添加6-BA0.5mg/L、NAA0.05mg/L、谷氨酰胺80mg/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖20g/L、琼脂粉3g/L、溶剂为水，pH5.6。

（4）壮苗培养：将步骤（3）获得的丛生苗切割成单个，转入壮苗培养基中，分化苗基本不发生分化，而以较快速度加粗伸长生长，在24℃，光照1500lx条件下培养15天，发育成3cm的健壮无根苗，获得分化芽。所述壮苗培养基为添加6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖20g/L、琼脂粉3g/L、溶剂为水，pH5.6。

（5）分化苗的生根：将经壮苗培养的分化苗从基部切下，将芽苗基部切口在30mg/L的NAA水溶液中浸泡20mins，然后直接扦插入已消毒的移栽基质中，在移栽基质中施以1/4MS无机盐（包含MS大量元素、微量元素和铁盐）含量的培养基作为养分，扦插苗盖上薄膜，保持湿度90%以上，置通风阴凉处。在24℃、光照1500lx条件下培养10天后分化苗平均长出3条细根，形成完整植株,最终的生根率为90%。移栽基质按细沙：腐殖土：谷糠灰的质量比为5：2：2配制。移栽基质的消毒方法采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3天后揭开薄膜再曝晒基质1天进行消毒。

实施例2不同的消毒剂对山胡椒外植体生长的影响

分别用质量浓度10%的过氧化氢（H₂O₂）水溶液、质量浓度0.1%的氯化汞（HgCl₂）水溶液及实施例1中的混合消毒液(所述混合消毒液是99.5ml的84消毒液与0.5ml的吐温20的混合液)对山胡椒的外植体材料（即腋芽）进行消毒，其它操作同实施例1。分别将节段接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中，封口膜封住瓶口后，置于培养箱中。在24℃，光照1500lx条件下进行培养15天后，观察统计不同消毒剂对山胡椒芽诱导和生长的影响，结果见表1所示。结果表明，混合消毒液和质量浓度0.1%HgCl₂的消毒效果基本相同，质量浓度10%的过氧化氢消毒效果稍差，污染率达到25%，生长缓慢。但是质量浓度0.1%HgCl₂消毒对芽的诱导有影响，诱导率仅88%，而且外植体有发褐现象，芽的生长也比较慢，可能是HgCl₂毒害细胞对芽的诱导有一定的影响。而混合消毒液污染率仅达15%，但是芽诱导率高达98%，并且外植体呈绿色，出现芽点早，生长较快。说明混合消毒液对山胡椒外植体的消毒和芽诱导效果最佳。

表1不同的消毒剂对山胡椒外植体生长的影响

实施例3不同激素组合对山胡椒芽的诱导影响

将山胡椒腋芽分别接种在添加了不同浓度6-BA和NAA的MS基本培养基（即丛生芽诱导培养基）中，其它操作同实施例1，山胡椒不定芽生长结果见表2所示。结果表明，不同激素组合的培养基均可以不同程度地影响芽的形成，但是激素配比浓度过高和过低，对山胡椒芽的诱导均不利，会出现黄白芽、生根和玻璃化现象。其中以培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.3mg/L对山胡椒芽的诱导为最好，诱导出的再生芽最多，芽绿色，生长快，芽大而健壮，无生根和玻璃化现象，平均芽长1.75cm，芽诱导率达100%。

表2不同激素浓度对山胡椒芽的诱导影响

实施例4谷氨酰胺对山胡椒芽诱导和增殖的影响

将山胡椒的不定芽分别接种到添加了不同浓度谷氨酰胺的芽增殖培养基中，其它操作同实施例1，获得丛生苗，谷氨酰胺对山胡椒芽诱导和增殖的影响结果如表3所示。结果发现，山胡椒不定芽在未添加谷氨酰胺的芽增殖培养基中，均呈现苗纤弱而小，叶黄化，增殖少，生长慢的现象，即使在优化的芽增殖培养基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.1mg/L中，未添加谷氨酰胺，增值率最高仅达193%（见图1）。添加谷氨酰胺80～100mg/L均能促进山胡椒芽的增殖，其中谷氨酰胺的添加浓度100mg/L对芽增殖效果较好，在优化的芽增殖培养基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.1mg/L中添加100mg/L的谷氨酰胺，增值率可以达到270%，苗较大，叶绿色，健壮而且增殖多，生长旺盛（见图2）。

表3谷氨酰胺对山胡椒芽诱导和增殖的影响

实施例5不同浓度琼脂对山胡椒芽诱导和增殖的影响

将山胡椒的不定芽分别接种到添加了不同浓度琼脂粉的芽增殖培养基中，其它操作同实施例1，观察在不同硬度的培养基中山胡椒的芽生长状况，获得丛生苗，结果见表4所示。结果表明，在液体状态的芽增殖培养基（琼脂浓度0g/L）中芽增殖率仅达200%，并且苗纤弱，有黄化现象，苗生长不整齐（见图3）。固体状态的芽增殖培养基（琼脂浓度9g/L、12g/L），因为培养基太硬的缘故，造成分化苗发黄白色，生长较慢，其中琼脂浓度12g/L的培养基对山胡椒芽增殖率仅达到210%（见图5）。半固体状态（琼脂浓度6g/L）对山胡椒的芽增殖较好，芽增殖率达到290%，并且苗健壮而整齐（见图4）。

表4不同浓度琼脂对山胡椒芽诱导和增殖的影响

实施例6

（2）无菌材料的获得：切取上述山胡椒幼嫩的腋芽，用自来水冲洗1h，在体积浓度1%洗洁精（传化洗洁精）（体积比W/W）的水溶液中振摇3mins，无菌水冲净。在超净工作台上用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡40s进行表面灭菌，然后用100ml的混合消毒液消毒25mins，所述混合消毒液为99.5ml的84消毒液与0.5ml的吐温20的混合液，无菌水冲洗4遍后，将嫩芽分切成1cm的节段，然后将节段接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中，封口膜封住瓶口后，置于培养箱中，在25℃，光照2000lx条件下培养20天；所述丛生芽诱导培养基为MS基本培养基添加6-BA 2.0mg/L和NAA0.3mg/L，MS基本培养基中蔗糖30g/L、琼脂粉6g/L、溶剂为水，pH5.8。

实施例7

（2）无菌材料的获得：切取上述山胡椒幼嫩的腋芽，用自来水冲洗2h，在体积浓度1%洗洁精（传化洗洁精）（体积比W/W）的水溶液中振摇5mins，无菌水冲净。在超净工作台上用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡60s进行表面灭菌，然后用100ml的混合消毒液消毒30mins，所述混合消毒液为99.5ml的84消毒液与0.5ml的吐温20的混合液，无菌水冲洗5遍后，将嫩芽分切成2cm的节段，然后接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖，并用封口膜封瓶口，置于培养箱中，在26℃，光照2500lx条件下培养25天。所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA4.0mg/L、NAA0.5mg/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖40g/L、琼脂粉12g/L、溶剂为水，pH6.0。

（3）芽的分化和增殖：观察步骤（2）所述在26℃，光照2500lx条件下培养25天的节段，切口部位开始膨大，出现绿色突起，40天后出现芽分生组织（即不定芽），再培养20天，当不定芽长到4cm时，将不定芽切下转入到芽增殖培养基中，在26℃，光照2500lx条件下进行增殖培养，建立丛芽增殖体系，获得丛生苗。所述芽增殖培养基为添加6-BA2.0mg/L、NAA0.2mg/L、谷氨酰胺120mg/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖40g/L、琼脂粉12g/L、溶剂为水，pH6.0。

（4）壮苗培养：将步骤（3）获得的丛生苗切割成单个，转入壮苗培养基中，分化苗基本不发生分化，而以较快速度加粗伸长生长。在26℃，光照2500lx条件下培养25天，发育成5cm的健壮无根苗，获得分化芽。所述壮苗培养基为添加6-BA2.0mg/L、NAA0.3mg/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖40g/L、琼脂粉12g/L、溶剂为水，pH6.0。

（5）分化苗的生根：将经壮苗培养的分化苗从基部切下，将芽苗基部切口在50mg/L的NAA水溶液中浸泡40mins，然后直接扦插入已消毒的移栽基质中，再在移栽基质中施以1/4MS无机盐（包含MS大量元素、微量元素和铁盐）的培养基作为养分，扦插苗盖上薄膜，保持湿度90%以上，置通风阴凉处，在26℃、光照2500lx条件下培养20天后长出平均6条细根，形成完整植株，最终的生根率为95%。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖5天后揭开薄膜再曝晒基质3天，完成对移栽基质的消毒。

Claims

1.一种山胡椒组织培养方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：

（1）无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的山胡椒幼嫩的腋芽，用自来水冲洗0.5～2h，然后在体积浓度为1%洗洁精的水溶液中振摇2～5mins，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75%乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用混合消毒液浸泡20～30mins，所述的混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液，再用无菌水冲洗3～5遍，将腋芽分切成0.5～2cm的节段，然后将节段接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养15～25天；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA1.0～4.0mg/L和NAA 0.1～0.5mg/L的MS基本培养基；

（2）芽的分化和增殖：观察步骤（1）所述24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养15～25天后的节段，切口部位开始膨大，出现绿色突起，20～40天后出现不定芽，再培养10～20天后，当不定芽长到2～4cm时，将不定芽切下转接到芽增殖培养基中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-BA 0.5～2.0mg/L、NAA0.05～0.2mg/L和谷氨酰胺80～120mg/L的MS基本培养基；

（4）分化苗的生根：将经壮苗培养的分化苗从基部切下，将芽苗基部切口在30～50mg/L的NAA水溶液中浸泡20～40mins，然后直接扦插入已消毒的移栽基质中，再在移栽基质中施以1/4MS无机盐含量的培养基作为养分，扦插苗盖上薄膜，保持湿度90%以上，置通风阴凉处，在24～26℃、光照1500～2500lx条件下培养10～20天后长出3～6条细根，形成完整植株，最终的生根率为90～95%；所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5%福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再曝晒1～3天，完成对移栽基质的消毒。

2.如权利要求1所述山胡椒组织培养方法，其特征在于步骤（1）所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA 2.0mg/L和NAA 0.3mg/L的MS基本培养基。

3.如权利要求1所述山胡椒组织培养方法，其特征在于步骤（2）所述的芽增殖培养基为添加6-BA1.5mg/L、NAA 0.1mg/L和谷氨酰胺100mg/L的MS基本培养基。

4.如权利要求1所述山胡椒组织培养方法，其特征在于步骤（3）所述壮苗培养基为添加6-BA 1.0mg/L和NAA 0.2mg/L的MS培养基。

5.如权利要求1～4之一所述山胡椒组织培养方法，其特征在于所述的MS基本培养基终浓度组成为：NH₄NO₃1.65克/升、KNO₃1.9克/升、CaCl₂·2H₂O 0.44克/升、MgSO₄·7H₂O 0.37克/升、KH₂PO₄0.17克/升、KI 0.83毫克/升、H₃BO₃5.2毫克/升、MgSO₄·7H₂O 22.3毫克/升、ZnSO₄·7H₂O 3.6毫克/升、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25毫克/升、CuSO₄·5H₂O 0.025毫克/升、CoCl₂·6H₂O 0.025毫克/升、Na₂EDTA 37.3毫克/升、FeSO₄·7H2O 27.8毫克/升、肌醇100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、盐酸硫胺素0.1毫克/升、盐酸吡哆醇0.5毫克/升、烟酸0.5毫克/升、蔗糖20～40克/升、琼脂粉3～12克/升，溶剂为水，pH为5.6~6。