CN108012932A - 一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法。本发明选取生长状态良好的天竺葵的嫩茎做为外植体，将外植体消毒后，切成小段诱导愈伤组织，将诱导出的愈伤组织转移到分化培养基中诱导芽的产生，将诱导芽接种到新的分化培养基上诱导幼芽生成叶片，然后接种到生根培养基中进行生根培养，最后进行炼苗、移栽。本发明可以大大提高繁殖速度、降低成本，并且能较好地保持天竺葵的品系优势，为香叶天竺葵的快速繁殖提供一条有效的途径；通过对各类培养基进行复配选择，显著降低组织培养过程中的褐化和材料污染问题，愈伤诱导成功率高，能够达到快速繁殖的目的，通过各条件的协同配合，提高生根率和成活率。

Description

一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
香叶天竺葵(Pelargoniumcrispum‘Fragrans’)又名香叶洋绣球、香草、摸摸香，为牻牛儿科、天竺葵属多年生亚灌木，常用作室内盆栽观赏植物。香叶天竺葵的茎叶中可提取芳香油，是香皂、香水、化妆品及食品等的重要原料，叶片可用于香枕、亚麻袋等，也可做烹煮鱼类的佐料，增加菜肴风味。香叶天竺葵全株可入药，香葵精油还具有抗肿瘤作用，另外，它还具有抗氯气的特性，可作为被氯气污染的环境的指示植物。香叶天竺葵主要采用扦插繁殖和有性繁殖，扦插繁殖管理难度大，并受季节的限制，扦插苗不能脱毒，导致品质退化。有性繁殖的F1代杂交种子因具有生长周期短、株型健壮、多花性、易大批量生产等优势，已成为目前主要的繁殖方法。但杂交种子生产成本高，若采用组织培养进行繁殖,可以大大提高繁殖速度、降低成本和脱毒复壮，为香叶天竺葵提供一条有效的快繁途径。
现有技术中，香叶天竺葵在培养过程中，褐化等问题导致外植体死亡现象较为普遍且死亡率较高，因此，如何研发一种减少污染及褐化的培养方法，提高培养效率成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法，通过对香叶天竺葵幼嫩的茎进行组织培养获得香叶天竺葵幼苗。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与消毒
选取长势良好、无病虫害的健康嫩茎，去掉叶片，用清水冲洗一个小时，然后用清洗液清洗15min，再用多菌灵浸泡10min，再用75%的乙醇消毒30S，用无菌水冲洗4～5次，每次冲洗1min，得到无菌外植体；
（2）愈伤组织的诱导
将步骤（1）无菌外植体切成0.5-1.0cm的小段，接种在愈伤诱导培养基上进行暗培养，得到愈伤组织；
（3）愈伤组织再分化得到植株
将步骤（2）诱导出的愈伤组织转移到分化培养基上诱导产生幼芽，按照“光培养14h-暗培养10h”的周期，首先培养10天分化出幼芽，再继续培养3-4周，当愈伤组织分化产生大量的幼芽后，转移接种到新的分化培养基上，按照光培养14h-暗培养10h”，培养3-4周，诱导幼芽生成叶片，长成完整的植株；
（4）植株诱导生根
分离步骤（3）分化培养基诱导得到的植株，然后转移到生根培养基中，按照“光培养14h-暗培养10h”的周期，在组培瓶中培养4周，得到带有根的完整的植株；
（5）炼苗与移栽
将步骤（4）中的组培瓶瓶盖打开，瓶口覆保鲜膜炼苗2天，植株取出后，冲洗干净根上残留的培养基，移栽至基质中，置于阴凉通风处，温度保持23-26℃，移栽第一周每天早晚各喷水一次，使植株生长环境的湿度维持在75%左右。
优选的，步骤（1）中，所述清洗液每L含有脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠1g、乙基苯基聚乙二醇1.5g、氯化锌0.02g、普鲁兰多糖2g，余量为水。
优选的，步骤（2）中，所述愈伤诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入30g蔗糖、2.4g植物凝胶、0.8g芦荟汁，2.0mg 6-苄基腺嘌呤、0.5mg α-萘乙酸，用KOH调节pH为5.8～6.2，高温高压灭菌后加入1mg抗坏血酸。
本发明所使用的芦荟汁采用以下方法制备而成：将新鲜芦荟清洗干净后，带皮切成3×3mm丁状，然后利用按照料液比1g：10mL加入由葡萄糖酸镁-聚乙二醇-水组成的溶剂体系中，然后打浆，加热至30℃浸泡20min，挤压过滤，得滤液即为芦荟汁。
优选的，步骤（2）中，所述暗培养为在26±1℃的温度下培养4周。
优选的，步骤（3）中，所述分化培养基是以MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入20g 蔗糖、2.4g 植物凝胶、2.0mg 6-苄基腺嘌呤，0.5mg α-萘乙酸，用KOH调节pH为5.8～6.2。
优选的，步骤（3）中，所述分化出幼芽后，继续培养3-4周时，按照“光培养16h-暗培养8h”的周期进行。
本发明步骤（3）和（4）中，所述“光培养-暗培养”的周期均为在26±1℃下进行。
本发明在进行“光培养-暗培养”周期过程中，所述光培养的光照强度为2000-2200lx。
优选的，步骤（4）中，所述的生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入20g 蔗糖、2.4g 植物凝胶、0.1mg 吲哚-3-乙酸、0.5mg MET，用KOH调节pH为5.8～6.2。
本发明选取生长状态良好的天竺葵的嫩茎做为外植体，将外植体消毒后，切成0.5-1.0cm的小段接种到愈伤诱导培养基诱导愈伤组织，将诱导出的愈伤组织转移到分化培养基中诱导芽的产生，将诱导出的小芽接种到新的分化培养基上诱导幼芽生成叶片。将诱导出的植株接种到生根培养基中进行生根培养，待植株生根完成长成完整的植株后，对植株进行炼苗、移栽。香叶天竺葵嫩茎多酚化合物含量较高，在组织培养过程中，培养物中的多酚化合物被氧化形成褐色的醌类物质，导致代谢紊乱，生长受阻，引起褐化。本发明中在愈伤诱导培养基中通过各个组分的协同配合作用，可以明显减轻褐化，提高愈伤诱导率，解决了目前香叶天竺葵组织培养过程中愈伤诱导率低等问题。本发明方法在培养过程中合理选定培养基的组分，针对性的调整光照模式，加快组织生长速度，提高香叶天竺葵的繁殖速度。
本发明技术方案，有益效果为：材料易得，可操作性强，组织褐化率低，愈伤诱导成功率相对较高，愈伤组织分化后得苗率较高。该发明可以大大提高繁殖速度、降低成本，并且能较好地保持天竺葵的品系优势，为香叶天竺葵的快速繁殖提供一条有效的途径；通过对各类培养基进行复配选择，显著降低组织培养过程中的褐化和材料污染问题，愈伤诱导成功率高，能够达到快速繁殖的目的，通过各条件的协同配合，加快组织生长速度，提高生根率和成活率。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述。
本发明进行光培养时的光照强度均为2000-2200lx。
实施例1
一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法，步骤如下：
（1）外植体的选择与消毒
选取长势良好、无病虫害的健康嫩茎，去掉叶片，用清水冲洗一个小时，然后用清洗液清洗15min，再用多菌灵浸泡10min，再用75%的乙醇消毒30S，用无菌水冲洗4～5次，每次冲洗1min，得到无菌外植体；
所述清洗液每L含有脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠1g、乙基苯基聚乙二醇1.5g、氯化锌0.02g、普鲁兰多糖2g；
（2）愈伤组织的诱导
将步骤（1）无菌外植体切成0.5-1.0cm的小段，接种在愈伤诱导培养基上在26±1℃的温度下暗培养4周，得到愈伤组织；
所述愈伤诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入30g蔗糖、2.4g植物凝胶、0.8g芦荟汁，2.0mg 6-苄基腺嘌呤、0.5mg α-萘乙酸，用KOH调节pH为5.8～6.2，高温高压灭菌后加入1mg抗坏血酸；
（3）愈伤组织再分化得到植株
将步骤（2）诱导出的愈伤组织转移到分化培养基上诱导产生幼芽，按照“光培养14h-暗培养10h”的周期，在26±1℃的温度下，首先培养10天分化出幼芽，再继续按照“光培养16h-暗培养8h”的周期进行培养3-4周，当愈伤组织分化产生大量的幼芽后，转移接种到新的分化培养基上，按照光培养14h-暗培养10h”，培养3-4周，诱导幼芽生成叶片，长成完整的植株；
所述分化培养基是以MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入20g 蔗糖、2.4g 植物凝胶、2.0mg 6-苄基腺嘌呤，0.5mg α-萘乙酸，用KOH调节pH为5.8～6.2；
（4）植株诱导生根
分离步骤（3）分化培养基诱导得到的植株，然后转移到生根培养基中，按照“光培养14h-暗培养10h”的周期，在组培瓶中，在26±1℃的温度下培养4周，得到带有根的完整的植株；
（5）炼苗与移栽
将步骤（4）中的组培瓶瓶盖打开，瓶口覆保鲜膜炼苗2天，植株取出后，冲洗干净根上残留的培养基，移栽至基质中，置于阴凉通风处，温度保持23-26℃，移栽第一周每天早晚各喷水一次，使植株生长环境的湿度维持在75%左右；
所述的生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入20g 蔗糖、2.4g植物凝胶、0.1mg 吲哚-3-乙酸、0.5mg MET，用KOH调节pH为5.8～6.2。
对比例1
一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法，步骤如下：
（1）外植体的选择与消毒
选取长势良好、无病虫害的健康嫩茎，去掉叶片，用清水冲洗一个小时，然后用洗洁精清洗15min，再用多菌灵浸泡10min，再用75%的乙醇消毒30S，最后用含5%有效氯的次氯酸钠溶液浸泡灭菌5～8min，用无菌水冲洗4～5次，每次冲洗1min，得到无菌外植体；
其他步骤同实施例1。
对比例2
一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法，步骤如下：
（1）外植体的选择与消毒
选取长势良好、无病虫害的健康嫩茎，去掉叶片，用清水冲洗一个小时，然后用清洗液清洗15min，再用多菌灵浸泡10min，再用75%的乙醇消毒30S，用无菌水冲洗4～5次，每次冲洗1min，得到无菌外植体；
所述清洗液每L含有脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠1g、乙基苯基聚乙二醇1.5g，余量的水；
对比例3
一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法，步骤如下：
（1）外植体的选择与消毒
选取长势良好、无病虫害的健康带芽嫩茎，用清水冲洗一个小时，用0.1%的氯化汞、75%的乙醇消毒，用无菌水冲洗4～5次，每次冲洗1min，得到无菌外植体；
（2）将带芽茎断形态学下端插入培养基中，然后进行光暗交替培养，按照“光培养14d-暗培养10h”，在25±2℃的温度下进行培养至得到带有根的完整的植株；
该培养基为：以MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入3.0mg 6-苄基腺嘌呤、0.5mg α-萘乙酸，用KOH调节pH为5.8～6.2，高温高压灭菌后加入1mg抗坏血酸。
对比例4
一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法，步骤如下：
（1）外植体的选择与消毒
选取长势良好、无病虫害的健康嫩茎，去掉叶片，用清水冲洗一个小时，然后用清洗液（组成同实施例1）清洗15min，再用多菌灵浸泡10min，再用75%的乙醇消毒30S，用无菌水冲洗4～5次，每次冲洗1min，得到无菌外植体；
（2）愈伤组织的诱导
将步骤（1）无菌外植体切成0.5-1.0cm的小段，接种在愈伤诱导培养基上在26±1℃的温度下暗培养4周，得到愈伤组织；
所述愈伤诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入30g蔗糖、2.4g植物凝胶、2.0mg 6-苄基腺嘌呤、0.5mg α-萘乙酸，用KOH调节pH为5.8～6.2，高温高压灭菌后加入1mg抗坏血酸；
（3）愈伤组织再分化得到植株
将步骤（2）诱导出的愈伤组织转移到分化培养基（组成同实施例1）上诱导产生幼芽，按照“光培养14h-暗培养10h”的周期，在26±1℃的温度下，首先培养10天分化出幼芽，再继续按照“光培养14h-暗培养10h”的周期培养3-4周，当愈伤组织分化产生大量的幼芽后，转移接种到新的分化培养基上，按照光培养14h-暗培养10h”，培养3-4周，诱导幼芽生成叶片，长成完整的植株；
（4）植株诱导生根
分离步骤（3）分化培养基诱导得到的植株，然后转移到生根培养基（组成同实施例1）中，按照“光培养14h-暗培养10h”的周期，在组培瓶中，在26±1℃的温度下培养4周，得到带有根的完整的植株；
（5）炼苗与移栽
将步骤（4）中的组培瓶瓶盖打开，瓶口覆保鲜膜炼苗2天，植株取出后，冲洗干净根上残留的培养基，移栽至基质中，置于阴凉通风处，温度保持23-26℃，移栽第一周每天早晚各喷水一次，使植株生长环境的湿度维持在75%左右；
（一）将实施例及对比例中提供的培养方法进行统计，具体结果见表1。
具体计算公式如下：
褐化率(%)=褐化外植体数/接种外植体总数×100%
死亡率(%)=死亡外植体数/接种外植体总数×100%
愈伤诱导率(%)=发生愈伤组织外植体数/成活外植体数×100%
生根率(%)=生根苗数/生根培养基上总苗数×100%
炼苗成活率(%)=成活苗数/炼苗总苗数×100%
表1
（二）将实施例及对比例提供的培养方法培养的组织进行不定芽及愈伤组织的统计，具体结果见表2。
表2

Claims (9)

1.一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与消毒
选取长势良好、无病虫害的健康嫩茎，去掉叶片，用清水冲洗一个小时，然后用清洗液清洗15min，再用多菌灵浸泡10min，再用75%的乙醇消毒30S，用无菌水冲洗4～5次，每次冲洗1min，得到无菌外植体；
（2）愈伤组织的诱导
将步骤（1）无菌外植体切成0.5-1.0cm的小段，接种在愈伤诱导培养基上进行暗培养，得到愈伤组织；
（3）愈伤组织再分化得到植株
将步骤（2）诱导出的愈伤组织转移到分化培养基上诱导产生幼芽，按照“光培养14h-暗培养10h”的周期，首先培养10天分化出幼芽，再继续培养3-4周，当愈伤组织分化产生大量的幼芽后，转移接种到新的分化培养基上，按照光培养14h-暗培养10h”，培养3-4周，诱导幼芽生成叶片，长成完整的植株；
（4）植株诱导生根
分离步骤（3）分化培养基诱导得到的植株，然后转移到生根培养基中，按照“光培养14h-暗培养10h”的周期，在组培瓶中培养4周，得到带有根的完整的植株；
（5）炼苗与移栽
将步骤（4）中的组培瓶瓶盖打开，瓶口覆保鲜膜炼苗2天，植株取出后，冲洗干净根上残留的培养基，移栽至基质中，置于阴凉通风处，温度保持23-26℃，移栽第一周每天早晚各喷水一次，使植株生长环境的湿度维持在75%左右。
2.根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤（1）中，所述清洗液每L含有脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠1g、乙基苯基聚乙二醇1.5g、氯化锌0.02g、普鲁兰多糖2g，余量为水。
3.根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤（2）中，所述愈伤诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入30g蔗糖、2.4g植物凝胶、0.8g芦荟汁，2.0mg 6-苄基腺嘌呤、0.5mg α-萘乙酸，用KOH调节pH为5.8～6.2，高温高压灭菌后加入1mg抗坏血酸。
4.根据权利要求2或3所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤（2）中，所述暗培养为在26±1℃的温度下培养4周。
5. 根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤（3）中，所述分化培养基是以MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入20g 蔗糖、2.4g 植物凝胶、2.0mg6-苄基腺嘌呤，0.5mg α-萘乙酸，用KOH调节pH为5.8～6.2。
6.根据权利要求1或5所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤（3）中，所述分化出幼芽后，继续培养3-4周时，按照“光培养16h-暗培养8h”的周期进行。
7.根据权利要求1、5或6所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤（3）和（4）中，所述“光培养-暗培养”的周期均为在26±1℃下进行。
8.根据权利要求7所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述光培养的光照强度为2000-2200lx。
9. 根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤（4）中，所述的生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升培养基中加入20g 蔗糖、2.4g 植物凝胶、0.1mg 吲哚-3-乙酸、0.5mg MET，用KOH调节pH为5.8～6.2。
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