CN105340734B - 明月草组织培养快速繁殖培养基及组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了明月草组织培养快速繁殖培养基及组织培养快速繁殖方法,方法包括外植体消毒、腋芽诱导培养、继代培养、生根培养和移栽技术。本发明的组培配方是明月草大量扩繁的最佳组合,增殖系数达到5‑6倍,生根率和移栽成活率均在95%以上。本发明弥补了传统育苗技术的一些不足,提高了繁殖系数,缩短繁殖周期,并解决季节性限制问题,建立的规模化生产体系稳定、苗木品质高,生产周期只需一个半月左右,满足了种苗繁育的工厂化需求。

Description

明月草组织培养快速繁殖培养基及组织培养快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域,特别是涉及明月草组织培养快速繁殖培养基及组织培养快速繁殖方法。
背景技术
明月草(Angelica keiskei koidzumi)又称金鸡毛草,属菊科菊三七属,为宿根多年生长常绿直立草本植物,原产于新加坡。明月草含有多种天然活性物质,特别是富含特有物质查尔酮及香豆素(尹慧丹等,2011),全草可入药,具有增强人体免疫力、舒张血管、抑制胃酸分泌、抗血栓、降血糖、降血压、抗组胺、防癌变等功效(Enoki T,et al.,2007)。近年来,明月草又成为人们喜爱的一种蔬菜,主要食用茎叶,食法多样,可炒食、炸食、凉拌,氽汤或做成茶汁,其具有独特的芳香,可解鱼、肉的腥膻味,茎叶煮水后食味柔滑,口感清爽。
明月草以分株或扦插繁殖为主,多在每年3-5月进行,但受季节影响较大,且繁殖系数和出苗率低,难以满足规模化生产的需求。组织培养繁殖速度快,所产种苗为脱毒苗,因此,采用组织培养技术是实现对明月草规模化繁殖的有效途径。国内利用组织培养技术繁育明月草的研究尚未见报道。
发明内容
为了解决上述的技术问题,本发明的一个目的是建立一种有效的明月草组织培养快速繁殖方法,提高繁殖系数,缩短繁殖周期,并解决季节性限制问题。本发明的另一个目的是提供上述明月草组织培养快速繁殖培养基。
本发明的技术方案如下:
明月草组织培养快速繁殖培养基,包括腋芽诱导培养基、继代培养基、壮苗培养基和生根培养基,其中:
腋芽诱导培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8;
继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+AD0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8;
壮苗培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8;
生根培养基为1/2MS0+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8。
本发明所述的MS基本培养基成分构成如下:
(1)大量元素:KNO31260mg/L、NH4NO31320mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO4170mg/L、FeSO4·7H2O 427.8mg/L、EDTA-2Na 37.3mg/L;
(2)微量元素:MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3PO36.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L;
(3)有机物:C6H12O6·2H2O(肌醇)100mg/L、NH2CH2COOH(甘氨酸)2.0mg/L、C8H11O3N·HCl(盐酸吡哆醇)0.5mg/L、NC5H4COOH(烟酸)0.5mg/L、C12H17C10S·2HCL(盐酸硫胺素)0.1mg/L;
余量为蒸馏水。
所述1/2MS基本培养基的成分为:大量元素是MS基本培养基的一半,其余成分微量元素、铁盐、有机成分与MS基本培养基相同。
所述的MS0培养基成分构成如下:
(1)大量元素:KNO31260mg/L、NH4NO31320mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO4170mg/L、FeSO4·7H2O 855.6mg/L、EDTA-2Na 37.3mg/L;
(2)微量元素:MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3PO36.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L;
(3)有机物:C6H12O6·2H2O(肌醇)100mg/L、NH2CH2COOH(甘氨酸)2.0mg/L、C8H11O3N·HCl(盐酸吡哆醇)0.5mg/L、NC5H4COOH(烟酸)0.5mg/L、C12H17C10S·2HCL(盐酸硫胺素)0.1mg/L。
明月草组织培养快速繁殖方法,包括如下步骤:
步骤1,外植体的选择:春季以明月草母株上带有潜伏芽的新发枝条为外植体;
步骤2,外植体的消毒:剪去枝条叶片,用自来水冲洗2-3分钟,再用洗洁精洗涤1-2次,接着用自来水冲洗3-5分钟,再在超净工作台上以0.1%HgCl2溶液消毒8-12分钟,最后用无菌水冲洗4-5遍,沥干后待用;
步骤3,腋芽诱导培养:将消毒好的枝条切除茎尖,余下的枝条剪成每段带有1-2个腋芽的茎段,接种到腋芽诱导培养基上放进培养室进行无菌培养,腋芽诱导培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8,MS培养基经高压灭菌15-20分钟,培养条件为温度25-30℃,光照强度1500-2000lx,每日光照12小时条件下培养,接种后5天腋芽开始萌动,当15-20天伸长至2±0.5cm时,即可进入继代培养;
步骤4,继代培养:将步骤3中获得的不定芽进行继代培养,培养基为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+AD0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8,MS培养基经高压灭菌15-20分钟,培养条件为温度25-30℃,光照强度1500-2000lx,每日光照12-14小时条件下培养,培养7-10天,待丛生芽长至1.5-2cm时进行壮苗培养;
步骤5,壮苗培养:将继代苗切下接种进行壮苗培养,培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8,温度、光照条件同步骤4,培养10天,将长至3-4cm的幼苗转至生根培养;
步骤6,生根培养:将步骤5中获得的幼苗进行生根培养,培养基为1/2MS0+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8,培养条件同步骤4,培养两周当生根条数达到6条以上,平均根长0.5cm以上时便用清水将根部琼脂清洗干净进行移栽;
步骤7,移栽与管护:育苗棚具有一定遮阴效果和通风条件,移栽基质选用黄心土,苗床提前1天用0.15%KMnO4消毒(袋苗需将黄心土装袋后移栽前一天喷淋0.15%KMnO4消毒液),生根苗移栽后用清水淋透,用塑料薄膜覆盖,以后每隔一周喷施800-1000倍甲基托布津或1000倍多菌灵药液,连续喷3-4次,20天后逐步通风,并移除遮盖物。
本发明明月草组织培养快速繁殖方法中所述的高压灭菌,优选压力为1.1kg/cm2
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1、本发明建立了以茎段为外植体的明月草组织培养快速繁殖方法,一个培养周期内的增殖系数达到5-6倍,生根率和移栽成活率均达到95%以上。
2、本发明克服了传统繁殖方式受季节与气候限制的不足,有效提高了明月草的繁殖系数,缩短了繁殖周期,并解决季节性限制问题,建立的规模化生产体系稳定、苗木品质高,生产周期只需一个半月左右,满足了种苗繁育的工厂化需求,为该物种的保存及产业化提供了可靠、高效的繁殖方法。
附图说明
图1为明月草茎段诱导。
图2为明月草丛生芽。
图3为明月草生根苗。
图4为明月草移栽袋苗。
图5为苗床明月草小苗。
具体实施方式
下面以实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不局限于这些实施
例。实施例1:
明月草组织培养快速繁殖培养基,包括腋芽诱导培养基、继代培养基、壮苗培养基和生根培养基,配制方法为:
腋芽诱导培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5,经1.1kg/cm2高压灭菌20分钟;
继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+AD0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.8,经1.1kg/cm2高压灭菌20分钟;
壮苗培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.8,经1.1kg/cm2高压灭菌20分钟;
生根培养基为1/2MS0+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.8,经1.1kg/cm2高压灭菌20分钟。
实施例2:
明月草组织培养快速繁殖培养基,包括腋芽诱导培养基、继代培养基、壮苗培养基和生根培养基,配制方法为:
腋芽诱导培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.8,经1.1kg/cm2高压灭菌15分钟;
继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+AD0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5,经1.1kg/cm2高压灭菌15分钟;
壮苗培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5,经1.1kg/cm2高压灭菌15分钟;
生根培养基为1/2MS0+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5,经1.1kg/cm2高压灭菌15分钟。
实施例3:
明月草组织培养快速繁殖方法:
(1)外植体的选择:春季以明月草母株上带有潜伏芽的新发枝条为外植体;
(2)外植体的消毒:剪去枝条叶片,用自来水冲洗2-3分钟,再用洗洁精洗涤1-2次,接着用自来水冲洗5分钟,再在超净工作台上以0.1%HgCl2溶液消毒10分钟,最后用无菌水冲洗5遍,沥干后待用;
(3)腋芽诱导培养:将消毒好的枝条切除茎尖,余下的枝条剪成每段带有1-2个腋芽的茎段,接种到诱导培养基上放进培养室进行无菌培养,培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3g/L,pH5.6,MS培养基经1.1kg/cm2高压灭菌20分钟,培养条件为温度25-30℃,光照强度1500-2000lx,每日光照12小时条件下培养;接种后5天腋芽开始萌动,当15-20天伸长至2±0.5cm时,即可进入继代培养;
(4)继代培养:将步骤3中获得的不定芽进行继代培养,培养基为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+AD0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3.6g/L,pH5.6,MS培养基经1.1kg/cm2高压灭菌15-20分钟,培养条件为温度25-30℃,光照强度1500-2000lx,每日光照12-14小时条件下培养,培养7-10天,待丛生芽长至1.5-2cm时进行壮苗培养;
(5)壮苗培养:将继代苗切下接种至MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4g/L,pH5.6,温度、光照条件同步骤4,培养10天左右,将长至3-4cm的幼苗转至生根培养基;
(6)生根培养:将步骤5中获得的幼苗转至1/2MS01L+蔗糖30g/L+琼脂粉4g/L,pH5.6的培养基中进行生根培养,培养条件同步骤4,培养两周左右当生根条数达到6条以上,长度0.5cm以上时便可用清水将根部琼脂清洗干净进行移栽;
(7)移栽与管护:移栽基质选用黄心土,育苗棚应具有一定遮阴效果和通风条件,苗床需提前1天用0.15%KMnO4消毒,生根苗移栽后用清水淋透,以后每隔一周喷施适量800-1000倍甲基托布津,连续喷3次,20天后逐步通风,并移除遮盖物。
实施例4:
明月草组织培养快速繁殖方法:
(1)外植体的选择:春季以明月草母株上带有潜伏芽的新发枝条为外植体;
(2)外植体的消毒:剪去枝条叶片,用自来水冲洗3分钟,再用洗洁精洗涤1次,接着用自来水冲洗3-5分钟,再在超净工作台上以0.1%HgCl2溶液消毒12分钟,最后用无菌水冲洗5遍,沥干后待用;
(3)腋芽诱导培养:将消毒好的枝条切除茎尖,余下的枝条剪成每段带有1-2个腋芽的茎段,接种到诱导培养基上放进培养室进行无菌培养,培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3.6g/L,pH5.6,MS培养基经1.1kg/cm2高压灭菌20分钟,培养条件为温度25-30℃,光照强度1500-2000lx,每日光照12小时条件下培养;接种后5天腋芽开始萌动,当培养18天左右伸长至2±0.5cm时,即可进入继代培养;
(4)继代培养:将步骤3中获得的不定芽进行继代培养,培养基为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+AD0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3g/L,pH5.6,MS培养基经1.1kg/cm2高压灭菌20分钟,培养条件为温度25-30℃,光照强度1500-2000lx,每日光照12-14小时条件下培养,培养一周左右,待丛生芽长至1.5-2cm时进行壮苗培养;
(5)壮苗培养:将继代苗切下接种至MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3.6g/L,pH5.6,温度、光照条件同步骤4,培养10天左右,将长至3-4cm的幼苗转至生根培养基;
(6)生根培养:将步骤5中获得的幼苗转至1/2MS0+蔗糖30g/L+琼脂粉4g/L,pH5.6的培养基中进行生根培养,培养条件同步骤4,培养两周左右当生根条数达到6条以上,长度0.5cm以上时便可用清水将根部琼脂清洗干净进行移栽;
(7)移栽与管护:移栽基质选用黄心土,育苗棚应具有一定遮阴效果和通风条件,苗床需提前1天用0.15%KMnO4消毒,生根苗移栽后用清水淋透,以后每隔一周喷施适量1000倍多菌灵药液,连续喷4次,20天后逐步通风,并移除遮盖物。

Claims (3)

1.明月草组织培养快速繁殖培养基,其特征在于:包括腋芽诱导培养基、继代培养基、壮苗培养基和生根培养基,其中:
腋芽诱导培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8;
继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+AD0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8;
壮苗培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8;
生根培养基为1/2MS0+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8;
所述的MS0培养基成分构成如下:
(1)大量元素:KNO3 1260mg/L、NH4NO3 1320mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO4 170mg/L、FeSO4·7H2O 855.6mg/L、EDTA-2Na 37.3mg/L;
(2)微量元素:MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3PO3 6.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L;
(3)有机物:C6H12O6·2H2O(肌醇)100mg/L、NH2CH2COOH(甘氨酸)2.0mg/L、C8H11O3N·HCl(盐酸吡哆醇)0.5mg/L、NC5H4COOH(烟酸)0.5mg/L、C12H17C10S·2HCL(盐酸硫胺素)0.1mg/L。
2.明月草组织培养快速繁殖方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1,外植体的选择:春季以明月草母株上带有潜伏芽的新发枝条为外植体;
步骤2,外植体的消毒:剪去枝条叶片,用自来水冲洗2-3分钟,再用洗洁精洗涤1-2次,接着用自来水冲洗3-5分钟,再在超净工作台上以0.1%HgCl2溶液消毒8-12分钟,最后用无菌水冲洗4-5遍,沥干后待用;
步骤3,腋芽诱导培养:将消毒好的枝条切除茎尖,余下的枝条剪成每段带有1-2个腋芽的茎段,接种到腋芽诱导培养基上放进培养室进行无菌培养,腋芽诱导培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8,MS培养基经高压灭菌15-20分钟,培养条件为温度25-30℃,光照强度1500-2000lx,每日光照12小时条件下培养,接种后5天腋芽开始萌动,当15-20天伸长至2±0.5cm时,即可进入继代培养;
步骤4,继代培养:将步骤3中获得的不定芽进行继代培养,培养基为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+AD0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8,MS培养基经高压灭菌15-20分钟,培养条件为温度25-30℃,光照强度1500-2000lx,每日光照12-14小时条件下培养,培养7-10天,待丛生芽长至1.5-2cm时进行壮苗培养;
步骤5,壮苗培养:将继代苗切下接种进行壮苗培养,培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8,温度、光照条件同步骤4,培养10天,将长至3-4cm的幼苗转至生根培养;
步骤6,生根培养:将步骤5中获得的幼苗进行生根培养,培养基为1/2MS0+蔗糖30g/L+琼脂粉3-4g/L,pH5.5-5.8,培养条件同步骤4,培养两周当生根条数达到6条以上,平均根长0.5cm以上时便用清水将根部琼脂清洗干净进行移栽;
步骤7,移栽与管护:育苗棚具有一定遮阴效果和通风条件,移栽基质选用黄心土,苗床提前1天用0.15%KMnO4消毒,生根苗移栽后用清水淋透,用塑料薄膜覆盖,以后每隔一周喷施800-1000倍甲基托布津或1000倍多菌灵药液,连续喷3-4次,20天后逐步通风,并移除遮盖物;
所述的MS0培养基成分构成如下:
(1)大量元素:KNO3 1260mg/L、NH4NO3 1320mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO4 170mg/L、FeSO4·7H2O 855.6mg/L、EDTA-2Na 37.3mg/L;
(2)微量元素:MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3PO3 6.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L;
(3)有机物:C6H12O6·2H2O(肌醇)100mg/L、NH2CH2COOH(甘氨酸)2.0mg/L、C8H11O3N·HCl(盐酸吡哆醇)0.5mg/L、NC5H4COOH(烟酸)0.5mg/L、C12H17C10S·2HCL(盐酸硫胺素)0.1mg/L。
3.根据权利要求2所述的明月草组织培养快速繁殖方法,其特征在于:所述的高压灭菌,压力为1.1kg/cm2
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