CN106900555A - 阳春砂试管分株培养基及一次成苗组培分株快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了阳春砂试管分株培养基及一次成苗组培分株快繁方法，在该培养基中分株继代培养和生根诱导同步进行，一次成苗，缩短阳春砂组培苗育苗周期，有利于产业化生产。

Description

阳春砂试管分株培养基及一次成苗组培分株快繁方法

技术领域

本发明涉及植物的试管分株培养基及组培分株快繁方法，具体地说，是涉及阳春砂试管分株培养基及一次成苗组培分株快繁方法。

背景技术

砂仁是我国著名的四大南药之一，为阳春砂、绿壳砂或海南砂植物的干燥成熟果实，味辛，性温，有行气宽中、健胃消食、安胎的功能，常用于脘腹胀痛、食欲不振、呕吐、胎动不安等的治疗。药用价值很高，是生产多种中成药的原料，也常添加于日常煲汤用来保健，市场需求量较大。

阳春砂(Amomum villosum Lour.)属姜科(Zingibemceae)多年生草本植物，阳春砂常规繁殖方法可分为有性繁殖和无性繁殖。有性繁殖采用种子繁殖，无性繁殖采用分株繁殖。阳春砂种子不易贮藏，而常规的大田分株育苗繁殖率又很有限，每株每年最多能分出20多株，这限制了阳春砂的大规模种植。离体繁殖是一种大规模快速高效的繁殖方式，具有常规繁殖不可比拟的优点。采用组织培养方法能大量繁殖种苗，阳春砂组培育苗鲜有报道，阳春砂常规的组培育苗方法采用带芽根茎段诱导丛生芽，通过继代增殖和生根诱导两个步骤培育出试管苗，采用的培养基分继代培养基和生根培养基，育苗周期长，因此如能在同一种培养基中同步进行阳春砂分株继代增殖和生根诱导，一次成苗，可节省成本及缩短组培苗育苗周期，有利于产业化生产。

发明内容

本发明的目的提供一种阳春砂试管分株培养基及一次成苗组培分株快繁方法，在该培养基中分株增殖和生根诱导同步进行，一次成苗，缩短阳春砂组培育苗周期，有利于产业化生产。

本发明的技术方案如下：

一、阳春砂试管分株培养基，每升(L)中所含物质的种类和浓度如下：

本发明阳春砂试管分株培养基配制方法为：

1母液配制

1.1为便于取样，宜先配制各种母液，分为大量元素母液、微量元素母液、有机物母液和各种植物生长调节剂母液。蔗糖、琼脂不宜配成母液，需要时直接称样；

1.2大量元素母液和有机物母液的各组分浓度应与培养基的组分浓度成10-100的倍数关系，微量元素母液成200-500的倍数关系，而植物生长调节试剂母液的浓度宜配成1mg/ml；

1.3母液选用无菌的蒸馏水、去离子水或超纯水配制，大量生产时用煮沸过的水；

1.4配制大量元素母液时，每个组分应单独溶解，后按氮、钙、镁、磷的顺序逐个混合，否则容易引起沉淀；

1.5微量元素母液含有见光易分解的碘化钾和易氧化的硫酸亚铁，应用棕色瓶保存；

1.6植物生长调节剂母液和有机物母液应置于冰箱中保存；

1.7母液配制后应及时使用，贮存时间不宜超过1个月；

1.8发现母液有沉淀，或有微生物生长，或有藻类生长，应废弃不用。

2培养基配制

2.1依照培养基配方，按比例量取母液，加水定容后转至不锈钢锅等容器内；

2.2加入适量琼脂和糖，并搅拌使凝固剂充分分散，糖充分溶解；

2.3加热至刚沸腾，使凝固剂完全溶解。若采用边分装边搅拌的自动化仪器配制培养基时，可省去加热使凝固剂溶解的过程；

2.4用1.0N盐酸或1.0N氢氧化钠调整至pH至5.8-6.0；

2.5尽快将培养基分装到广口瓶中，以免培养基凝固或变稠而难以分装；

2.6分装培养基时应避免培养基粘到瓶口，一旦粘上，应擦除干净，否则容易引起污染。

3培养基消毒

3.1将分装好的培养基放入高压消毒锅内消毒；

3.2加热初期，当消毒锅消毒室的气压达0.05Mpa时，打开冷凝阀，排尽消毒室内冷空气；

3.3当消毒室内气压达到0.11Mpa、温度达121℃时，开始计时，保持温度与压力消毒15-20分钟；

3.4关闭加热电源开关，按慢排气方式排放热气，待消毒室内的气压降至大气压时打开消毒锅盖或门，取出培养基；

3.5培养基应置于空气少流动和少灰尘的干净环境冷却，否则在降温进气过程中导致霉菌孢子进入培养器皿，产生霉菌污染。或用高压高温消毒过的厚布包裹冷却。

4培养基储藏

4.1培养基应尽量现配现用。

4.2可在空气干净且不流动的环境短时间储藏培养基，但储藏超过1个月的培养基应废弃不用。

二、阳春砂一次成苗组培分株快繁方法，具体包括下列步骤：

步骤1.外植体消毒：于晴天挖取粗壮带芽根茎、剪切大部分根，留下数条1.5cm左右的根，剥去叶片，浸入加有洗洁精的水中，刷去泥尘，再用流水冲洗干净，然后在超净工作台上消毒并摇动，最后用无菌水清洗；

步骤2.芽的诱导：将已经消毒好的外植体剪切成长段，每个根茎段留数个芽或芽眼，然后斜插或平放在装有上述配制好的培养基的广口瓶中，外植体初次培养时，需全暗培养，待芽眼萌动，然后再移至见光的地方培养；

步骤3.芽的分株增殖和生根培养：当萌发的丛芽长至2-3cm左右时，从基部切成1个单芽接种在装有培养基的广口瓶中，进行芽增殖培养、生根培养，形成完整植株，将生根瓶苗直接移至室外炼苗大棚在自然散射光照培养；

步骤4.生根苗的移栽及管护：自然散射光照培养后，倒出培养基，取出小苗，用水洗净残留在根上的培养基，移栽于消毒过的苗床中，淋透水，加盖塑料薄膜拱棚及黑网，保持温度和湿度，避免阳光直射，移栽一周后，揭开部分薄膜透气，以后揭开薄膜的面积可逐渐加大，每间隔7天交替喷施杀菌剂，施叶面肥和复合肥。

本发明步骤1所述的外植体消毒，优选于晴天挖取粗壮带芽根茎、剪切大部分根，留下3条1.5cm左右的根，剥去叶片，浸入加有0.1％的洗洁精的水中，用软毛刷刷去坭尘，再用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用0.1％的氯化汞溶液消毒5-7分钟并摇动3-4次，最后用无菌水清洗4-5次。

步骤2所述的芽的诱导，优选将已经消毒好的外植体剪切成约2cm长段，每个根茎段留1-2个芽或芽眼，然后斜插或平放在装有上述配制好的培养基的广口瓶中，外植体初次培养时，需全暗培养20天左右芽眼即可开始萌动，然后再移至见光的地方培养。

步骤3所述的芽的分株增殖和生根培养，优选当萌发的丛芽长至2-3cm左右时，从基部切成1个单芽接种在装有培养基的广口瓶中，进行芽增殖培养，周期25天，连续培养3-5代，培养室温度为(26±2)℃，光照12h.d^-1，光照度2000-3000lx，待丛芽苗扩张后，延长培养时间至35天，开始出根，培养至45天后，由原来接种时的1个单芽分化出的丛芽苗，苗高4-6cm，每丛芽苗有3-6个单芽苗，平均增殖倍数达4.68，同时每株芽苗长出2-5条根，根长2-3cm，出根率达100％，形成完整植株；可根据需要，留取生根瓶苗数量的1/5，剪掉2/3的叶片和根，用刀从基部将丛芽苗分割成单芽苗，转接至培养基中继代培养，将其余生根瓶苗直接移至室外炼苗大棚在自然散射光照培养5-7天。

步骤4所述的生根苗的移栽及管护，优选自然散射光照培养7天后，倒出培养基，取出小苗，用水洗净残留在根上的培养基，移栽于经0.1％高锰酸钾消毒过的苗床中，苗床基质为黄心土：细河沙：泥炭土，体积比为7：2：1，淋透水，加盖塑料薄膜拱棚及黑网，保持温度和湿度，避免阳光直射，移栽一周后，揭开部分薄膜透气，以后揭开薄膜的面积可逐渐加大，每间隔7天交替喷施杀菌剂，施叶面肥和复合肥。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明的试管分株培养基为低浓度无机盐，加上两种植物生长调节剂组合成的一种培养基配方，既适合阳春砂组织培养芽苗分株增殖，也有利于根的生长发育，无变异现象，培养基中加入适量还原剂抗坏血酸(V_C)和L-半胱氨酸，有效抑制了培养过程中出现的褐化现象。

2、本发明的组培分株快繁方法，采用阳春砂根茎芽为外植体，进行整个植株再生无菌培养过程只需一种培养基，培养过程简单易行。组织培养分株增殖过程采用以芽繁芽方式，无变异现象，与常规的大田分株育苗相比，组织培养分株育苗增殖倍数高；生根组培苗易于分割，生根过程中无愈伤组织形成，为皮部生根，根粗壮，移栽成活率高。

3、本发明阳春砂一次成苗试管分株培养基和组培快繁方法，在该培养基中继代培养和生根诱导同步进行，一次成苗，缩短阳春砂仁组培苗育苗周期，有利于产业化生产。

4、本发明平均增殖倍数达4.68，同时每株芽苗长出2-5条根，根长2-3cm，出根率达100％，形成完整植株。10-20天成活，成活率达98％以上。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：

阳春砂试管分株培养基的配制，其中每升(L)中所含物质的种类和浓度如下：

实施例2.阳春砂一次成苗组培分株快繁方法

步骤1.外植体消毒：于晴天挖取粗壮带芽根茎、剪切大部分根，留下3条1.5cm左右的根，剥去叶片，浸入加有少许洗洁精的水中，用软毛刷刷去坭尘，再用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用0.1％的氯化汞溶液消毒6分钟并摇动数次，最后用无菌水清洗4-5次。

步骤2.芽的诱导：将已经消毒好的外植体剪切成约2cm长段，每个根茎段留1-2个芽或芽眼，然后斜插或平放在装有上述配制好的培养基的广口瓶中，外植体初次培养时，需全暗培养20天左右芽眼即可开始萌动，然后再移至见光的地方培养。

步骤3.芽的分株增殖和生根培养：当萌发的丛芽长至2-3cm左右时，从基部切成1个单芽接种在装有培养基的广口瓶中，进行芽增殖培养，周期25天，连续培养3-5代，培养室温度为(26±2)℃，光照12h.d^-1，光照度2000-3000lx，待丛芽苗扩至一定的数量时，延长培养时间至35天，开始出根，培养至45天后，由原来接种时的1个单芽分化出的丛芽苗，苗高4-6㎝，每丛芽苗有3-6个单芽苗，平均增殖倍数达4.68，同时每株芽苗长出2-5条根，根长2-3㎝，出根率达100％，形成完整植株。可根据需要，留取生根瓶苗数量的1/5，剪掉2/3的叶片和根，用刀从基部将丛芽苗分割成单芽苗，转接至培养基中继代培养。将其余生根瓶苗直接移至室外炼苗大棚在自然散射光照培养5-7天。

步骤4.生根苗的移栽及管护：自然散射光照培养7天后，倒出培养基，取出小苗，用水洗净残留在根上的培养基，移栽于经0.1％高锰酸钾消毒过的苗床中，苗床基质为黄心土：细河沙：泥炭土，体积比为7：2：1，淋透水，加盖塑料薄膜拱棚及黑网，保持一定的温度和湿度，并要避免阳光直射。移栽一周后，可揭开部分薄膜透气，以后揭开薄膜的面积可逐渐加大，每间隔7天交替喷施杀菌剂，施叶面肥和复合肥。10-20天成活，成活率达98％以上。

实施例3.

阳春砂试管分株培养基的配制，其中每升(L)中所含物质的种类和浓度如下：

实施例4.阳春砂一次成苗组培分株快繁方法

用实施例3有配制的培养基，按实施例子2的组培分株快繁方法进行阳春砂一次成苗组培分株快繁育苗，得到与实施例2相同的结果。

与目前现有技术的阳春砂组培快繁培养基及组培快繁方法相比，本发明的优点是：

与目前现有技术的阳春砂大田分株育苗方法相比，本发明的优点是：

Claims (6)

1.阳春砂试管分株培养基，其特征在于，每升(L)中所含物质的种类和浓度如下：

2.阳春砂一次成苗组培分株快繁方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

步骤1.外植体消毒：于晴天挖取粗壮带芽根茎、剪切大部分根，留下数条1.5cm的根，剥去叶片，浸入加有洗洁精的水中，刷去泥尘，再用流水冲洗干净，然后在超净工作台上消毒并摇动，最后用无菌水清洗；

步骤2.芽的诱导：将已经消毒好的外植体剪切成长段，每个根茎段留数个芽或芽眼，然后斜插或平放在装有权利要求1所述培养基的广口瓶中，外植体初次培养时，需全暗培养，待芽眼萌动，然后再移至见光的地方培养；

步骤3.芽的分株增殖和生根培养：当萌发的丛芽长至2-3cm时，从基部切成1个单芽接种在装有培养基的广口瓶中，进行芽增殖培养、生根培养，形成完整植株，将生根瓶苗直接移至室外炼苗大棚在自然散射光照培养；

步骤4.生根苗的移栽及管护：自然散射光照培养后，倒出培养基，取出小苗，用水洗净残留在根上的培养基，移栽于消毒过的苗床中，淋透水，加盖塑料薄膜拱棚及黑网，保持温度和湿度，避免阳光直射，移栽一周后，揭开部分薄膜透气，以后揭开薄膜的面积可逐渐加大，每间隔7天交替喷施杀菌剂，施叶面肥和复合肥。

3.根据权利要求2所述的阳春砂一次成苗组培分株快繁方法，其特征在于：步骤1所述的外植体消毒，是指于晴天挖取粗壮带芽根茎、剪切大部分根，留下3条1.5cm的根，剥去叶片，浸入加有0.1％的洗洁精的水中，用软毛刷刷去泥尘，再用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用0.1％的氯化汞溶液消毒5-7分钟并摇动3-4次，最后用无菌水清洗4-5次。

4.根据权利要求2所述的阳春砂一次成苗组培分株快繁方法，其特征在于：步骤2所述的芽的诱导，是将已经消毒好的外植体剪切成2cm长段，每个根茎段留1-2个芽或芽眼，然后斜插或平放在装有权利要求1所述培养基的广口瓶中，外植体初次培养时，全暗培养20天芽眼即可开始萌动，然后再移至见光的地方培养。

5.根据权利要求2所述的阳春砂一次成苗组培分株快繁方法，其特征在于：步骤3所述的芽的分株增殖和生根培养，是指当萌发的丛芽长至2-3cm左右时，从基部切成1个单芽接种在装有培养基的广口瓶中，进行芽增殖培养，周期25天，连续培养3-5代，培养室温度为(26±2)℃，光照12h.d^-1，光照度2000-3000lx，待丛芽苗扩张后，延长培养时间至35天，开始出根，培养至45天后，由原来接种时的1个单芽分化出的丛芽苗，苗高4-6cm，每丛芽苗有3-6个单芽苗，同时每株芽苗长出2-5条根，根长2-3cm，形成完整植株，根据需要，留取生根瓶苗数量的1/5，剪掉2/3的叶片和根，用刀从基部将丛芽苗分割成单芽苗，转接至培养基中继代培养，将其余生根瓶苗直接移至室外炼苗大棚在自然散射光照培养5-7天。

6.根据权利要求2所述的阳春砂一次成苗组培分株快繁方法，其特征在于：步骤4所述的生根苗的移栽及管护，是指自然散射光照培养7天后，倒出培养基，取出小苗，用水洗净残留在根上的培养基，移栽于经0.1％高锰酸钾消毒过的苗床中，苗床基质为黄心土：细河沙：泥炭土，体积比为7：2：1，淋透水，加盖塑料薄膜拱棚及黑网，保持温度和湿度，避免阳光直射，移栽一周后，揭开部分薄膜透气，以后揭开薄膜的面积可逐渐加大，每间隔7天交替喷施杀菌剂，施叶面肥和复合肥。