CN109042321A

CN109042321A - 一种阳春砂根状茎芽的愈伤组织的诱导方法

Info

Publication number: CN109042321A
Application number: CN201810897081.8A
Authority: CN
Inventors: 何国振; 李明晓; 陈树辉; 徐杰; 何卓航; 林�吉
Original assignee: Guangzhou University Of Chinese Medicine (guangzhou Institute Of Traditional Chinese Medicine)
Current assignee: Guangzhou University Of Chinese Medicine (guangzhou Institute Of Traditional Chinese Medicine); Guangzhou University of Chinese Medicine
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明提供了一种阳春砂根状茎芽的愈伤组织的诱导方法，以阳春砂的根状茎芽为外植体，经过灭菌、接种及诱导培养，得到其愈伤组织，所述诱导培养的诱导培养基为MS+0.5～2.5mg/L 6‑BA+0.1～2mg/L 2,4‑D+0.05～2mg/L NAA，培养环境的光照时间为10h，光照强度为2000Lx，培养温度为25℃。本发明使用阳春砂的根状茎芽为外植体，采用无性繁殖能保留亲本的完整药性，不易产生变异，从而使得药性稳定，能保证药物治疗的效果，而且外植体材料的获取也很容易，可随时取材进行繁殖培养。

Description

一种阳春砂根状茎芽的愈伤组织的诱导方法

技术领域

本发明涉及一种愈伤组织的诱导方法，属于组织培养技术领域。

背景技术

阳春砂(Amomum villosum Lour.)是姜科豆蔻属(Amomum Roxb.)多年生常绿草本植物，以干燥成熟的果实入药，又称为“春砂仁”，是我国著名的四大南药之一，有着1300多年的应用历史。春砂仁性温，味辛，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎等功效。阳春砂主要分布于广东、广西、云南等地，其中以广东阳春所产的砂仁药效最佳。砂仁的需求量较大，每年的需求量估计超过2.2×10⁶kg，由于阳春砂存在落果率高、产量低等问题，导致春砂仁的产量远远不能满足市场的需求，严重阻碍了春砂仁产业的发展。此外，传统的育种方法需要花费大量的人力、物力和时间，也没法改变当前阳春砂单位产量低的现状。因此，依靠科学技术培育高产优质的种源，提高当前阳春砂的产量，是当前亟不可待的研究工作。组织培养研究，是培育高产优质阳春砂种源的前期工作。

植物组织培养又叫离体培养，是指通过无菌操作把植物体的离体器官、组织、细胞甚至原生质体，在人为提供及控制的环境条件下生长和发育的所有组织培养技术的总称。通过组织培养技术，能在短时间内有效的扩大繁殖系数，从而获得大量、一致的试管苗，从而克服传统育种的缺陷。目前关于阳春砂组织培养的研究，主要有两类，一类是以阳春砂根状茎芽或生长点为外植体进行离体扩繁，没有经过愈伤组织诱导过程；另一类是以种子或种子萌发的无菌幼苗作为外植体进行愈伤组织诱导和再生。前一类工作因为没有经过愈伤组织诱导，其繁殖系数较低，且无法应用愈伤组织进行基因转化等进一步的研究。后一类工作因为用种子或种子萌发苗为外植体，而种子的获得受季节的限制，使用时间有限。

发明内容

为此，本发明以阳春砂大田植株根状茎芽为外植体材料，进行愈伤组织的诱导，建立阳春砂愈伤组织诱导体系，获得愈伤组织，再经组织培养扩大阳春砂繁殖。阳春砂大田植株根状茎芽数量多、容易获得，因此本发明不受时间的限制。

本发明的目的在于提供一种通过组织培养手段培养出阳春砂根状茎芽的愈伤组织，为分化为阳春砂完整植株提供基础。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种阳春砂根状茎芽的愈伤组织的诱导方法，以阳春砂根状茎芽作为外植体，经过灭菌、接种、及诱导培养，得到阳春砂根状茎芽愈伤组织；所述的诱导培养使用的诱导培养基为MS+0.5～2.5mg/L 6-BA+0.1～2.0mg/L 2,4-D+0.05～2.0mg/L NAA。即：在每一升的MS培养基(配制方法见表1)中添加0.5～2.5mg/L 6-BA、0.1～2.0mg/L 2,4-D和0.05～2.0mg/L NAA。

表1：MS培养基母液配制方法

上述的MS为MS培养基，BA为6-苄氨基腺嘌呤，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，NAA为萘乙酸。

优选地，所述诱导培养基为MS+1.0～2.0mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L 2,4-D+0.1～1.0mg/L NAA。

优选地，所述诱导培养基为MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L NAA。

进一步地，所述以阳春砂根状茎芽作为外植体的方法为：首先将阳春砂根状茎芽切成3～5cm的小段，沿中轴面纵切成大小相似的两瓣，在无菌的条件下进行接种，每瓶培养基接种15～20块外植体。

进一步地，所述的诱导培养的温度为22℃～25℃，空气相对湿度为50～80％。

进一步地，所述诱导培养的光照条件为：10～20小时光照，光照强度为1500～2000Lx。

优选地，所述光照强度为2000Lx。

进一步地，所述阳春砂根状茎芽作为外植体的诱导培养的周期为30～50天。

优选地，所述诱导培养的周期为30天。

本发明的有益效果在于：本发明以阳春砂根状茎芽作为外植体，进行愈伤组织诱导，丰富了外植体材料的来源。以往一般采用种子或种子萌发的无菌幼苗作为外植体，但由于种子是有性繁殖，通过母本和父本的杂交，遗传性状容易发生变异，难以保证其对亲本的性状完整的遗传，因此，经常出现药材失效的现象，而本发明采用的无性繁殖能保留亲本的完整药性，不易产生变异，从而使得药性稳定，能保证药物治疗的效果，这对中药材来说是很重要的因素。且利用种子或种子萌发的无菌幼苗作为外植体进行组织培养，因种子的获得受季节的限制，所以有一定的局限性，而本发明在外植体材料使用方面，将不再受季节和环境条件的限制，而且外植体材料的获取也很容易，可随时取材进行繁殖培养。

附图说明

图1为本发明所采用的阳春砂根状茎芽图片。

图2为本发明实施例1阳春砂根状茎芽愈伤组织诱导的效果图片。

图3为本发明实施例2阳春砂根状茎芽愈伤组织诱导的效果图片。

图4为本发明实施例3阳春砂根状茎芽愈伤组织诱导的效果图片。

图5为本发明实施例4阳春砂根状茎芽愈伤组织诱导的效果图片。

图6为本发明实施例5阳春砂根状茎芽愈伤组织诱导的效果图片。

图7为本发明对比例1阳春砂根状茎芽愈伤组织诱导的效果图片。

图8为本发明对比例2阳春砂根状茎芽愈伤组织诱导的效果图片。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例以及附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

一种阳春砂根状茎芽的愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

选取健康的大田栽培的阳春砂根状茎芽，将阳春砂根状茎芽经过无菌操作、消毒后，切取约3cm的小段，沿中轴面纵切成大小相似的两瓣，然后横放接种于已配制并经过消毒灭菌好的培养基中进行培养，接种20瓶，每3天进行观察、记录。通过培养筛选生长良好的愈伤组织，并对成功诱导出的愈伤组织进行继代培养，30天继代一次。

其中培养的环境条件为：温度：22℃；空气相对湿度：50％；光照控制为10小时光照，光照强度为1500Lx。

培养基配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+0.05mg/L NAA

实施例2

其中培养的环境条件为：温度：25℃；空气相对湿度：80％；光照控制为15小时光照，光照强度为2000Lx。

培养基配方为：MS+2.5mg/L 6-BA+2.0mg/L 2,4-D+2.0mg/L NAA

实施例3

其中培养的环境条件为：温度：22℃；空气相对湿度：80％；光照控制为15小时光照，光照强度为1800Lx。

培养基配方为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA

实施例4

培养基配方为：MS+2.0mg/L 6-BA+1.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L NAA

实施例5

其中培养的环境条件为：温度：25℃；空气相对湿度：60％；光照控制为10小时光照，光照强度为2000Lx。

培养基配方为：MS+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L NAA

对比例1

培养基配方为：MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D

对比例2

培养基配方为：MS+6-1.0mg/L BA+1.0mg/L NAA

将上述实施例1-5与对比例1-2的诱导效果进行对比，其培养基配方与环境条件如表2所示：

表2：实施例1-5与对比例1-2的培养基配方与环境条件

项目	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	对比例1	对比例2
								MS(mL)	5	5	5	5	5	5	5
6-BA(mg/L)	0.5	2.5	1.0	2	1.5	1.0	1.0
								2,4-D(mg/L)	0.1	2	0.5	1.5	1.0	1.0	——
NAA(mg/L)	0.05	2	0.1	1	0.5	——	1.0
								温度	22℃	25℃	22℃	25℃	25℃	25℃	25℃
湿度	50％	80	80	80	60	60	60
								光照时间(h)	10	15	15	20	10	10	10
光照强度(Lx)	1500	2000	1800	2000	2000	2000	2000

上述实施例1-5与对比例1、2的诱导效果结果如表2所示：

表3：实施例1-5与对比例1、2的诱导效果结果

组别

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

实施例5

对比例1

对比例2

诱导率

10％

9％

10％

15％

0

由表3可知，本发明实施例1-5的诱导方法均能诱导出阳春砂根状茎芽的愈伤组织，且实施例5的方法诱导率最高，因此，实施例5为本发明的最佳实施例。而对比例1、2的愈伤组织诱导培养基中均缺少本发明诱导培养基中的某些成分，其均不能诱导出愈伤组织，说明本发明的诱导方法并不是通过各组分的简单组合得到，再进一步说明了本发明诱导培养基配方各组合与诱导培养的环境条件之间存在协同作用。

将本发明的阳春砂根状茎芽的愈伤组织的诱导培养基与其他诱导培养基1、2进行比较(环境培养条件相同：温度25℃；光照时间10h；光照强度：2000Lx；空气湿度：80％)，其配方见下表：

表4：本发明实施例5诱导培养基与其他诱导培养基1、2的配方及各组分含量

组份	实施例5	诱导培养基1	诱导培养基2
				MS(mL)	5	5	5
6-BA(mg/L)	1.5	2.0	1.0
				2,4-D(mg/L)	1.0	0.5	0.5
NAA(mg/L)	0.5	——	0.5
				AgNO<sub>3</sub>	——	6.0	6.0
酸水解酪蛋白	——	1.0	——

本发明实施例5诱导培养基与其他诱导培养基1、2的诱导结果如下：

表5：本发明实施例5诱导培养基与其他诱导培养基1、2的诱导结果

组别	实施例5	诱导培养基1	诱导培养基2
				诱导率	15％	5％	8％

由表5可知，本发明的诱导培养基的诱导效果较好，诱导率最高，诱导培养基1是用于诱导种子愈伤组织，诱导培养基2是用于诱导通过种子萌发的无菌苗的愈伤组织，由于本发明采用的外植体与前两者不同，植物不同部位和器官的外植体所需营养物质和诱导条件不同，因此需要研发出不同的诱导方法，从而提高诱导率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种阳春砂根状茎芽的愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：以阳春砂根状茎芽作为外植体，经过灭菌、接种和诱导培养，得到阳春砂根状茎芽愈伤组织；所述的诱导培养所使用的诱导培养基为MS+0.5～2.5mg/L 6-BA+0.1～2.0mg/L 2,4-D+0.05～2.0mg/L NAA。

2.如权利要求1所述的阳春砂根状茎芽愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基为MS+1.0～2.0mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L2,4-D+0.1～1.0mg/L NAA。

3.如权利要求1所述的阳春砂根状茎芽愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基为MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L NAA。

4.如权利要求1所述的阳春砂根状茎芽愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述以阳春砂根状茎芽作为外植体的方法为：首先将阳春砂根状茎芽切成3～5cm的小段，沿中轴面纵切成大小相似的两瓣，在无菌的条件下进行接种，每瓶培养基接种15～20块外植体。

5.如权利要求1所述的阳春砂根状茎芽愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述的诱导培养的温度为22℃～25℃，空气相对湿度为50～80％。

6.如权利要求1所述的阳春砂根状茎芽愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养的光照条件为：10～20小时光照，光照强度为1500～2000Lx。

7.如权利要求6所述的阳春砂根状茎芽愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述光照强度为2000Lx。

8.如权利要求1所述的阳春砂根状茎芽愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述阳春砂根状茎芽作为外植体的诱导培养的周期为30～50天。

9.如权利要求8所述的阳春砂根状茎芽愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养的周期为30天。