CN103651146B - 一种生产蕲山药试管微块茎的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产蕲山药试管微块茎的方法，其步骤: a、蕲山药试管苗的准备：取蕲山药顶端的幼嫩茎段，剪成带节茎段，在超净工作台上消毒后将茎段切成小段，将切好的材料放置培养基中；在光照条件下培养，获得初始无菌试管苗；b、蕲山药试管苗的扩繁：将无菌试管苗茎段切成小段，置于培养基中；在光照条件下培养，获得试管苗；c、蕲山药试管微块茎的培养：将试管苗置于培养基中；在光照条件下培养，获得试管微块茎；d、蕲山药试管微块茎的收获。本发明的微块茎形成率高，达到了97.50%；方法易行，操作方便，缩短了生产周期，提高了生产效率，降低了生产成本，能快速培育出大量蕲山药试管微块茎，满足了规模化种植的需求。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，更具体涉及一种高效生产蕲山药试管微块茎的方法，适用于快速繁育蕲山药脱毒种药。
背景技术
山药是百合目(Liliales)薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(DioscoreaL.)薯蓣(Dioscorea opposita Thunb.)及其近缘种植物地下块茎的总称，为1年生或多年生、具双子叶植物特征特性的单子叶缠绕性藤本植物。山药富含淀粉、多糖、黏液蛋白、矿物质及其他营养物质，是一种食、药兼用的经济作物。中国、美国、英国和日本等国家均将山药列入药典。山药气味平和，温补而不骤，微香而不燥，是中医常用的一味健脾补气良药，其药理作用主要集中在抗氧化、抗衰老、降血糖、肝损伤保护、免疫调节等方面。
‘蕲山药’是以蕲春县为主的鄂东山区大面积种植的优良地方山药，其食用品质和药用品质均较佳。康薇等总结了‘蕲山药’的优质丰产栽培技术。但多年来生产上单一的营养繁殖，导致‘蕲山药’主产区病害积累、产量下降、品质退化，挫伤了农民种植山药的积极性，给‘蕲山药’种植业带来了严重的挑战。通过组织培养获得脱毒种药是解决这一问题的有效途径。
关于山药的组织培养与脱毒快繁等方面，国内外均有相关学者进行了一些研究。在国内，李明军等研究了基因型、外植体、植物激素和光暗等因子对山药愈伤组织诱导的影响，认为叶片、茎段、零余子的最佳激素配比均为6-BA 2 mg/L+ NAA 2 mg/L，暗培养有利于零余子的诱导、光培养有利于叶片的诱导；王红娟等以怀山药茎蔓、余零子、块茎为外植体，研究不同激素配比对怀山药不同外植体诱导不定芽的影响。国际上，Hamadina等研究认为，ABA和GA等植物生长调节剂对山药试管微块茎的形成与休眠具有重要影响；Nagasawa研究认为，采用附加2,4-D的MS液体培养基悬浮培养，可以获得基于胚性细胞的山药植株再生体系。已有专利“一种山药茎段直接诱导微型块茎的方法”（专利申请号：CN201310041625.8）主要采用液体悬浮培养的方法获得微型块茎。已有专利“蕲山药脱毒微型种豆的繁育方法”（专利申请号：CN201310105623.0）主要采用扦插获得微型种豆。但关于‘蕲山药’通过固体培养基高效形成试管微块茎的方法尚未见报道，本发明的目的是建立‘蕲山药’离体高效形成试管微块茎的方法，通过试管微块茎的快速繁殖来解决生产上‘蕲山药’脱毒种药生产周期长、供不应求的问题，并保持品种的基因稳定性。本发明的微块茎形成率高，达到了97.50%；其60天微块茎质量达到了0.18 g，且耐储存。本发明形成的试管微块茎在种质离体保存方面具有突出优势，试管微块茎对移栽的温度、湿度、土壤环境等条件要求不高，可以在短时间内快速获取大量的‘蕲山药’试管微块茎，对生产上‘蕲山药’优质种源的繁殖具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种高效生产蕲山药试管微块茎的方法，此方法简便易行，操作方便，缩短生产周期，提高生产效率，降低生产成本。采用此种方法能快速培育出大量蕲山药试管微块茎，满足了规模化种植的需求。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种高效生产蕲山药试管微块茎的方法，其步骤是:
a、蕲山药试管苗的准备：取‘蕲山药’顶端约10cm长的幼嫩茎段，剪成2.5-3.5 cm的带节茎段，在超净工作台上常规消毒后将茎段切成0.8-1.2 cm仅带1个节的小段，将切好的材料放置于MS+ BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7.5 g/L，pH 5.6－6.0的培养基中；在24-32℃、1000~1500 lx、16 h/d的光照条件下培养2周，获得初始无菌试管苗。
b、蕲山药试管苗的扩繁：将无菌试管苗茎段切成0.8-1.2cm仅带1个节的小段，置于MS+ BA 0.1-0.2 mg/L+ NAA 0.01-0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7.5 g/L，pH 5.6－6.0的培养基中；在24-32℃、1000~1500 lx、16 h/d的光照条件下培养2周，快速获得大量试管苗。
c、蕲山药试管微块茎的培养：将试管苗置于MS+ BA0.1- 0.5 mg/L+NAA 0.01-0.05 mg/L+蔗糖30-90 g/L+7.5 g/L琼脂，pH5.6－6.0的培养基中；在24-32℃、1000~1500 lx、16 h/d的光照条件下培养2-8周，可获得高频率的试管微块茎。
d、蕲山药试管微块茎的收获：形成的试管微块茎，可立即移栽，也可在瓶中保存0-12个月，均保持良好的活力。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明的微块茎形成率高，达到了97.50%；其60天微块茎质量达到了0.18 g，且耐储存。本发明形成的试管微块茎在种质离体保存方面具有突出优势，试管微块茎对移栽的温度、湿度、土壤环境等条件要求不高，可以在短时间内快速获取大量的‘蕲山药’试管微块茎，对生产上‘蕲山药’优质种源的繁殖具有重要意义。
表1 本发明与现有技术的比较表
| 不同方法 | 方法操作的难易程度 | 形成微块茎所需时间 | 微块茎形成率 | 微块茎状态 | 微块茎移栽成活率 |
| 茎段扦插法 | 较难，环节多，不同环节对温度、湿度有严格要求，需浇营养液。 | 60天 | 71.5% | 较好 | 92.8% |
| 液体悬浮培养法 | 需要摇床振荡，液体悬浮培养污染几率高。 | 45天 | 100% | 水质状，较差 | 74.5% |
| 本发明技术 | 操作简单，易掌握。 | 42天 | 97.5% | 好 | 100% |
附图说明
图1为一种茎节不定芽诱导示意图。
图2为一种不定芽增殖示意图。
图3为一种植株生根示意图。
图4为一种瓶中形成试管微块茎示意图。
图5为一种洗净的试管微块茎示意图。
图6为一种60天微块茎大小示意图。
图7为一种120天微块茎大小示意图。
图8为一种试管微块茎种植当年形成的植株示意图。
具体实施方式
实施例1:
一种高效生产蕲山药试管微块茎的方法，其步骤是:
a、蕲山药试管苗的准备：取‘蕲山药’顶端约10 cm长的幼嫩茎段，剪成2.5或3.0或3.5 cm的带节茎段，在超净工作台上常规消毒后将茎段切成0.8或1.0或1.2 cm仅带1个节的小段，将切好的材料放置于MS+ BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7.5 g/L，pH 5.6或5.8或6.0的培养基中；在24或26或28或30或32℃、1000~1500 lx、16 h/d的光照条件下培养2周，获得初始无菌试管苗。
b、蕲山药试管苗的扩繁：将无菌试管苗茎段切成0.8或1.0或1.2 cm仅带1个节的小段，置于MS+ BA 0.1或0.2 mg/L+ NAA 0.01或0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7.5 g/L，pH 5.6或5.8或6.0的培养基中；在24或26或28或30或32℃、1000~1500 lx、16 h/d的光照条件下培养2周，快速获得大量试管苗。
c、蕲山药试管微块茎的培养：将试管苗置于MS+ BA0.1或0.3或0.5 mg/L+NAA 0.01或0.03或0.05 mg/L+蔗糖30或60或90 g/L+7.5 g/L琼脂，pH5.6或5.8或6.0的培养基中；在24或26或28或30或32℃、1000~1500 lx、16 h/d的光照条件下培养2或4或6或8周，可获得高频率的试管微块茎。
d、蕲山药试管微块茎的收获：形成的试管微块茎，可立即移栽，也可在瓶中保存0或3或6或9或12个月，均保持良好的活力。
通过上述方法，微块茎形成率高，达到了97.50%；其60天微块茎质量达到了0.18 g；且微块茎状态好，形成的试管微块茎无论是立即移栽还是在瓶中保存 12个月后再移栽，移栽成活率均保持在100%。
Claims (2)
1.一种生产蕲山药试管微块茎的培养基，其特征在于，包括用于获得初始无菌试管苗的培养基MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，用于试管苗扩繁的培养基MS+BA 0.1-0.2mg/L+NAA 0.01-0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，以及用于试管微块茎培养的培养基MS+BA0.1-0.5mg/L+NAA 0.01-0.05mg/L+蔗糖30-90g/L+7.5g/L琼脂，上述培养基的pH均为5.6-6.0。
2.一种生产蕲山药试管微块茎的方法，其步骤是：
a、蕲山药试管苗的准备：取蕲山药顶端10cm长的幼嫩茎段，剪成2.5-3.5cm的带节茎段，在超净工作台上常规消毒后将茎段切成0.8-1.2cm仅带1个节的小段，将切好的材料放置于权利要求1的获得初始无菌试管苗的培养基中；在28-32℃、1000lx、16h/d的光照条件下培养2周，获得初始无菌试管苗；
b、蕲山药试管苗的扩繁：将无菌试管苗茎段切成0.8-1.2cm仅带1个节的小段，置于权利要求1的试管苗扩繁的培养基中；在28-32℃、1000lx、16h/d的光照条件下培养2周，获得试管苗；
c、蕲山药试管微块茎的培养：将试管苗置于权利要求1的试管微块茎培养的培养基中；在28-32℃、1000lx、16h/d的光照条件下培养2-8周，获得试管微块茎；
d、蕲山药试管微块茎的收获：形成的试管微块茎，移栽。
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