CN103026968B - 一种铁皮石斛种苗工厂化生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛种苗工厂化生产方法，包括外植体的选取、预处理和消毒；侧芽萌发；原球茎诱导；继代培养；原球茎分化培养；壮苗生根培养、瓶苗移栽等步骤，每个步骤中再利用特殊配制的培养基进行培育。本发明的有益效果是：外植体取材容易且消毒效率高、增殖系数高且稳定、培养基成分独特且简洁实用、繁殖周期短且生产成本低，生产出的种苗遗传性状稳定、粗壮整齐、生长势强。
Description
技术领域
本发明涉及一种铁皮石斛种苗工厂化生产方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是我国传统名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津、润肺明目、抗癌防老等功效。由于生态破坏与过度开采，野生铁皮石斛已濒临灭绝，其市场价格越来越贵，被誉为“植物熊猫”、“植物黄金”；1987年国务院把铁皮石斛列为重点保护对象。进入新世纪以来，随着铁皮石斛栽培技术的突破，产业得到了快速的发展，全国铁皮石斛现有种植面积突破3万亩，产值30亿元，成为我国产销量最大、发展最快的中药材之一。
铁皮石斛种子内不含胚乳，自然条件下很难萌发，发芽率极低，且传统的无性繁殖方式繁殖系数低，故自身的种子繁殖和营养繁殖均难以满足大量生产的需要。因此，许多机构和学者对铁皮石斛的种子无菌播种和组织培养进行了研究，但目前真正能够用于商品化生产的技术却很少，产业化生产广泛存在种苗生产周期长、生产成本高、繁殖系数低、质量参差不齐等问题，导致大规模工厂化生产种苗的效率低下、经济效益不佳。同时，目前行业种苗生产基本都采用种子无菌播种方式，该方法存在种苗变异性大、性状表现不一致、种苗品质退化快、经几代继代增殖后老化现象严重等问题，导致种苗质量差且优质种质难以保存。
利用茎段作为外植体进行铁皮石斛种苗组织培养，具有取材容易、繁殖周期短、保持母体优良性状以及形成的新植株健壮易于移栽等优点，对于优质种苗的商品化生产和种质资源的保护具有重要意义。但众多研究结果表明，铁皮石斛茎段组织培养中仍然存在一些问题，如铁皮石斛原球茎诱导培养中所加入的添加物及其浓度对原球茎的影响，虽然铁皮石斛的繁殖系数有较大的提高，但组织培养中原球茎增殖的稳定性不强，试验结果重复性不十分理想等。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中铁皮石斛组培时原球茎增殖稳定性不强的缺陷，提供一种铁皮石斛种苗工厂化生产方法来解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种铁皮石斛种苗工厂化生产方法，包括如下步骤：
A、外植体的选取、预处理及消毒；
B、侧芽萌发；
C、切取B步骤中所萌发的幼苗的带芽茎段，去叶后作为外植体，在诱导培养基中进行原球茎诱导培养；
D、将经C步骤诱导培养过的原球茎转移到继代增殖培养基中进行继代培养；
E、将经D步骤继代培养产生的原球茎团转接到分化培养基中进行原球茎分化培养；
F、将E步骤中经原球茎分化培养产生的无根小苗转接到壮苗生根培养基中进行壮苗生根培养；
G、将F步骤中经壮苗生根培养产生的试管苗进行炼苗，然后采用穴盘育苗技术进行移栽；
其中，所述诱导培养基的成分组成为：1/2MS、1~2mg/L的6-BA、15~25g/L的蔗糖、10~15%体积分数的椰汁和5~7g琼脂；
所述继代增殖培养基的成分组成为：1/2MS、20~25g/L的蔗糖、10~15%体积分数的椰汁和5~7g琼脂，椰汁可以有效防止组织褐化，从而促进原球茎的增殖。在原球茎增殖培养中，还应注意原球茎切块的大小，以及其表现出的一定的群体效应。
所述原球茎分化培养基的成分组成为：1/2MS、20~25g/L的蔗糖、10~15%体积分数的椰汁和5~7g琼脂，铁皮石斛原球茎的分化相对容易，椰汁同样有促进原球茎分化的作用，因此原球茎在继代增殖培养基上就可以分化，且效果良好，这样可减少组培环节，降低成本，提高效率。
所述壮苗生根培养基的成分组成为：1/2MS、15~25g/L的蔗糖、10~15%体积分数的椰汁、5~7g琼脂和0.2~0.5g/L的活性炭，在培养基内加入一定浓度的活性炭有助于根系的形成；加入椰汁能明显的促进试管苗的生长和根系的形成，出产的种苗粗壮、整齐。
本发明中，所述的A步骤具体为：在5~10月，从生长旺盛、无病害的野生雁荡种或“牧歌1号”（杂交品系）优选个体植株上剪取一年生茎、去叶，以茎节为中心切成段，茎节的上下各留0.8~1.5cm，流水冲洗10~20min，在超净工作台上用65~75%的乙醇消毒30~40s后，再用0.1%的HgCl2浸泡灭菌5~10min，用无菌水冲洗3~5遍，用无菌滤纸吸干水分；用解剖刀剖去腋芽苞叶，再用0.1%的HgCl2浸泡灭菌5~10min，无菌水冲洗3~5遍，制备出茎段。
“牧歌1号”杂交品系的铁皮石斛性状为软脚，茎秆青紫红色，茎粗8~10mm，肉质，纤维含量少；节间2~3cm，具明显环状铁青的黑节性状；叶二列，互生，长圆状披针形，叶鞘常具紫斑；总状花序从茎顶部发出，花3~4朵，萼片及花瓣黄绿色。该品系抗病性和抗寒性强，具有良好的分蘖性能；采收期内其有效成分可溶性多糖含量在35~40%之间，远超2010版国家药典标准。由于纤维含量低，口感良好，嚼之有黏滑感，较适宜鲜食；采用现代温室设施栽培，亩产可达600公斤以上。
本发明中，所述的B步骤具体为：在A步骤中制备出的茎段两端各切去0.5cm，接种到培养基上培养，设置培养条件为温度25℃、光照时间为12h、光照强度为2000lx。
本发明中，所述的D步骤需在C步骤进行30天开始。
本发明中，所述的F步骤需在E步骤中培养出的无根苗长高到2~3cm时开始。
本发明中，所述的F步骤中，培养条件设置为温度24~26℃、光强度1500~2500lx、光照12小时/天、空气湿度50~60%。
本发明中，所述的G步骤具体为：在F步骤中培养出的试管苗长高至8~10cm后，直接转移至智能温室中炼苗10~15天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，最后进行穴盘育苗。
本发明中，所述的原球茎诱导培养基中的椰汁在使用前需进行过滤静置，椰汁需经过滤静置，加入椰汁能明显提高原球茎的诱导率，不用加NAA等生长素即可得到较高的诱导率，尽可能减少激素使用。
本发明中，所述的穴盘育苗技术中，穴盘选用聚苯乙烯50孔穴盘（52cm×26cm），基质配方为泥炭和珍珠岩按1:1的体积比复配，移栽环境设置为温度20~30℃、空气相对湿度80~90%、光照2000~4000lx，因为适合铁皮石斛穴盘苗生长的基质应具备保肥能力强、透水性好、透气性佳、容重较小，成本低等特点，基质中的液态含量在40%以上，气体含量保持在20%-30%。
整个组培过程中，组培室按10万级洁净度设计，采用初效、中效、高效空气过滤器三级过滤，经风管由顶部送风，下部两侧回风的空气洁净系统。不仅能够保证组培室内相对洁净的环境，减少污染，而且能控制培养室内空气流动方式和速度，提高了环境因子的控制水平。同时可实现组培室内温度、光照、相对湿度、CO2浓度等环境因子的综合控制。环境的洁净及精确调控能力结合组培工艺流程的优化，可使生产种苗的质量更加稳定、整齐，而且污染率可降到1‰以下，大大降低了生产成本。
在穴盘育苗过程中，选用智能温室作为铁皮石斛穴盘育苗的培养场所，这种智能温室具有加温系统、降温系统、遮阴系统、苗床系统、灌溉系统以及自动控制系统，其控制系统具备多功能处理性能，能够根据综合信息决定对温、光、CO2、相对湿度及其他因子的控制，以提供铁皮石斛穴盘苗生长的最佳条件。
本发明的优点是：采用该技术，移栽成活率可高达99%以上，且种苗健壮、生长快速。
本发明所提供的方法具有外植体取材容易且消毒效率高、增殖系数高且稳定、培养基成分独特且简洁实用、繁殖周期短且生产成本低，生产出的种苗遗传性状稳定、粗壮整齐、生长势强，品质一流；组培室采用洁净室设计，环控能力强，污染率可降至1‰以下；瓶苗移栽采用先进的穴盘育苗技术，其成活率高达99%以上，且种苗健壮、生长快速。
该发明建立了一整套优质种苗工厂化高效生产体系，已成功进行产业化，并取得良好的经济效益。
本发明研究结果为尽快推动铁皮石斛种苗的标准化、规范化、规模化生产，提供了科学依据和有力保证。本发明对于优质种苗的商品化生产、杂交品种（系）的优势利用以及野生种质资源的保护具有重要意义。因此具有良好的社会效益、经济效益和生态效益。
具体实施方式
为使对本发明的技术特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例配合详细的说明，说明如下：
实施例1
1、材料：野生雁荡种铁皮石斛。
2、外植体选取、预处理及消毒方法：在5~10月，从生长旺盛、无病害的野生雁荡种植株上剪取一年生茎，去叶，以茎节为中心切成段，节的上下各留1cm；流水冲洗15分钟，在超净工作台上用75%乙醇消毒30秒后，再用0.1%HgCl2（加2~3滴吐温-20）浸泡灭菌6分钟，无菌水冲洗3遍，无菌滤纸吸干水分。用解剖刀剥去腋芽苞叶，再放入0.1%HgCl2（加2~3滴吐温-20）中浸泡灭菌6分钟，无菌水冲洗3遍。
3、无菌体系的建立：将上述茎段，切去两端各0.5cm，并接种到MS固体培养基上培养，培养条件为温度25℃，光照时间12h，光照强度2000lx。建立铁皮石斛的无菌体系时应注意合适的pH值范围在5.6~5.8之间以及接种时应注意摆放的方向以适应外植体自身的极性特点。
4、原球茎诱导：切取无菌体系幼苗的带芽茎段，去叶后作为外植体，进行原球茎的诱导培养。诱导培养基为：1/2MS+6-BA1.0mg/L+蔗糖15g/L+椰汁10%（v/v）+琼脂5g，pH5.6。培养35左右有原球茎形成。
5、继代增殖：培养30天左右，将原球茎转移到继代增殖培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+椰汁10%（v/v）+琼脂5g，pH5.6。原球茎切块大小约为0.5cm。一般30天左右为一个继代周期。
6、原球茎分化培养：增殖至一定代数后接种到原球茎分化培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+椰汁10%（v/v）+琼脂5g，pH5.6。一般35天左右可长成2~3cm高的无根小苗。
7、壮苗生根培养：当无根苗高2~3cm时，转接到壮苗生根培养基上培养。壮苗生根培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+椰汁10%（v/v）+琼脂5g+活性炭0.2~0.5g/L，pH5.6。每瓶（兰花瓶）接种35株，接种6周后植株平均根数4.6条，平均株高8.2cm，平均鲜重2.8g。
8、培养条件：培养温度25±1℃，光强度1500~2500lx，光照12小时/天，空气湿度50~60%。
9、瓶苗移栽：当壮苗培养6周，试管苗能长至8~10厘米高，转移到智能温室中炼苗10~15天后，将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移栽采用穴盘育苗技术。选用PS（聚苯乙烯）50孔穴盘（52cm×26cm）；育苗基质采用泥炭+珍珠岩（1：1）；移栽环境为：温度20-30℃，空气相对湿度80-90%，光照：2000-4000lux。采用该技术，移栽成活率可高达99%以上，且种苗健壮、生长快速。
实施例2
取“牧歌1号”（杂交品系）优选个体的茎段作为外植体。基本操作方法同实施例1一致。但其原球茎诱导培养基为：1/2MS+6-BA2.0mg/L+蔗糖15g/L+椰汁10%（v/v）+琼脂5g，pH5.6；原球茎继代增殖培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+椰汁10%（v/v）+琼脂5g，pH5.6；原球茎分化培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+椰汁10%（v/v）+琼脂5g，pH5.6；壮苗生根培养基为：1/2MS+蔗糖20g/L+椰汁10%（v/v）+琼脂5g+活性炭0.2~0.5g/L，pH5.6。壮苗生根培养40天后统计平均根数5.1条，平均植株高8.9厘米，平均鲜重达3.2克。瓶苗移栽的成活率可达99.5%以上。
整个组培过程中，组培室按10万级洁净度设计，采用初效、中效、高效空气过滤器三级过滤，经风管由顶部送风，下部两侧回风的空气洁净系统。不仅能够保证组培室内相对洁净的环境，减少污染，而且能控制培养室内空气流动方式和速度，提高了环境因子的控制水平。同时可实现组培室内温度、光照、相对湿度、CO2浓度等环境因子的综合控制。环境的洁净及精确调控能力结合组培工艺流程的优化，可使生产种苗的质量更加稳定、整齐，而且污染率可降到1‰以下，大大降低了生产成本。
在穴盘育苗过程中，选用智能温室作为铁皮石斛穴盘育苗的培养场所，这种智能温室具有加温系统、降温系统、遮阴系统、苗床系统、灌溉系统以及自动控制系统，其控制系统具备多功能处理性能，能够根据综合信息决定对温、光、CO2、相对湿度及其他因子的控制，以提供铁皮石斛穴盘苗生长的最佳条件。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (1)
1.一种铁皮石斛种苗工厂化生产方法，包括如下步骤：
A、外植体的选取、预处理及消毒；其中所述的A步骤具体为：在5～10月，从铁皮石斛植株上剪取一年生茎、去叶，以茎节为中心切成段，茎节的上下各留0.8～1.5cm，流水冲洗10～20min，在超净工作台上用65～75％的乙醇消毒30～40s后，再用0.1％的HgCl2浸泡灭菌5～10min，用无菌水冲洗3～5遍，用无菌滤纸吸干水分；用解剖刀剖去腋芽苞叶，再用0.1％的HgCl2浸泡灭菌5～10min，无菌水冲洗3～5遍，制备出茎段；
B、侧芽萌发；其中所述的B步骤具体为：在A步骤中制备出的茎段两端各切去0.5cm，接种到培养基上培养，设置培养条件为温度25℃、光照时间为12h、光照强度为2000lx；
C、切取B步骤中所萌发的幼苗的带芽茎段，去叶后作为外植体，在诱导培养基中进行原球茎诱导培养；
D、将经C步骤诱导培养过的原球茎转移到继代增殖培养基中进行继代培养；其中所述的D步骤需在C步骤进行30天开始；
E、将经D步骤继代培养产生的原球茎团转接到分化培养基中进行原球茎分化培养；其中所述的F步骤需在E步骤中培养出的无根苗长高到2～3cm时开始；
F、将E步骤中经原球茎分化培养产生的无根小苗转接到壮苗生根培养基中进行壮苗生根培养；其中所述的F步骤中，培养条件设置为温度24～26℃、光强度1500～2500lx、光照12小时/天、空气湿度50～60％；
G、在F步骤中培养出的试管苗长高至8～10cm后，直接转移至智能温室中炼苗10～15天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，最后进行穴盘育苗；其中所述的穴盘育苗技术中，穴盘选用聚苯乙烯50孔穴盘，基质配方为泥炭和珍珠岩按1:1的体积比复配，移栽环境设置为温度20～30℃、空气相对湿度80～90％、光照2000～4000lx；
其中，所述诱导培养基的成分组成为：1/2MS、1～2mg/L的6-BA、15～25g/L的蔗糖、10～15％体积分数的椰汁和5～7g琼脂；其中所述的茎诱导培养基中的椰汁在使用前需进行过滤静置；
所述继代增殖培养基的成分组成为：1/2MS、20～25g/L的蔗糖、10～15％体积分数的椰汁和5～7g琼脂；
所述原球茎分化培养基的成分组成为：1/2MS、20～25g/L的蔗糖、10～15％体积分数的椰汁和5～7g琼脂；
所述壮苗生根培养基的成分组成为：1/2MS、15～25g/L的蔗糖、10～15％体积分数的椰汁、5～7g琼脂和0.2～0.5g/L的活性炭。
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