CN105918129B

CN105918129B - 一种月光枣的组培快繁方法

Info

Publication number: CN105918129B
Application number: CN201610348276.8A
Authority: CN
Inventors: 雷军强; 韦颖婷; 覃稳梅; 李玉秋; 莫晓君; 韦倩梅
Original assignee: XIANGZHOU COUNTY SCIENCE AND TECHNOLOGY BUREAU
Current assignee: XIANGZHOU COUNTY SCIENCE AND TECHNOLOGY BUREAU
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2016-05-24
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-05-24
Also published as: CN105918129A

Abstract

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种月光枣的组培快繁方法，包括外植体的建立、启动培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽等步骤，本发明针对月光枣这一品种进行研究，于不同阶段采用了最适合的培养基组成，繁殖系数高，生根率高，该方法操作简便，成本低，能有效、方便的在短时间内获得大量月光枣组培苗，而且所获得的组培苗成活率高，苗木能够保持优树的优良遗传性状，采用本发明的月光枣的组培快繁方法可以获得大量整齐一致，遗传性状稳定的再生植株，试验结果稳定，重复性良好，可应用于大规模商品化育苗，促进月光枣产业发展，适合广西北部山区大面积区域种植，特别是喀斯特地貌山区种植。

Description

一种月光枣的组培快繁方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种月光枣的组培快繁方法。

背景技术

月光枣原产河北满城县，当地称“灵枣”，是河北农业大学选育的极早熟、优质、丰产、抗寒鲜食新品种。月光枣是在长期进化中演生出的一个枣树稀有品种，它具有早产、丰产、稳产、果核极小、果皮薄、果肉质地细脆、汁液多、酸甜适口、可直接食用、成熟期早等优点，是当前生产上广泛推广的一个鲜食优良品种。月光枣成熟极早，鲜枣供应期较长；其果实中大、果形独特、美观，单果重10g左右，果皮深红色，果面光滑，果肉细脆、汁液多，酸甜适口，风味浓，鲜食品质佳；全红果含可溶性固形物28.5%，可溶性糖25.4%，酸0.26%，Vc206g/100g；富含磷、铁、钙、锌等矿质元素，以其优异的品质和丰富的营养备受消费者欢迎。月光枣新枣头结果能力强，果吊比大于1.0，在不施肥和人工灌溉的山地旱薄枣园，定植后2-3年即可获得产量，4年生平均株产5.0kg。月光枣具有早果丰产，坐果率高，耐瘠薄，适应性强；成熟期遇雨裂果较轻，抗寒性突出，抗缩果病能力强等特点，其枝条稀疏、托叶刺不发达、便于管理，尤其适合设施栽培，深受广大枣农和市场欢迎。而且根据南方地区气候特点，该品种也非常适合在南方地区栽培，特别适合广西北部山区大面积区域种植，特别是喀斯特地貌山区种植，因此市场上对月光枣的需求量也越来越大。

目前，在实际栽培中，月光枣大多采用嫁接和扦插的方法进行繁育，但是采取嫁接苗的方式会受到受砧木资源的限制和受季节限制，且部分存在后期不亲和现象，其砧木还会发生大量萌蘖，难以控制。采用嫁接和扦插的方法繁育繁殖率很低，生长速度慢，弱病苗比例高，费工费时，成苗率较低，且易侵染各种植物病毒，难以大规模的发展苗木，也不能进行周年生产，远远不能满足市场的大量需求。因而影响了其大面积的推广。在此形势下，采用枣树组织培养技术则成了快速培育良种苗木的有效途径。组织培养（Tissue Culture）是在无菌条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织的技术，用组织培养方法快速繁殖，具有整株的遗传一致性，生长健壮，根系发达、移栽成活率高，果品品质好，产量高等优点。

枣树的组织培养研究始于 2O 世纪 70 年代末，迄今为止，已有20多个品种以不同类型外植体建立了无菌离体繁殖体系。对于枣树的组培方法也有相关文献报道，如：1、【题名】毛叶枣组培快繁技术研究【作者】续九如，李春立，孙建设【出处】北京林业大学学报，2003,25（3）【摘要】利用组织培养技术对毛叶枣的组培快繁技术进行了研究。证明3、4月是1年内采集外植体的最佳时期，在此阶段对外植体进行培养时，有效萌芽率最高。以MS为基本培养基筛选出适合毛叶枣组培各阶段的适宜激素浓度和配比，分别为：启动培养基MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.4mg/L；增殖培养基MS+ 6-BA 1.2 mg/L+IBA 0.5mg/L；生根培养基1/2MS+IBA 3.0mg/L并阐明了继代次数与增殖系数和生根率的关系，提出毛叶枣继代次数以8代左右为宜，8 代之后应进行生根培养。2、【题名】酸枣组培快繁研究【作者】代丽，刘孟军，王玖瑞，周俊义【出处】河北农业大学学报，2005,28（2）【摘要】:以休眠芽为试材，建立了酸枣的组培快繁体系。最适启动培养基为MS+ BA_1.0+ IBA_0.1或 MS+BA_2.0+NAA_0.1，增殖培养基为MS+BA_2.0-3.0，萌芽率和壮芽率均超过了70％。增殖培养时，下部茎段的出芽率高于上部茎段，但萌发壮芽的比率则以上部茎段相对较高。1/2 MS+IBA_0.5-1.0是酸枣快繁生根培养的适宜培养基，生根率最高可达92％。迄今为止，人们在枣树的组培研究方面已取得了一些成就，运用组培繁殖枣树优良品种的技术已逐步应用到生产中，但是，枣的组织培养较困难，成本较高，不同品种间的繁殖条件差异较大，不同品种的枣树的组培方法也不一样。

目前，在月光枣的繁育上，由于采用传统的扦插和嫁接等方法进行繁育，存在着繁育繁殖率很低，生长速度慢，远远不能满足市场的大量需求等问题；因此，开发一种针对月光枣的组培快繁方法进行培养繁殖，能够促进优良遗传材料的快速繁殖，实现月光枣树苗的大量繁殖和快速，是解决市场需求以及保持优树特性等问题的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便，生产成本低，生根率高、繁殖率高的月光枣的组培快繁方法，采用该方法能有效、方便的在短时间内获得大量月光枣组培苗，而且所获得的组培苗成活率高，从而实现月光枣树苗的大量繁殖和快速推广，特别适合广西北部山区大面积区域种植，特别是喀斯特地貌山区种植，促进月光枣产业发展。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种月光枣的组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体的建立：于5月中旬,剪取2年生枣头枝，剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，用自来水冲洗15分钟后，于质量浓度为0.4%洗衣粉溶液中浸泡12-15分钟，再用自来水冲洗干净，然后用质量浓度为75%的酒精浸泡35s，无菌水冲洗5-6次，沥干水分，用质量浓度为1.0%的次氯酸钠溶液消毒10-12分钟，然后用无菌水冲洗7-8次，用镊子夹取清洗好的茎段，在无菌操作台上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，剪取1.5—2.5cm 的带芽茎段作为外植体；

（2）启动培养：将灭菌后的外植体接种到经高温灭菌的启动培养基中培养，

培养条件为温度 27～28℃ ,光照强度为2100-2300lx，光照时间17h/d，在培养室中无菌培养24-26天后，将没有染菌的材料切成带 1～2个芽的茎段接种

于分生培养基中培养，分生培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.35-0.40mg/L +维生素H 1.5mg/L+甘氨酸1.8-1.9mg/L +1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1；在光照强度为2300-2500lx，光照时间16h/d，温度为26-27℃的条件下，培养30-35天；

（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养，在培养温度为26-28℃，光照强度2400～26O0lx，光照时间为16h/d的条件下培养30-33d；

（4）生根培养：在无菌条件下，剪取长2-2.5cm继代培养得到的带叶茎段，插入生根培养基中进行生根培养；培养温度26～28℃，光强2100～23001x，光照时间15h/d；

（5）炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗根长 1.0～2.0 cm时，将组培苗进行室内炼苗，炼苗温度为：26-28℃，光照强度为4500-6500lx，室内瓶炼5天后，敞口炼苗5-7天；

（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用重量浓度为0.2%KMnO4溶液消毒过的椰糠+细河沙+草炭按照2-3:5-6:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度 26～28℃，避免阳光直射，35-38天后，移出温室进行全光照炼苗7-10d，及时浇水，然后移栽大田。

所述的月光枣的组培快繁方法，步骤（2）中的启动培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 1.35mg/L +萘乙酸（NAA）0.25-0.28mg/L +维生素C 1.1mg/L +1%白砂糖+2.5%糖蜜+琼脂6-7g/L，培养基pH 值为 6.1。

所述的月光枣的组培快繁方法，步骤（3）中继代培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.1mg/L+萘乙酸（NAA）0.42mg/L +维生素C 0.5-0.8mg/L+维生素H 1.6-1.8mg/L+甘氨酸1.7mg/L+1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1-6.2。

所述的月光枣的组培快繁方法，步骤（4）中生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA0.03-0.04mg/L+ IAA 0.16-0.18mg/L+IBA 0.8mg/L+1%白砂糖+3.5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.2。

本发明的有益效果为：

1、本发明是一种针对月光枣的组培快繁方法，针对月光枣品种进行的研究，经过不断试验，得到了最适合该枣树组培快繁所用的各种培养基，本发明培养基中所用的碳源为白砂糖（含蔗糖95%以上的结晶体）和糖蜜（糖厂蔗糖生产分离出来的不结晶的含糖液体），不用常用的昂贵的蔗糖，糖蜜富含营养成分，含有各种单糖、粗蛋白质和矿物质，更容易被植物利用，采用白砂糖和糖蜜作为碳源不仅大大降低了培养基的成本，而且产生的效果也很好。

2、本发明分生培养基和继代培养基中都加入了甘氨酸，甘氨酸不仅能提供有机氮源，同时也对植物体的生长及不定芽，不定胚的分化起促进作用，而且能够被植物细胞很快吸收；在培养基中加入的维生素C 和维生素H，能增强培养基的营养，利于外植体的生长发育，而且在培养基中加入的维生素C还有防止组织褐变的作用。

3、本发明的月光枣的组培快繁方法可以解决采用传统繁育方法存在的繁殖率很低，生长速度慢等问题，采用本发明的月光枣的组培快繁方法能够极大地提高月光枣的繁殖速度，降低弱苗、病苗的发生比例，加速了新品种的快速推广和开发利用；采用该方法对月光枣进行进行培养繁殖，能够促进优良遗传材料的快速繁殖，实现月光枣树的大量繁殖和快速推广，特别适合广西北部山区大面积区域种植，特别是喀斯特地貌山区种植，解决市场的需求。

4、本发明的月光枣的组培快繁方法操作难度低、生产成本低，生根率达到88.6%以上，生产的组培苗成活率高，易于在大范围内推广使用，采用本发明的月光枣的组培快繁方法可以获得大量整齐一致，遗传性状稳定的再生植株，试验结果稳定，重复性良好，可应用于大规模商品化育苗，苗木能够保持优树的优良遗传性状，适合大面积区域种植。

具体实施方式

实施例1

一种月光枣的组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体的建立：于5月中旬,剪取2年生枣头枝，剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，用自来水冲洗15分钟后，于质量浓度为0.4%洗衣粉溶液中浸泡12分钟，再用自来水冲洗干净，然后用质量浓度为75%的酒精浸泡35s，无菌水冲洗5次，沥干水分，用质量浓度为1.0%的次氯酸钠溶液消毒10分钟，然后用无菌水冲洗7次，用镊子夹取清洗好的茎段，在无菌操作台上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，剪取1.5—2.5cm 的带芽茎段作为外植体；

（2）启动培养：将灭菌后的外植体接种到经高温灭菌的启动培养基中培养，启动培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 1.35mg/L +萘乙酸（NAA）0.25mg/L +维生素C1.1mg/L +1%白砂糖+2.5%糖蜜+琼脂6g/L，培养基pH 值为 6.1；培养条件为温度 27～28℃,光照强度为2100lx，光照时间17h/d，在培养室中无菌培养26天后，将没有染菌的材料切成带 1～2个芽的茎段接种于分生培养基中培养，分生培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.35mg/L +维生素H 1.5mg/L+甘氨酸1.8mg/L +1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1；在光照强度为2300-2500lx，光照时间16h/d，温度为26-27℃的条件下，培养30天；

（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养，继代培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.1mg/L+萘乙酸（NAA）0.42mg/L +维生素C 0.5mg/L+维生素H 1.8mg/L+甘氨酸1.7mg/L+1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1-6.2；在培养温度为26-28℃，光照强度2400lx，光照时间为16h/d的条件下培养33d；

（4）生根培养：在无菌条件下，剪取长2-2.5cm继代培养得到的带叶茎段，插入生根培养基中进行生根培养；生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA 0.03mg/L+ IAA 0.16-0.18mg/L+IBA 0.8mg/L+1%白砂糖+3.5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.2；培养温度26～28℃，光强21001x，光照时间15h/d；

（5）炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗根长 1.0～2.0 cm时，将组培苗进行室内炼苗，炼苗温度为：26-28℃，光照强度为4500lx，室内瓶炼5天后，敞口炼苗5天；

（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用重量浓度为0.2%KMnO₄溶液消毒过的椰糠+细河沙+草炭按照2:5:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度 26～28℃，避免阳光直射，35天后，移出温室进行全光照炼苗7d，及时浇水，然后移栽大田。

实施例2

一种月光枣的组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体的建立：于5月中旬,剪取2年生枣头枝，剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，用自来水冲洗15分钟后，于质量浓度为0.4%洗衣粉溶液中浸泡13分钟，再用自来水冲洗干净，然后用质量浓度为75%的酒精浸泡35s，无菌水冲洗6次，沥干水分，用质量浓度为1.0%的次氯酸钠溶液消毒11分钟，然后用无菌水冲洗8次，用镊子夹取清洗好的茎段，在无菌操作台上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，剪取1.5—2.5cm 的带芽茎段作为外植体；

（2）启动培养：将灭菌后的外植体接种到经高温灭菌的启动培养基中培养，启动培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 1.35mg/L +萘乙酸（NAA）0.27mg/L +维生素C1.1mg/L +1%白砂糖+2.5%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为 6.1；培养条件为温度 27～28℃,光照强度为2200lx，光照时间17h/d，在培养室中无菌培养25天后，将没有染菌的材料切成带 1～2个芽的茎段接种于分生培养基中培养，分生培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.37mg/L +维生素H 1.5mg/L+甘氨酸1.9mg/L +1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1；在光照强度为2400lx，光照时间16h/d，温度为26-27℃的条件下，培养33天；

（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养，继代培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.1mg/L+萘乙酸（NAA）0.42mg/L +维生素C 0.6mg/L+维生素H 1.7mg/L+甘氨酸1.7mg/L+1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1-6.2；在培养温度为26-28℃，光照强度25O0lx，光照时间为16h/d的条件下培养32d；

（4）生根培养：在无菌条件下，剪取长2-2.5cm继代培养得到的带叶茎段，插入生根培养基中进行生根培养；生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA 0.04mg/L+ IAA 0.17mg/L+IBA0.8mg/L+1%白砂糖+3.5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.2；培养温度26～28℃，光强22001x，光照时间15h/d；

（5）炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗根长 1.0～2.0 cm时，将组培苗进行室内炼苗，炼苗温度为：26-28℃，光照强度为5500lx，室内瓶炼5天后，敞口炼苗6天；

（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用重量浓度为0.2%KMnO₄溶液消毒过的椰糠+细河沙+草炭按照3:5:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度 26～28℃，避免阳光直射，37天后，移出温室进行全光照炼苗9d，及时浇水，然后移栽大田。

实施例3

一种月光枣的组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体的建立：于5月中旬,剪取2年生枣头枝，剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，用自来水冲洗15分钟后，于质量浓度为0.4%洗衣粉溶液中浸泡15分钟，再用自来水冲洗干净，然后用质量浓度为75%的酒精浸泡35s，无菌水冲洗6次，沥干水分，用质量浓度为1.0%的次氯酸钠溶液消毒12分钟，然后用无菌水冲洗8次，用镊子夹取清洗好的茎段，在无菌操作台上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，剪取1.5-2.5cm 的带芽茎段作为外植体；

（2）启动培养：将灭菌后的外植体接种到经高温灭菌的启动培养基中培养，启动培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 1.35mg/L +萘乙酸（NAA）0.28mg/L +维生素C1.1mg/L +1%白砂糖+2.5%糖蜜+琼脂6g/L，培养基pH 值为 6.1；培养条件为温度 27～28℃,光照强度为2300lx，光照时间17h/d，在培养室中无菌培养24天后，将没有染菌的材料切成带 1～2个芽的茎段接种于分生培养基中培养，分生培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.40mg/L +维生素H 1.5mg/L+甘氨酸1.9mg/L+1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1；在光照强度为2500lx，光照时间16h/d，温度为26-27℃的条件下，培养30天；

（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养，继代培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.1mg/L+萘乙酸（NAA）0.42mg/L +维生素C 0.8mg/L+维生素H 1.6mg/L+甘氨酸1.7mg/L+1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.2；在培养温度为26-28℃，光照强度26O0lx，光照时间为16h/d的条件下培养30d；

（4）生根培养：在无菌条件下，剪取长2-2.5cm继代培养得到的带叶茎段，插入生根培养基中进行生根培养；生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA 0.03mg/L+ IAA 0.18mg/L+IBA0.8mg/L+1%白砂糖+3.5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.2；培养温度26～28℃，光强23001x，光照时间15h/d；

（5）炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗根长 1.0～2.0 cm时，将组培苗进行室内炼苗，炼苗温度为：26-28℃，光照强度为6500lx，室内瓶炼5天后，敞口炼苗7天；

（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用重量浓度为0.2%KMnO₄溶液消毒过的椰糠+细河沙+草炭按照3:6:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度26～28℃，避免阳光直射，38天后，移出温室进行全光照炼苗10d，及时浇水，然后移栽大田。

以下为采用本发明月光枣的组培快繁方法得到的月光枣组培苗的繁育结果：

种植地点：广西桂林市荔浦县（荔浦县位于广西北部，气候冬天最低零下5度，夏天32度，沙质土，适宜枣树生长）。

由上表可以看出，本发明月光枣的组培快繁方法，繁殖系数高，生根率达88.6%以上，营养杯移栽成活率在89%以上，大田移栽成活率在91%以上，组培苗移栽后能迅速适应露天环境，生长迅速，抗外界不良环境能力强。采用本发明的方法对月光枣进行繁育，能有效、方便的在短时间内获得大量月光枣组培苗，满足市场需求。

Claims

1.一种月光枣的组培快繁方法，其特征在于，步骤如下：

（2）启动培养：将灭菌后的外植体接种到经高温灭菌的启动培养基中培养，培养条件为温度 27～28℃ ,光照强度为2100-2300lx，光照时间17h/d，在培养室中无菌培养24-26天后，将没有染菌的材料切成带 1～2个芽的茎段接种于分生培养基中培养，分生培养基的成分为：MS+ N⁶苄基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.35-0.40mg/L +维生素H 1.5mg/L+甘氨酸1.8-1.9mg/L+1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1；在光照强度为2300-2500lx，光照时间16h/d，温度为26-27℃的条件下，培养30-35天；

（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养，在培养温度为26-28℃，光照强度2400～2600lx ，光照时间为16h/d的条件下培养30-33d；

（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用重量浓度为0.2%KMnO₄溶液消毒过的椰糠+细河沙+草炭按照2-3:5-6:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度 26～28℃，避免阳光直射，35-38天后，移出温室进行全光照炼苗7-10d，及时浇水，然后移栽大田；

所述步骤（2）中的启动培养基的成分为：MS+ N⁶苄基腺嘌呤1.35mg/L +萘乙酸0.25-0.28mg/L +维生素C 1.1mg/L +1%白砂糖+2.5%糖蜜+琼脂6-7g/L，培养基pH 值为 6.1；

所述步骤（3）中继代培养基的成分为：MS+ N⁶苄基腺嘌呤2.1mg/L+萘乙酸0.42mg/L +维生素C 0.5-0.8mg/L+维生素H 1.6-1.8mg/L+甘氨酸1.7mg/L+1%白砂糖+3%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.1-6.2；

所述步骤（4）中生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA 0.03-0.04mg/L+ IAA 0.16-0.18mg/L+IBA 0.8mg/L+1%白砂糖+3.5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.2。