CN104686352A - 一种决明组培无性系的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种决明组培无性系的构建方法，涉及将植物组织培养技术运用于决明（Cassia obtusifolia L.）的快速育苗繁殖。本发明以决明的种子即决明子为外植体，经过无菌苗的获得、愈伤组织诱导、丛生芽培养、增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等过程建立了决明组培无性系，为决明的生物技术育种和解决决明品种退化问题提供了新的方法。

Description

一种决明组培无性系的构建方法
技术领域
    本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种决明组培无性系的构建方法。
背景技术
决明子（Semen Cassiae）又名草决明、假绿豆，为豆科药用植物（Cassia obtusifolia L.）的干燥成熟种子，经常服用可起到明目的作用，决明子因此而得名。决明子是我国重要的传统小品药材，决明富含大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、声荟大黄素、大黄酸、决明素等，决明的化学成分复杂，被广泛应用于临床，有清热明目、润肠通便、降压降脂、保肝等诸多功效。主治目赤肿痛，羞明泪多、青盲、雀目、头痛头晕、视物昏暗、肝硬化腹水、小便不利，习惯性便秘等。
在我国南北各地均有种植决明和野生决明分布。决明常生长在丘陵及河边，性喜高温、高湿、阳光充分、土壤疏松、排水良好的环境，适合生长在肥力中等以上的酸性土或石灰岩土地，常作为庭院栽培植物或绿篱，是极具观赏性的绿肥树种。决明的质地比较坚硬，外层具有蜡质，不易吸水膨胀，萌发过程中胚芽不易突破种皮，这也是决明子发芽率不高和栽培过程中萌发不整齐的主要原因。植物的组织培养技术是自20世纪以来科技进步的主要成果之一。组织培养技术既不会受到地理位置的限制、也不会受到季节的限制，它仅需要足够的实验材料，繁殖就可以进行，且遗传背景一致、生长周期短、成本低。将植物组织培养技术运用于决明种苗的培养，不仅可以有效提高决明的品种质量，而且能对决明进行快速育苗繁殖，在其药用成分方面更是高效地获取有效成分进而有利于市场的需要和药物的开发利用。
发明内容
    本发明的目的在于提供出一种决明组培无性系的构建方法，本发明以决明的种子即决明子为外植体，经过无菌苗的获得、愈伤组织诱导、丛生芽培养、增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等过程建立了决明组培无性系，从而实现了本发明的目的。
 本发明的一种决明组培无性系的构建方法，包括以下的步骤：
（1）无菌苗的获得：选取颗粒饱满、绿棕色的决明子，先用70%～80%浓硫酸浸泡处理40～90min后流水冲洗1～3h，再用75%乙醇消毒30～60s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒10～25min，用无菌水冲洗4～6次后用无菌滤纸吸去水分后接种于种子萌发培养基中进行播种。置于每天光照10～13小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至种子萌发。
   （2）愈伤组织诱导：将步骤（1）的培养得到的无菌苗的芽剪切成长3～4cm并接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导,接种后先在25～28℃条件下全暗培养5～10天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为1500～3000lx，直至诱导形成愈伤组织。
（3）丛生芽培养及增殖：将步骤（2）生长到2～3cm的绿色、胚性愈伤组织转入丛生芽培养基上进行丛生芽培养及增殖，接种后先在25～28℃条件下全暗培养2～4天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成分化芽。
（4）生根培养：将步骤（3）高度约为3～5cm的分化芽从基部剪下后接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照14～16小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根。
（5）炼苗移栽：将高约8～10cm的生根试管苗的培养瓶盖半开炼苗3～5天，再全开瓶盖加入适量的自来水并置于自然光照下炼苗5～7天后移栽到温室，盆钵下层用肥沃园土，上面覆盖一层约5cm厚干净河沙，待试管苗移栽成活后在河沙上面再覆盖一层肥沃的园土。
 上述步骤（1）所述的种子萌发培养基为：MS+GA30.1～1.0mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
 上述步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+6-BA 1～5mg/L+NAA0.1～1mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
 上述步骤（3）所述的丛生芽培养基为：MS+IBA0.1～1.0mg/L+6-BA 1～4mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
 上述步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1～1.5mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
    本发明的优点是：涉及将植物组织培养技术运用于决明（Cassia obtusifolia L.）的快速育苗繁殖。本发明以决明的种子即决明子为外植体，经过无菌苗的获得、愈伤组织诱导、丛生芽培养、增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等过程建立了决明组培无性系，为决明的生物技术育种和解决决明品种退化问题提供了新的方法。
具体实施方式
    以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
    实施例1：
（1）无菌苗的获得：选取颗粒饱满、绿棕色的决明子，先用70%浓硫酸浸泡处理40min后流水冲洗1h，再用75%乙醇消毒30s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒10min，用无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸去水分后接种于种子萌发培养基中进行播种。置于每天光照10小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为28℃的条件下培养5天种子即萌发，萌发率达95.8%，萌发比较均匀。所述的种子萌发培养基为：MS+GA30.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂6.0g/L，pH为5.8。
   （2）愈伤组织诱导：将步骤（1）的培养得到的无菌苗的芽剪切成长3～4cm并接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导,接种后先在28℃条件下全暗培养5天，然后置于每天光照12小时，光照强度为1500lx条件下培养10天在芽的下端切口处有膨大的突起愈伤组织产生，诱导率为89%。所述的诱导培养基为：MS+6-BA 3mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.5g/L，pH为5.8。
（3）丛生芽培养及增殖：将步骤（2）生长到2～3cm的绿色、胚性愈伤组织转入丛生芽培养基上进行丛生芽培养及增殖，接种后先在28℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为28℃的条件下培养14天后长出较多的多芽体，芽体长势健壮而均匀，丛生芽分化率达到90%。所述的丛生芽培养基为：MS+IBA0.1mg/L+6-BA 1mg/L+蔗糖18g/L+琼脂3.9g/L，pH为5.8。
（4）生根培养：将步骤（3）高度约为3～5cm的分化芽从基部剪下后接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照14小时，光照强度为3000lx，培养温度为28℃的条件下培养5天即可见丛生芽有根原基生长，生根率为87.4%。所述的生根培养基为：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂4.0g/L，pH为5.8。
（5）炼苗移栽：将高约8～10cm的生根试管苗的培养瓶盖半开炼苗3天，再全开瓶盖加入适量的自来水并置于自然光照下炼苗5天后移栽到温室，盆钵下层用肥沃园土，上面覆盖一层约5cm厚干净河沙，待试管苗移栽成活后在河沙上面再覆盖一层肥沃的园土，移栽成活率为91.2%。
    实施例2：
（1）无菌苗的获得：选取颗粒饱满、绿棕色的决明子，先用70%浓硫酸浸泡处理70min后流水冲洗3h，再用75%乙醇消毒45s后用无菌水洗5次，再用0.1%升汞溶液消毒15min，用无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸去水分后接种于种子萌发培养基中进行播种。置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为26℃的条件下培养4天种子即萌发，萌发率达94%，萌发比较均匀。所述的种子萌发培养基为：MS+GA31mg/L+蔗糖18g/L+琼脂4.5g/L，pH为5.6。
    （2）愈伤组织诱导：将步骤（1）的培养得到的无菌苗的芽剪切成长3～4cm并接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导,接种后先在26℃条件下全暗培养5天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx条件下培养8天在芽的下端切口处有膨大的突起愈伤组织产生，诱导率为84.9%。所述的诱导培养基为：MS+6-BA 5mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.8g/L，pH为5.6。
（3）丛生芽培养及增殖：将步骤（2）生长到2～3cm的绿色、胚性愈伤组织转入丛生芽培养基上进行丛生芽培养及增殖，接种后先在26℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为26℃的条件下培养11天后长出较多的多芽体，芽体长势健壮而均匀，丛生芽分化率达到92%。所述的丛生芽培养基为：MS+IBA0.2mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖18g/L+琼脂4.3g/L，pH为5.6。
（4）生根培养：将步骤（3）高度约为3～5cm的分化芽从基部剪下后接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在26℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照14小时，光照强度为3500lx，培养温度为26℃的条件下培养6天即可见丛生芽有根原基生长，生根率为92.8%。所述的生根培养基为：1/2MS+NAA 0.8mg/L+蔗糖25g/L+琼脂4.3g/L，pH为5.8。
（5）炼苗移栽：将高约8～10cm的生根试管苗的培养瓶盖半开炼苗4天，再全开瓶盖加入适量的自来水并置于自然光照下炼苗6天后移栽到温室，盆钵下层用肥沃园土，上面覆盖一层约5cm厚干净河沙，待试管苗移栽成活后在河沙上面再覆盖一层肥沃的园土，移栽成活率为95.1%。

Claims (5)

1.一种决明组培无性系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）无菌苗的获得：选取颗粒饱满、绿棕色的决明子，先用70%～80%浓硫酸浸泡处理40～90min后流水冲洗1～3h，再用75%乙醇消毒30～60s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒10～25min，用无菌水冲洗4～6次后用无菌滤纸吸去水分后接种于种子萌发培养基中进行播种,置于每天光照10～13小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至种子萌发；
   （2）愈伤组织诱导：将步骤（1）的培养得到的无菌苗的芽剪切成长3～4cm并接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导,接种后先在25～28℃条件下全暗培养5～10天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为1500～3000lx，直至诱导形成愈伤组织；
（3）丛生芽培养及增殖：将步骤（2）生长到2～3cm的绿色、胚性愈伤组织转入丛生芽培养基上进行丛生芽培养及增殖，接种后先在25～28℃条件下全暗培养2～4天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成分化芽；
（4）生根培养：将步骤（3）高度约为3～5cm的分化芽从基部剪下后接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照14～16小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；
（5）炼苗移栽：将高约8～10cm的生根试管苗的培养瓶盖半开炼苗3～5天，再全开瓶盖加入适量的自来水并置于自然光照下炼苗5～7天后移栽到温室，盆钵下层用肥沃园土，上面覆盖一层约5cm厚干净河沙，待试管苗移栽成活后在河沙上面再覆盖一层肥沃的园土。
2.根据权利要求1所述的一种决明组培无性系的构建方法，其特征在于步骤（1）所述的种子萌发培养基为：MS+GA30.1～1.0mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种决明组培无性系的构建方法，其特征在于步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+6-BA 1～5mg/L+NAA0.1～1mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种决明组培无性系的构建方法，其特征在于步骤（3）所述的丛生芽培养基为：MS+IBA0.1～1.0mg/L+6-BA 1～4mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
5.根据权利要求1所述的一种决明组培无性系的构建方法，其特征在于步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1～1.5mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
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