CN102742507B - 毛葡萄离体再生培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毛葡萄离体再生培养方法，包括以下步骤：无菌系的建立、不定芽诱导、生根培养及炼苗移栽。本发明采用植物组织培养技术成功实现毛葡萄叶片离体再生，毛葡萄再生率可达37%以上，最高可达93.3%，生根率可达90%以上，成活率可达100%，为毛葡萄遗传转化奠定坚实基础，为葡萄其他优良性状向毛葡萄的转移提供了一条有效的途径。本发明方法简单，成本低廉，使用效果好。
Description
技术领域
本发明涉及农业科学领域，尤其是一种毛葡萄离体再生培养方法。
背景技术
毛葡萄（Vitis heyneana Roem. & Schult.）又名绒毛葡萄、五角叶葡萄，在我国华中、华东、西南、华南北部、西北的陕、甘及华北的山西均有分布，是分布最为广泛的野生葡萄种类之一。毛葡萄抗性强、适应性好，结果系数高，易与葡萄栽培品种杂交，既是葡萄栽培的优良抗性砧木，也是葡萄抗性育种的优良亲本。由于葡萄遗传背景复杂、生命周期长，使常规杂交育种在品种改良上受到极大限制，通过转基因技术可实现毛葡萄抗性性状与葡萄栽培品种的品质性状有效结合，培育出优质高抗葡萄新品种。转基因技术的关键是高效再生体系的建立，而毛葡萄离体再生研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是：提供一种毛葡萄离体再生培养方法，它能为毛葡萄遗传转化奠定坚实基础，为葡萄其他优良性状向毛葡萄的转移提供了一条有效的途径，以满足农业生产需要。
本发明是这样实现的：毛葡萄离体再生培养方法，包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s，再用无菌水冲洗3次后，用质量百分比为0.1%的升汞溶液（即相当于1g氯化汞溶解在1升水中）浸泡消毒8-10min后，用无菌水冲洗5-6次，然后剪除新梢两端褐化部分后，剪成单芽茎段，接种到MS培养基中，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的培养条件下，培养诱导至腋芽萌发，获得诱导的腋芽叶片；
步骤二、不定芽诱导：取步骤一中获得的诱导的腋芽叶片剪成0.5×0.5cm2见方的小块，在叶片背面沿叶脉垂直方向划三刀，正面向上接种到MS培养基上，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的条件下培养20d，叶片开始向上卷起，25-30d划伤处再生出不定芽，30-45d大量产生再生不定芽；
步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中，先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；
步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102.8umol·s-1·m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田即可。
步骤一中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加2.0mg 的6-苄基嘌呤，0.2mg的吲哚乙酸，20 g蔗糖和5g琼脂粉，其pH值为5.8-6.0。
步骤二中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加8.0-8.5 mg 的6-苄基嘌呤，0.3-0.35 mg的吲哚丁酸，0.20-0.26 mg的吲哚乙酸，18-32 g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0。
步骤三中采用的1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.08-0.5g吲哚丁酸，0-0.14 g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0。
步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05mg·L-1吲哚乙酸。
由于采用上述的技术方案，与现有技术相比，本发明采用植物组织培养技术成功实现毛葡萄叶片离体再生，毛葡萄再生率可达37%以上，最高可达93.3%，生根率可达90%以上，成活率可达100%，为毛葡萄遗传转化奠定坚实基础，为葡萄其他优良性状向毛葡萄的转移提供了一条有效的途径；本发明方法简单，成本低廉，使用效果好。
本发明的实施例1：毛葡萄离体再生培养方法，包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄“花溪-4”新梢为外植体，在自来水下冲洗干净后，先在体积百分比70%的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比为0.1%升汞溶液浸泡消毒8min，无菌水冲洗5次，剪成单芽茎段，接种到MS培养基上（每升MS培养基附加2.0mg 的6-苄基嘌呤，0.2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0），MS培养基的温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；培养诱导至腋芽萌发，获得诱导的腋芽叶片；
步骤二、不定芽诱导：取步骤一中获得的诱导的腋芽叶片剪成0.5×0.5cm2见方的小块，在叶片背面沿叶脉垂直方向划三刀，正面向上接种到MS培养基上(每升MS培养基添加8.0-8.5 mg 的6-苄基嘌呤，0.3-0.35 mg的吲哚丁酸，0.20-0.26 mg的吲哚乙酸，18-32 g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0)，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的条件下培养20d，叶片开始向上卷起，25-30d划伤处再生出不定芽，30-45d大量产生再生不定芽； 45d再生率可达93.3%；
步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中（1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加8.0-8.5 mg 的6-苄基嘌呤，0.3-0.35 mg的吲哚丁酸，0.20-0.26 mg的吲哚乙酸，18-32 g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0），先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；30d后生根率可达92.5%；
步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102.8umol·s-1·m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液（1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05mg·L-1吲哚乙酸）浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田，成活率100%。
本发明的实施例2：毛葡萄离体再生培养方法，包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄“农院-11”新梢为外植体，在自来水下冲洗干净后，先在体积百分比为70%的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比为0.1%升汞溶液浸泡消毒8min，无菌水冲洗5次，剪成单芽茎段，接种到MS培养基上（每升MS培养基附加2.0mg 的6-苄基嘌呤，0.2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0），MS培养基的温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；培养诱导至腋芽萌发，获得诱导的腋芽叶片；
步骤二、不定芽诱导：取步骤一中获得的诱导的腋芽叶片剪成0.5×0.5cm2见方的小块，在叶片背面沿叶脉垂直方向划三刀，正面向上接种到MS培养基上(每升MS培养基添加8.0-8.5 mg 的6-苄基嘌呤，0.3-0.35 mg的吲哚丁酸，0.20-0.26 mg的吲哚乙酸，18-32 g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0)，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的条件下培养20d，叶片开始向上卷起，25-30d划伤处再生出不定芽，30-45d大量产生再生不定芽；35d时再生率可达37.5%；
步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中（1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加8.0-8.5 mg 的6-苄基嘌呤，0.3-0.35 mg的吲哚丁酸，0.20-0.26 mg的吲哚乙酸，18-32 g蔗糖和5g琼脂粉，pH5.8-6.0），先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；30d后生根率可达96.9%；
步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102.8umol·s-1·m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1%KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液（1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0.05mg·L-1吲哚乙酸）浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田，成活率100%。
花溪-4及农院-11均是从野外收集的贵州野生毛葡萄优良单株，与栽培葡萄品种相比，果粒小，含糖量较低、含酸量较高，但抗病、抗虫性及抗旱性好，既可作为酿酒葡萄栽培，也可用于砧木利用，更是提高栽培品种抗性的优良亲本。
Claims (1)
1.一种毛葡萄离体再生培养方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s，再用无菌水冲洗3次后，用质量百分比为0.1%的升汞溶液浸泡消毒8-10min后，用无菌水冲洗5-6次，然后剪除新梢两端褐化部分后，剪成单芽茎段，接种到培养基中，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的培养条件下，培养诱导至腋芽萌发，获得诱导的腋芽叶片；步骤一中采用的培养基为MS培养基中添加了2.0mg/L 的6-苄基嘌呤，0.2mg/L的吲哚乙酸，20g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，其pH值为5.8-6.0；
步骤二、不定芽诱导：取步骤一中获得的诱导的腋芽叶片剪成0.5×0.5cm2见方的小块，在叶片背面沿叶脉垂直方向划三刀，正面向上接种到培养基上，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d的条件下培养20d，叶片开始向上卷起，25-30d划伤处再生出不定芽，30-45d大量产生再生不定芽；步骤二中采用的培养基为MS培养基中添加8.0-8.5 mg/L 的6-苄基嘌呤，0.3-0.35 mg/L的吲哚丁酸，0.20-0.26 mg/L的吲哚乙酸，18-32 g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，pH5.8-6.0；
步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中，先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12h/d；步骤三中采用的1/2MS生根培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并添加8.0-8.5 mg/L的6-苄基嘌呤，0.3-0.35 mg/L吲哚丁酸，0.20-0.26 mg/L吲哚乙酸，18-32g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，pH5.8-6.0；
步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102.8umol·s-1·m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1%KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田即可；步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并添加0.05mg/L吲哚乙酸。
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