CN103380730A - 一种杜梨组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杜梨组培快繁方法,包括外植体的消毒、芽的诱导、试管苗增殖、愈伤组织诱导、生根诱导和炼苗移栽,在生根诱导过程中,先诱导愈伤组织,再诱导生根;获得的生根试管苗,先在三角瓶中炼苗,然后转入珍珠岩驯化炼苗,最后移栽。本发明的方法较常规方法生根率和移栽成活率高,繁殖效率高,成本低,便于推广,遗传稳定性好,适用于杜梨组培快繁。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术的植物组织快繁,具体涉及一种杜梨组培快繁方法。
背景技术
梨为蔷薇科(Rosaceae),梨亚科(Pomoideae)之梨属(Pyrus L.)植物。梨是一种重要的果树,在我国水果产量中,仅次于苹果、柑橘,居第三位。梨在生产中均采用嫁接繁殖,砧木是果树嫁接的重要基础,与果树的生产密切相关。优良砧木的筛选具有调节树势,延长结果年限,甚至调节果实品质等。杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge.)是梨主要砧木之一,由于其适生性强,耐旱,根深、发达、耐瘠薄,抗盐碱能力强,在中性土及盐碱土中性土中均能正常生长,是我国主要梨砧木,生产中广泛应用。
目前,杜梨繁殖以实生播种为主,由于实生苗具有不同基因型,繁育的苗木生长势、抗病性、亲和力等方面均存在较大差异。此外,在葡萄、苹果、梨上已有研究表明,嫁接于不同砧木上接穗的生长势、抗病性、果实品质等也存在较大的差异。因而,生产中有必要选择基因型一致砧木用于苗木快繁。
对砧木进行无性繁殖,可以获得基因型一致的苗木,通常采用压条、扦插、组织培养等方式进行无性繁殖,组织培养由于不受季节、环境等因素的影响,被认为是效率最高的快繁方式。然而木本植物组培快繁普遍存在生根困难、移栽成活率低等问题。为解决试管苗生根,目前常用方法有以下几种:一是筛选合适生根培养基,在生根培养基上直接培养,常用生长素有NAA和IBA,单独使用或混合使用,同时通过降低培养基无机盐浓度和调整基本培养基组成来促进生根。二是瓶外生根,先将试管苗的茎段进行激素处理后,转到蛭石、珍珠岩、泥炭、苔藓等基质中来完成瓶外生根过程。但是瓶外生根的生根率比瓶内生根率略低。三是瓶内二次转接生根,先将试管苗的茎段激素处理后,再转到空白培养基上诱导生根。这些方法在不同植物上都有成功的报道,但是不同植物采用的培养基配方以及培养方式存在极大差异。
有关梨试管苗生根培养,研究认为培养条件显著影响试管苗生根,对砀山酥梨瓶内直接生根根数的影响程度大小依次为:IBA>间苯三酚>NAA>基本培养基。BA-29试管苗生根研究表明,IBA和NAA复合处理优于单一处理。不同基因型间,生根条件存在较大差异。相同培养条件下,西洋梨矮化砧BA-29、山梨最高生根率在81.59%和83%,黄花梨生根率仅有4-7.1%,南果梨、黄冠梨、中矮一号、砀山酥梨等生根率均在50%以下。有关杜梨组培快繁研究相对较少,开展研究杜梨组培快繁技术研究,具有极大的实用性和必要性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、高效的杜梨组培快繁方法,可提高杜梨试管苗生根率和移栽成活率,为规模化生产的砧木无性繁殖提供优质的组培试管植株。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种杜梨组培快繁方法,包括外植体的消毒、芽的诱导、愈伤组织诱导、生根诱导、炼苗移栽;在组培快繁过程中,进行二步法生根诱导,先在添加NAA的1/2MS培养基上,暗培养诱导愈伤组织,再转入含IBA的1/2MS培养基上,光暗培养诱导生根。移栽过程也进行二步驯化,先在三角瓶中敞口驯化,再转到栽培基质上驯化。以此实现提高试管苗生根率和移栽成活率。
该方法具体包括如下步骤:
(1)外植体的消毒:将杜梨带腋芽的幼茎作为外植体,切段,消毒,无菌水冲洗;
(2)芽的诱导:将经上述处理的外植体切成单芽茎段,接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基,光照培养25~35d得到无根苗;
(3)试管苗增殖:将无根苗接种于MS增殖培养基上,光照培养25~35d得到试管丛生苗;
(4)生根诱导:
(4a)愈伤组织诱导:选取健壮的1~3cm高的试管丛生苗切分后转入愈伤组织诱导培养基中,暗培养7d,诱导产生愈伤组织;
(4b)诱导生根:将上述获得的具有愈伤组织的试管苗,转入生根诱导培养基中,光照培养25~35d获得生根的试管植株;
(5)炼苗移栽:
将生根的试管植株加水5~10ml,敞口炼苗2~3天,取出组培苗,洗净培养基,每株留叶2~3片,移入泥炭和珍珠岩基质中,加盖遮阳网,继续炼苗20~25d,然后移栽定植。
步骤(1)中,对杜梨带腋芽的幼茎用流水冲洗1~2h,剪取3~4cm带芽茎段,在超净工作台上先以75(v/v)%酒精消毒30s,再用0.1wt%升汞消毒5min,无菌水漂洗4~5次。
步骤(1)中,所述的幼茎为春季萌发的新梢幼茎。
步骤(2)和(3)中,光照培养条件为:25±2℃、50~60μmol·m–2·s–1、12~14h/d。
步骤(4a)中,暗培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间温度为20±2℃。
步骤(4b)中,光照培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间温度为20±2℃,光照强度为50~60μmol·m–2·s–1,每天光照12~14h。
步骤(2)中,所述的不含任何外源植物激素的MS启动培养基为:MS培养基+25~35g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉。
步骤(3)中,所述的MS增殖培养基为:MS培养基+0.3~0.6mg/l6-BA+0.1~0.6mg/lNAA+25-35g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
步骤(4a)中,所述的愈伤组织诱导培养基为:1/2MS培养基+0.5~2.0mg/l NAA+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
步骤(4b)中,生根诱导培养基为:1/2MS培养基+0.5~2.0mg/l IBA+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
步骤(5)中,生根的试管植株生在三角瓶中,加水5~10ml,去除封口膜,先进行2~3d的敞口炼苗即一次炼苗,取出组培苗,洗净培养基,每株留叶2~3片,移入泥炭和珍珠岩基质中,加盖遮阳网进行二次炼苗20~25d,然后移栽定植。
步骤(5)中,泥炭和珍珠岩基质中,泥炭和珍珠岩的质量比为4:1。
有益效果:本发明的优点在于:
(1)提高了杜梨试管苗快繁效率。本发明较常规方法处理,大幅提高杜梨试管苗生根率和移栽成活率。杜梨采用普通方法诱导生根率低,本发明的生根率较常规处理生根率提高50%。此外,杜梨采用常规方法,进行单次驯化移栽,成活率低,本发明的移栽成活率达到90%,较常规方法提高了40%。
(2)降低了试管苗繁育成本。本发明提高了杜梨试管苗育苗效率,相应降低了培养过程中产生的人工及试剂耗材成本。
(3)扩大了繁殖系数,加快了育苗进程。本发明的繁殖速度快,苗生长整齐。
(4)缩短了杜梨选优育苗的周期。目前南方主产区梨主要采用杜梨品种为砧木,都是采用实生播种后,2年后再进行根接。由于种子后代基因具有高度杂合性,很难对筛选出优质抗生单株进行大规模生产。本发明可以大大缩短杜梨育苗周期,并且可以选择优良单株或类型进行大规模工厂化生产。
(3)以茎段作为外植体,通过芽的增殖进行快速繁殖,保证了遗传的稳定性,并且取材容易,更新方便。
(4)具有普遍的适用性。本发明的技术方案在蔷薇科植物的快繁育苗中均能适用。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:不同生长素对杜梨茎段愈伤组织诱导效果的影响。
本实施例基于MS增殖培养基培养25-35d获得的健壮试管丛生苗茎段,试管丛生苗的苗高1cm~3cm。
愈伤组织诱导培养配方如下:
处理1:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L NAA
处理2:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L NAA
处理3:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA
处理4:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA
处理5:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L IBA
处理6:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L IBA
处理7:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L IBA
处理8:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L IBA
试验方法
将所述的健壮试管丛生苗茎段分成8组,分别在1/2MS+1.5%蔗糖+5.0g/L琼脂粉并附加不同浓度的IBA和NAA的生根培养基中进行平行试验,具体是:试管苗茎段接种到培养中后,暗培养7d。各组愈伤组织诱导效果见表1。
表1
由表1可见,IBA和NAA均可以诱导杜梨茎段产生愈伤组织,且承着浓度的升高愈伤组织诱导率越高。但从作用效果来看,NAA诱导效果更好,0.5mg/L的NAA处理可以得到98.5%的愈伤组织诱导率,而相同浓度下IBA愈伤组织诱导率仅有55.3%。1.0~2.0mg/L的NAA处理,愈伤组织诱导率均可达到100%。IBA处理下,2.0mg/L处理下诱导率最高也仅有76.4%的茎段产生诱伤组织。可见,NAA对杜梨试管苗茎段愈伤组织诱导效果优于IBA。
实施例2:不同配方的生根培养基对生根效果的影响。
本实施例基于MS增殖培养基培养25-35d获得的健壮试管丛生苗茎段,试管丛生苗的苗高1cm~3cm。
生根培养基配方如下:
处理1:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L NAA
处理2:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L NAA
处理3:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA
处理4:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA
处理5:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L IBA
处理6:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L IBA
处理7:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L IBA
处理8:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L IBA
处理9:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA+1.5mg/L IBA
处理10:1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA+2.0mg/L IBA
试验方法
将所述的健壮试管丛生苗茎段分成10组,分别在1/2MS+1.5%蔗糖+5.0g/L琼脂粉并附加不同浓度的IBA和NAA的生根培养基中进行平行试验,具体是:先暗培养7d后,再转入到50~60μmol·m–2·s–1,12~14h/d进行光照培养30d。各组生根效果见表2。
表2
由表2可见,随着IBA和NAA浓度的提高,杜梨试管苗生根率逐步升高,且在2.0mg/L时达到最高,该浓度下IBA和NAA两种生长素下诱导杜梨生根率分别为34.2%和15.1%。IBA对杜梨的生根效果优于NAA,0.5mg/L的IBA处理,可以得到4.4%的生根率,但这一浓度下NAA的诱导生根率为0。2.0mg/L的NAA诱导率仅为相同浓度IBA诱导率的44.2%。从生根条数来看,1.5mg/L的IBA诱导生根最多,达4.4条,0.5mg/L的IBA诱导生根最少,仅有2.1条,其他处理生根率介于二者之间。从平均根长来看,NAA诱导的根较短,IBA诱导生根相对较长。
实施例3:NAA与IBA复合处理对杜梨生根的影响。
本实施例基于MS增殖培养基培养25-35d获得的健壮试管丛生苗,试管苗的苗高1cm~3cm。
愈伤诱导培养基
1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA
1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA
生根培养基
1/2MS+15g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L IBA
1/2MS+15g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L IBA
试验方法:
将所述的健壮试管苗分成4组,分别在1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉并附加不同浓度的NAA的愈伤组织诱导培养基上暗培养7d,再转到1/2MS+15g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉并附加不同浓度IBA的生根培养基中培养25-35d。培养条件为:培养温度,白天温度25±2℃,晚上20±2℃。光培养阶段,50~60μmol·m–2·s–1,12~14h/d。各处理生根效果见表3。
表3
处理 | NAA(mg/L) | IBA(mg/L) | 生根率(%) |
1 | 1.5 | 1.5 | 47.6 |
2 | 1.5 | 2.0 | 53.2 |
3 | 2.0 | 1.5 | 68.9 |
4 | 2.0 | 2.0 | 61.3 |
表3可见,处理3生根率最高,达到68.9%,其次是处理4,达到61.3%,处理1效果相对较差,达到47.6%。与表1相比,先诱导愈伤再诱导生根,生根率大幅提高,又以在添加2.0mg/L NAA的愈伤组织培养基上先在诱导愈伤,再诱导生根,效果优于添加1.5mg/L NAA的效果。在添加1.5mg/LNAA的愈伤诱导培养基上培养7天,再分别转入添加IBA的生根培养基中培养,IBA浓度升高,生根率稍有升高。而在NAA2.0mg/L的愈伤组织诱导培养基中培养,再转入生根培养基中培养,随着IBA浓度的提高,生根率稍有下降。
实施例4:不同驯化方式对杜梨试管苗移栽成活的影响。
本实施例基于生根培养基培养25-35d获得的具根试管苗,试管苗的苗高2cm~5cm,5-10片叶。
试验方法:
将所述的具根试管苗分成8组,其中4组进行三角瓶内敞口3天炼苗,再移到基质驯化25d,在基质驯化阶段依据叶片保留数量分为4组,保留叶片数分别为3、4、5和大于等于6。另外4组直接进行基质移栽驯化,同样依据叶片保留数3、4、5和大于等于6片分为4组。敞口驯化阶段,每瓶加水10ml,然后取出洗净培养基,移入泥炭土:珍珠岩=4:1的基质中,扣塑料薄膜,外加盖遮阳网,驯化30d。各处理成活率结果见表3。
表4
表4可见,试管苗敞口驯化3天后,再进行基质移栽炼苗25天,成活率高于试管苗直接移栽基质驯化,较直接移栽驯化高出8%-36%,并且基质移栽时叶片留6片以上,差异更明显。从基质移栽选留叶片数量来看,叶片留4片,移栽成活率最高,而留叶数量在6片以上,成活率显著降低,较4片叶低10%-14%。
实施例5:
MS启动培养基为:MS培养基+25~35g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉;
MS增殖培养基为:MS+0.3mg/l6-BA+0.1mg/l NAA+30g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
愈伤组织诱导培养基:1/2MS培养基+1.5mg/l NAA+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
生根培养基为:1/2MS培养基+2.0mg/l IBA+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
将杜梨新梢的幼茎段作为外植体,流水冲洗2h,剪取3~4cm带芽茎段40段,在超净工作台上进行外植体消毒,先以75(v/v)%酒精消毒30s,再用0.1wt%升汞消毒5min,无菌水漂洗5次,切成2~3cm的茎段,接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基,在25±2℃、50~60μmol·m–2·s–1、12~14h/d光照培养30d得到无根苗;
将无根苗接种于MS增殖培养基上,在25±2℃、50μmol·m–2·s–1、14h/d光照下培养,进行芽的诱导与快速增殖,30d得到试管丛生苗;
将增殖培养得到试管丛生苗,切分成1cm~3cm的茎段,转入1/2MS愈伤组织诱导培养基中,在白天25±2℃,夜间20±2℃的温度下暗培养7d;
经愈伤组织诱导的试管苗茎段,转入生根诱导培养基,在白天25±2℃,夜间20±2℃的温度光照强度50μmol·m–2·s–1,14h/d光照中培养30d,获得完整的试管植株。
将获得完整植株的试管苗,去除封口膜,敞口炼苗3d,转入栽培基质,浇足水后塑料薄膜覆盖10d,再加盖一层遮阳网,保湿控温保存,白天据天气情况掀膜通风3-5h,叶面喷水1-2次,防止失水萎蔫。10d后去除塑料薄膜,保留遮阳网,根据基质干湿情况适当浇水,20d后可去除遮阳网。
此方法生根率61-69%,试管苗成活率88-91%,培育周期为130d。
Claims (10)
1.一种杜梨组培快繁方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)外植体的消毒:将杜梨带腋芽的幼茎作为外植体,切段,消毒,无菌水冲洗;
(2)芽的诱导:将经上述处理的外植体切成单芽茎段,接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基,光照培养25~35d得到无根苗;
(3)试管苗增殖:将无根苗接种于MS增殖培养基上,光照培养25~35d得到试管丛生苗;
(4)生根诱导:
(4a)愈伤组织诱导:选取健壮的1~3cm高的试管丛生苗切分后转入愈伤组织诱导培养基中,暗培养7d,诱导产生愈伤组织;
(4b)诱导生根:将上述获得的具有愈伤组织的试管苗,转入生根诱导培养基中,光照培养25~35d获得生根的试管植株;
(5)炼苗移栽:
向生根的试管植株三角瓶中加水5~10ml,敞口炼苗2~3天,取出组培苗,洗净培养基,每株留叶2~3片,移入泥炭和珍珠岩基质中,加盖遮阳网,继续炼苗20~25d,然后移栽定植。
2.根据权利要求1所述的杜梨组培快繁方法,其特征在于,步骤(1)中,对杜梨带腋芽的幼茎用流水冲洗1~2h,剪取3~4cm带芽茎段,在超净工作台上先以75(v/v)%酒精消毒30s,再用0.1wt%升汞消毒5min,无菌水漂洗4~5次。
3.根据权利要求1或2所述的杜梨组培快繁方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的幼茎为春季萌发的新梢幼茎。
4.根据权利要求1所述的杜梨组培快繁方法,其特征在于,步骤(2)和(3)中,光照培养条件为:25±2℃、50~60μmol·m–2·s–1、12~14h/d。
5.根据权利要求1所述的杜梨组培快繁方法,其特征在于,步骤(4a)中,暗培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间温度为20±2℃;步骤(4b)中,光照培养条件为:白天温度为25±2℃,夜间温度为20±2℃,光照强度为50~60μmol·m–2·s–1,每天光照12~14h。
6.根据权利要求1所述的在杜梨组培快繁生根培养中的快繁育苗方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的不含任何外源植物激素的MS启动培养基为:MS培养基+25~35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉。
7.根据权利要求1所述的在杜梨组培快繁生根培养中的快繁育苗方法,其特征在于,步骤(3)中,所述的MS增殖培养基为:MS培养基+0.3~0.6mg/L6-BA+0.1~0.6mg/LNAA+25-35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
8.根据权利要求1所述的在杜梨组培快繁生根培养中的快繁育苗方法,其特征在于,步骤(4a)中,所述的愈伤组织诱导培养基为:1/2MS培养基+0.5~2.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
9.根据权利要求1所述的在杜梨组培快繁生根培养中的快繁育苗方法,其特征在于,步骤(4b)中,生根诱导培养基为:1/2MS培养基+0.5~2.0mg/LIBA+15g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉,pH5.8。
10.根据权利要求1所述的在杜梨组培快繁生根培养中的快繁育苗方法,其特征在于,步骤(5)中,生根的试管植株生在三角瓶中,加水5~10ml,去除封口膜,先进行2~3d的敞口炼苗即一次炼苗,取出组培苗,洗净培养基,每株留叶2~3片,移入泥炭和珍珠岩基质中,加盖遮阳网进行二次炼苗20~25d,然后移栽定植。
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