CN101965797B

CN101965797B - 在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法

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Publication number: CN101965797B
Application number: CN2010105180322A
Authority: CN
Inventors: 李晓刚; 蔺经; 杨青松; 王宏伟; 常有宏
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2030-10-25
Also published as: CN101965797A

Abstract

本发明提供了一种在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，包括外植体的消毒、芽的诱导、继代增殖、生根诱导，其特征在于：在继代增殖过程中，相间进行试管苗复壮培养，然后再选取健壮的1cm～3cm高的试管苗转到生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株，所述的复壮培养采用的是不含任何外源植物激素的启动培养基壮苗。本发明的方法快速、高效，成本低，便于推广，遗传稳定性好，培养过程中玻璃化比例低，增殖系数维持在较高水平，适用于蔷薇科植物组培快繁。

Description

在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法

技术领域：

本发明涉及组织培养的植物快繁技术，具体属于一种蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法。

背景技术：

组织培养是将植物体的一部分接种在合成培养基上，使其按照预定目标生长发育成新植株。由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。因此，近年来组织培养及快繁技术越来越多地应用于种苗繁殖生产。此外，随着现代分子生物技术的研究深入，离体培养又是细胞无融合生殖、遗传转化等技术的必备手段，越来越多的植物离体培养获得成功，离体培养技术已成为现代植物生物技术必不可少的研究手段，在生物学和农林科研以及生产中发挥了巨大的作用。

离体培养能否成功，还受基因型、培养基类型、激素种类及浓度配比等多种因素影响。培养过程中试管苗还易出现污染、褐化、玻璃化及顽拗等现象，严重阻碍着植物细胞全能性的实现和离体培养技术的广泛应用。尤其是试管苗玻璃化，表现为叶片和嫩稍呈透明或半透明水浸状，不能正常生长和增殖，严重影响了试管苗有效增殖系数，严重影响了试管苗质量，造成人、财、物的极大浪费。一直以来，试管苗污染、褐化和玻璃化被认为是组织培养三大主要限制因素，试管苗顽拗现象，也逐渐受到重视。具体表现为植物细胞、组织和器官在离体条件下对培养操作缺乏或丧失反应性，在非洲菊、梨等多种植物材料培养上均有报道，连续培养多代后，增殖系数大幅降低或不能增殖，在黄冠梨上则表现为增殖系数降低，玻璃化程度加重，我们在豆梨离体培养中也发现有相同的趋势。

研究认为，玻璃化苗是在芽分化启动后的生长过程，碳、氮代谢和水分发生生理性异常所引起的。培养基类型、碳源种类及含量、琼脂浓度、活性炭等因素对试管苗玻璃化的产生均有一定影响。对大多数植物来说，细胞分裂素浓度过高，高温、高湿，光照不足等因素均易导致玻璃化苗产生。而在香石竹、梨、非洲菊等作物上还发现随着继代次数的增加，愈伤组织和试管苗体内积累过量的细胞分裂素，玻璃化程度不断升高。继代培养最初几代玻璃化苗很少，随着继代次数的增加，玻璃化苗的比例越来越高。

针对以上玻璃化苗的产生原因，降低玻璃化常用措施主要有：降低培养基中细胞分裂素和赤霉素浓度，添加低浓度多效唑、矮壮素等生长抑制物质；控制适宜的培养温度，避免温度过高；使用透气性好封口材料，改善培养容器的痛风换气条件，降低容器内湿度；适当增加培养基琼脂浓度，降低培养基的水势；增加自然光照；控制继代次数。虽然这些措施在一些植物培养过程中，对试管苗玻璃化起到较好的控制作用，但是由于不同作物出现玻璃化的原因并不相同，对应的预防措施也不一致。有些控制措施如降低细胞分裂素，增加活性炭、琼脂的用量，还会显著降低增殖系数，影响增殖效果。因而，有必要针对不同作物展不相应的研究，形成有针对性的行之有效的防控措施。

蔷薇科植物在地球上分布极为广泛，其中有些为重要的果树，例如桃、李、杏、梅、苹果、梨、枇杷等，有些为很好的观赏植物，如绣线菊、绣线梅、蔷薇、月季、海棠、梅花、樱花和白鹃梅等；有些入药。目前，本科许多植物建立起了组培快繁体系，但在快繁过程中，在苹果、桃、草莓、梨、月季等植物上均有玻璃化苗报道，并且有着相近的形成机制。

发明内容：

本发明的目的在于：针对蔷薇科植物在组培快繁体系快繁过程中均有玻璃化苗的实际问题提供一种新的多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法。

本发明的目的是这样实现的：一种在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，包括外植体的消毒、芽的诱导、继代增殖、生根诱导，其特征在于：在继代增殖过程中，相间设置试管苗复壮培养，然后再选取健壮的试管苗转到生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株，所述的试管苗复壮采用的是不含任何外源植物激素的启动培养基进行培养，具体步骤如下：

(1)外植体的消毒：将蔷薇科带腋芽的幼茎作为外植体，切段，消毒，无菌水冲洗；

(2)芽的诱导：将经上述处理的外植体切成单芽茎段，接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～30d得到无根苗；

(3)继代增殖：将上述无根苗分别接种在MS增殖培养基上，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d的环境下光照培养20～30d，形成正常增殖的丛生试管苗，切分后重复继代增殖；

(4)试管苗复壮培养：经过1～4次继代增殖后的丛生试管苗切割分株，接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基，在25±2℃，1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～35d，获得复壮试管苗；

(5)将复壮的试管苗重新接种在MS增殖培养基上按照步骤3的培养条件，继代培养，再将丛生试管苗分株转入生根诱导；或直接将至少经过一次试管苗复壮培养的复壮试管苗转入生根诱导；

(6)生根诱导：从转入生根诱导的试管苗中选取1cm～3cm高的健壮苗转入生根诱导培养基中，在25±2℃、暗培养7d～10d后，再转入到1500～2000Lux，12～14h/d光照培养，25～35d，获得完整试管植株；所述1cm～3cm高的健壮试管苗选自转入生根诱导的由丛生试管苗分株后的试管苗，或选自转入生根诱导的复壮试管苗。

在本发明中，所述的在继代增殖过程中相间设置试管苗复壮培养是指：在多次继代增殖过程中，至少包括一次试管苗复壮培养，采用两次或两次以上试管苗复壮培养时，相邻的试管苗复壮培养之间应该设置1～4次继代增殖培养。

在本发明中，采用两次或两次以上试管苗复壮培养时，相邻的试管苗复壮培养之间应该设置1～2次继代增殖培养。

在本发明中，所述的外植体的消毒是指：对蔷薇科带腋芽的幼茎用流水冲洗1h～2h，剪取3cm～4cm带芽茎段，在超净工作台上先以75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒5min，无菌水漂洗4～5次。所述的幼茎优选春季萌发的新梢幼茎。

在本发明中，所述的不含任何外源植物激素的MS启动培养基为：MS培养基+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；所述的MS增殖培养基为：MS+0.3～0.6mg/L6-BA+0.1～0.6mg/L NAA+25-35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH 5.8；所述的生根培养基为：1/2MS培养基+0.5～2.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH 5.8。

本发明的优点在于：

(1)缩短了豆梨选优育苗的周期。以梨树为例，目前南方主产区梨主要采用豆梨品种为砧木，都是采用实生播种后，2年后再进行嫁接。由于种子后代基因具有高度杂合性，很难对筛选出优质抗生单株进行大规模生产。本发明可以大大缩短豆梨育苗周期，并且可以选择优良单株或类型进行大规模工厂化生产。

(2)降低了玻璃化苗比例，提高了繁殖系数。以豆梨为例，普通豆梨繁殖到能嫁接时周期长。本发明的繁殖速度快，苗生长整齐，单芽繁殖30d继代一次，且培养过程中玻璃化比例低，增殖倍数可达5～11倍。

(3)以茎段作为外植体，通过芽的增殖进行快速繁殖，保证了遗传的稳定性，并且取材容易，更新方便。

(4)具有普遍的适用性。本发明的技术方案在蔷薇科植物的快繁育苗中均能适用。

具体实施方式

实施例1：

不同配方的MS培养基在多次继代培养中对玻璃化率的影响

不含任何外源植物激素的MS启动培养基：

MS+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉。

增殖培养基：

1、MS+0.3mg/L 6-BA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

2、MS+0.3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

3、MS+0.3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

4、MS+0.6mg/L 6-BA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

5、MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

6、MS+0.6mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

7、MS+0.9mg/L 6-BA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

8、MS+0.9mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

9、MS+0.9mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

蔷薇科植物

豆梨，采集豆梨春季萌发的新梢幼茎。

试验方法

将取豆梨新梢，去叶片，用流水冲洗1h-2h，剪取3cm-4cm带芽茎段，在超净工作台上进行外植体消毒，先以75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒5min，无菌水漂洗4-5次。通过启动培养基在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～30

d得到无根苗备用。

采用所述的9种培养基对所述的无根苗进行分组平行试验，6-BA选用0.3、0.6和0.9mg/L三个浓度梯度，NAA设0、0.2和0.5mg/L三个浓度梯度，完全区组设计。具体过程是：将无根苗接于增殖培养基，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培养，20～30d一代，连续增殖培养三代，每代的试验数据记载于表1。

表1

由表1可见，随着6-BA和NAA浓度的升高，初代增殖培养增殖系数呈逐步增高的趋势，最高的为处理8(0.9mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)，增殖系数达7.8。6-BA在0.9mg/L浓度下，NAA浓度进一步升高，增殖系数又呈下降趋势。随着继代次数的增加，增殖系数呈下降趋势，并且6-BA浓度越高，下降越明显，处理8继代2代和3代增殖系数分别为2.6和2.2，较一代分别下降了66.67％和71.79％。连续继代培养下，处理5(0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)增殖系数虽然较初代培养有所下降，仍达4.8和3.8，高于其它各处理。

从玻璃化苗比例来看，采用低浓度6-BA的处理，在初代增殖培养中均没有玻璃化苗出现，在6-BA达到0.9mg/L时，有0.2-1.3％的玻璃化苗出现。在2次和3次继代培养中，玻璃化苗比例大幅提高，且激素浓度越高，玻璃化苗比例增加越大，尤其3次继代培养后，处理8和9玻璃化苗比例更是高达65.8％和79.5％。6-BA在0.3mg/L水平下，直到3次继代，才有不足2％的玻璃化苗出现。可见，高浓度的激素水平，虽然有利于初次增殖培养高增殖系数的获得，但在连续继代培养中又容易导致增殖系数的降低和大量玻璃化苗的出现。

实施例2：

不同类型的培养基在多次继代培养中对玻璃化率的影响

本实施例基于实施例1获得的无根苗。

基本培养基

1、MS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+3％蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

2、AS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+3％蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

3、NN69+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+3％蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

4、WPM+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L+3％蔗糖+5.0g/L琼脂粉。

试验方法与实施例相同，区别在于连续增殖培养两代，每代的试验数据记载于表2

表2

由表2可见，不同培养基对豆梨增殖和玻璃化存在一定差异，从连续2代增殖培养结果来看，MS和AS差异较小，初次继代培养以AS效果最好，增殖系数达到5.5，WPM效果相对较差，只有3.3。2次继代结果来看，MS效果最好，增殖系数为4.8，略高于AS培养基的培养效果，但远高于NN69和WPM培养效果。从2代玻璃化率来看，初代增殖培养，均没有玻璃化苗出现，但2次继代培养，均有玻璃化苗出现，且以AS最高，其次是WPM培养基，MS培养基相对最低，只有1.2％的玻璃化苗出现。

实施例3：

两种培养方式在多次继代培养中对玻璃化率的影响

本实施例基于启动培养获得的无根苗。

方式一：

增殖培养基：

MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉。

试验方法：

将无根苗接于增殖培养基，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培养，20～30d一代，连续增殖培养三代。

方式二：

增殖培养基：

MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉。

不含任何外源植物激素的MS启动培养基：

MS+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉。

试验方法：

将无根苗接种于增殖培养基，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培养，20～30d一代，转到启动培养基，相同培养条件下进行复壮培养一代，再接增殖培养基进行增殖培养一代。如此往复，培养3代。

本实施例的试验方法记录在表3中。

表3

由表3可见，方式一培养条件下，试管苗增殖系数逐渐降低，增殖3代增殖系数只有3.8，较初次增殖培养下降了29.63％，玻璃化率在2次继代中为1.2％，到3次培养时高达11.8％。方式二培养条件下，增殖系数基本没有改变，3次增殖培养的增殖系数在5.2-5.4之间，玻璃化苗在2次增殖培养中也有只现，为0.2％，3次增殖培养中为5.1％，两者相比。方式二的玻璃化率比方式一降低了56.8％，增殖系数却提高了39.47％。

实施例4：

不同配方的生根培养基对生根效果的影响

本实施例基于实施例3中方式二获得的第三代健壮试管苗，试管苗的苗高1cm～3cm。

生根培养基

1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L IBA

1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L IBA

1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L IBA

1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L IBA

1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L NAA

1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L NAA

1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA

1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA

试验方法

将所述的健壮试管苗分成八组，分别在1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉并附加浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L的IBA或NAA的生根培养基中进行平行试验，具体是：选取健壮的1cm～3cm高的试管苗置于1/2MS+1.5％蔗糖+5.0g/L琼脂粉并附加不同浓度的IBA或NAA中，先暗培养7～10d后，再转入到1500～2000Lux，12～14h/d进行光照培养25～35d。各组生根效果见表4。

表4

由表4可见，IBA对豆梨的生根效果优于NAA，IBA诱导培养下，IBA浓度在1.5mg/L达到最高，生根率为86.7％，平均生根条数也最多，为4.3条，并且须根较多。随着，浓度的进一步增加，生根率有所下降，2.0mg/L时下降到70.6％，平均生根条数了只有2.6条。NAA随着浓度的升高，诱导生根率也逐步升高，在2.0mg/L时最高，为52.2％，平均生根条数为3.9条，根较短粗。

实施例5

本发明的实施过程

各种培养基：

MS启动培养基为：MS培养基+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

MS增殖培养基为：MS+0.3～0.6mg/L 6-BA+0.1～0.6mg/L NAA+25-35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH 5.8；

生根培养基为：1/2MS培养基+0.5～2.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH 5.8。

选用植物：豆梨

实施方式

将豆梨新梢的幼茎段作为外植体，流水冲洗1～2h，剪取3～4cm带芽茎段40段，在超净工作台上进行外植体消毒，先以75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒5min，无菌水漂洗4～5次，切成2～3cm的茎段，通过启动培养基在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～30d得到无根苗；

将无根苗接种于MS增殖培养基上，在25±2℃、1500-2000Lux、12～14h/d光照下培养，进行芽的诱导与快速增殖，20～30d得到丛生试管苗。分株后继代培养；

继代2次以后再次得到丛生试管苗，分株后转入MS启动培养基中，在25±2℃，1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～35d，获得复壮试管苗。

复壮试管苗接再次种于MS增殖培养基上，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照下培养，进行芽的诱导与快速增殖，20～30d得到丛生试管苗。

将丛生试管苗分株后后，选取1～3cm高的健壮苗转入生根培养基，在25±2℃先进行暗培养7～10d后，再转入到1500～2000Lux，13h/d光照中培养，20～30d后，获得完整的试管植株。

本实施例的整个快繁育苗周期为180天，包括芽的诱导、三次继代增殖、一次试管苗复壮培养和生根诱导，皂苷过程较传统的采用单一连续增殖培养基的同代次增殖培养多用时30天。

以上各实施例不是对本发明的具体限制，鉴于豆梨(Pyrus caLLeryana Decne.)是蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomoideae)梨属(Pyrus)植物，是我国长江中下游地区梨树栽培中最主要砧木资源，与蔷薇科植物中苹果、桃、草莓、梨、月季等植物在组培中形成玻璃化有着相同或相似的形成机制，根据本领域的基本常识，在豆梨试管苗中的玻璃化率防控措施，本领域的普通技术人员完全可以用于本科的其他植物，也能获得相同或相似的效果。

Claims

1.一种在豆梨多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，包括外植体的消毒、芽的诱导、继代增殖、生根诱导，其特征在于：在继代增殖过程中，相间设置试管苗复壮培养，然后再选取健壮的试管苗转到生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株，所述的试管苗复壮采用的是不含任何外源植物激素的MS启动培养基进行培养，具体步骤如下：

a)外植体的消毒：将豆梨带腋芽的幼茎作为外植体，切段，消毒，无菌水冲洗；

b)芽的诱导：将经上述处理的外植体切成单芽茎段，接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～30d得到无根苗；

c)继代增殖：将上述无根苗分别接种在MS增殖培养基上，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d的环境下光照培养20～30d，形成正常增殖的丛生试管苗，切分后重复继代增殖；

d)试管苗复壮培养：经过1～4次继代增殖后的丛生试管苗切割分株，接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基，在25±2℃，1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～35d，获得复壮试管苗；

e)将复壮的试管苗重新接种在MS增殖培养基上按照步骤c的培养条件，继代培养后再将丛生试管苗分株转入生根诱导；或直接将至少经过一次试管苗复壮培养的复壮试管苗转入生根诱导；

f)生根诱导：从转入生根诱导的试管苗中选取1cm～3cm高的健壮苗转入生根培养基中，在25±2℃、暗培养7d～10d后，再转入到1500～2000Lux，12～14h/d光照培养，25～35d，获得完整试管植株；

所述的不含任何外源植物激素的MS启动培养基为：MS培养基+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉；所述的MS增殖培养基为：MS+0.3～0.6mg/L 6-BA+0.1～0.6mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH 5.8；所述的生根培养基为：1/2MS培养基+0.5～2.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH 5.8。

2.根据权利要求1所述的在豆梨多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，其特征在于：所述的在继代增殖过程中相间设置试管苗复壮培养是指：在多次继代增殖过程中，至少包括一次试管苗复壮培养，采用两次或两次以上试管苗复壮培养时，相邻的试管苗复壮培养之间设置1～4次继代增殖培养。

3.根据权利要求2所述的在豆梨多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，其特征在于：采用两次或两次以上试管苗复壮培养时，相邻的试管苗复壮培养之间设置1～2次继代增殖培养。

4.根据权利要求1所述的在豆梨多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，其特征在于：所述的外植体的消毒是指：对豆梨带腋芽的幼茎用流水冲洗1h～2h，剪取3cm～4cm带芽茎段，在超净工作台上先以75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒5min，无菌水漂洗4～5次。

5.根据权利要求4所述的在豆梨多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，其特征在于：所述的幼茎是指春季萌发的新梢幼茎。