CN111758576B - 一种桗栘离体快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组培领域，具体公开了一种桗栘离体快繁方法，包括外植体的选取、消毒、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽，其特征在于，初代培养基、增殖培养基和生根培养基均用MS培养基，其中含有1‑6mg/L6‑BA、0.2‑0.6mg/LNAA、2.0mg/LIBA、TDZ3mg/L或ZBA0.2mg/L，本发明以云南桗栘茎段为材料，研究消毒方法、基本培养基、植物生长调节剂的种类及浓度等因素对云南桗栘茎段快繁的影响，在此基础上，以云南桗栘叶片为材料，探究不同消毒方式、不同基本培养基、不同取样时间、不同植物激素种类和浓度组合对其植株再生的影响。建立了较为完善的云南桗栘离体培养快繁体系，为今后云南桗栘规模化生产提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于植物组培领域，具体涉及一种桗栘离体快繁方法。
背景技术
云南桗栘具有很高的市场前景，是一种优良的经济栽培树种，而传统的实生繁殖和嫁接繁殖存在受季节限制、成本高、效率低等缺点，因此常规繁殖技术制约了云南桗栘种植业和加工业的发展，成为云南桗栘市场推广的巨大障碍，组培快繁作为快速繁殖优良树种的重要手段，具有保持遗传稳定性，提高繁殖系数，节约成本，不受自然环境的限制等优点，并且可以做到计划生产出苗，较迅速地建立新的推广体系，适应现代化生产的需求。此外，要想进一步扩大市场推广，必须选育具有优良性状的种源。研究发现，不同种源的云南桗栘性状差别较大，蔷薇科果树由于培育周期长和基因高度杂合等特点，使用常规杂交育种方法进行种质改良具有很大局限性(丁燕,2008)。现代遗传转化技术可以打破常规育种的局限，通过基因的鉴定和分离、重组DNA技术的和离体培养再生技术等生物工程方法可以提高品种改良进程，提高育种效率(阎国华等,2001)。蔷薇科果树转基因研究缺乏高效的离体再生体系(Sehuerman,etal.,1993),而高效、稳定的离体培养再生体系的建立是植物外源基因能否成功转入的关键，是进行遗传转化研究的前提(Cruz-Hemandez,etal.,1998)。目前国内外没有对云南桗栘离体再生研究的报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种桗栘离体快繁方法，以用于构建桗栘的离体再生体系，解决现有技术中对桗栘栽培繁殖的制约。
本发明主要通过以下技术方案实现：
一种桗栘离体快繁方法，包括外植体的选取、消毒、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽，初代培养基、增殖培养基和生根培养基均用MS培养基，其中含有1-6mg/L6-BA、0.2-0.6mg/L NAA、2.0mg/L IBA、TDZ3mg/L或ZBA0.2mg/L。
进一步的，包括以下步骤：
(1)选取茎段为外植体；
(2)对外植体进行消毒；
(3)初代培养，所用培养基为MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA；
(4)继代培养，所用培养基为MS+4-6mg/L6-BA+0.3-0.5mg/LNAA；
(5)壮苗培养，所用培养基为MS+1-2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA；
(6)生根培养，所用培养基为1/2MS+2.0mg/LIBA。
进一步地，所述步骤(2)中外植体消毒的方法为茎段先用75％酒精浸泡10s,再用0.1％升汞浸泡12min消毒。
进一步地，所述步骤(1)中，选取的外植体为4月或12月采集的带腋芽茎段。
另外的本发明还提供了使用叶片作为外植的离体培养方法，体包括以下步骤：
(1)选取幼嫩叶片为外植体；
(2)对外植体进行消毒，然后保存于添加50mg/L AC+200mg/L VC+100mg/L PVP的无菌抗氧化溶液中。
进一步地，使用叶片作为外植体时，初代培养，所用初代培养基为MS+NAA0.6mg/L+TDZ 3mg/L。
进一步地，使用叶片作为外植体时，初代培养，所用培养基还可以为MS+6-BA 3mg/L+IBA0.2mg/L。
进一步地，使用叶片作为外植体时，初代培养，所用培养基还包括1g/LAC。
进一步地，使用叶片作为外植体时，所述步骤(2)中外植体的消毒方法为20％过氧化氢浸泡4min之后，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的升汞浸泡6min,用无菌水冲洗至少4次。
进一步地，所述外植体幼嫩叶片的采摘时间为4月份。
本发明的有意效果有：
1、本发明以云南桗栘茎段为材料，研究消毒方法、基本培养基、植物生长调节剂的种类及浓度等因素对云南桗栘茎段快繁的影响，在此基础上，以云南桗栘叶片为材料，探究不同消毒方式、不同基本培养基、不同取样时间、不同植物激素种类和浓度组合对其植株再生的影响。建立了较为完善的云南桗栘离体培养快繁体系，为今后云南桗栘规模化生产提供技术支撑。同时建立适用于云南桗栘遗传转化的再生体系，为云南桗栘遗传转化的开展打下基础，对云南的桗栘育种具有重要意义。
2、以茎段为外植体，探索外植体最适消毒方法以及初代培养、继代培养、壮苗和生根培养的最适培养基配方。结果显示，茎段先用75％酒精浸泡10s,再用0.1％升汞浸泡12min消毒效果最好，外植体存活率为80％。带腋芽茎段在初代培养基MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA中萌芽率最高，腋芽启动较早，茎轴伸长，叶片健壮为嫩绿色。组培苗在继代培养基MS+4mg/L6-BA+0.3mg/LNAA中长势最好，增殖系数为3.83,平均苗高为2.34cm。在培养基MS+6mg/L6-BA+0.5mg/LNAA中增殖系数最高为5.30，但苗较弱小，进行再次继代培养，可以明显改善组培苗的生长状况。壮苗培养配方为MS+2.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA时，组培苗生长高大，壮苗培养配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA时，组培苗生长粗壮。最适生根培养基为1/2MS+2.0mg/LIBA，生根率为38.89％，根平均长度为2.25。
3、以叶片为外植体，探索外植体消毒方法、取样时间、抗褐化剂对云南梯核叶片褐化的影响以及最适的叶片诱导培养基配方。研究显示，4月份采取幼嫩云南桗栘叶片，20％过氧化氢浸泡4min、0.1％的升汞浸泡6min,保存于添加50mg/LAC+200mg/LVC+100mg/LPVP的无菌抗氧化溶液中，接种到添加1g/LAC的培养基中，均能明显降低外植体的褐化。云南桗栘桗栘叶片在培养基MS+NAA0.6mg/L+TDZ3mg/L中，愈伤诱导率为98.89％。在培养基MS+6-BA3mg/L+ZBA0.2mg/L中能直接诱导叶片产生不定芽，不定芽诱导率为43.33％。
附图说明
图1为取材时期对外植体消毒的影响统计图；
图2为茎段初代培养效果图；
图3为继代培养MS+4.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA效果图；
图4为继代培养MS+4.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA效果图；
图5为第二次继代培养的实际效果图；
图6为壮苗培养：6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L效果图；
图7为壮苗培养:6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L效果图；
图8为生根培养效果图；
图9为叶片愈伤组织诱导效果图；
图10为叶片直接分化不定芽效果图。
具体实施方式
为了能够更加清楚地理解本发明的技术实质和有益效果，申请人在下面以实施例的方式作详细说明，但是对实施例的描述均不是对本发明方案的限制，任何依据本发明构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明的技术方案范畴。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述百分比，无特殊说明均为质量百分比。
实施例1
一种桗栘离体快繁方法，包括外植体的选取、消毒、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽，具体为以下步骤：
(1)选取4月或12月采集的带腋芽茎段为外植体；
(2)对外植体进行消毒，茎段先用75％酒精浸泡10s,再用0.1％升汞浸泡12min消毒，然后移植到初代培养基中；
(3)初代培养，所用培养基为MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，得到愈伤组织转移至继代培养基中；
(4)继代培养，所用培养基为MS+4-6mg/L6-BA+0.3-0.5mg/LNAA，继代培养后得到了不定芽，然后再次移植进行壮苗培养；
(5)壮苗培养，所用培养基为MS+1-2mg/L6-BA+0.3mg/LNA，壮苗培养后进行生根培养；
(6)生根培养，所用培养基为1/2MS+2.0mg/LIBA。
生根培养后，可以按照常规的方法进行炼苗和移栽。
实施例2
一种桗栘离体快繁方法，包括外植体的选取、消毒、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽，具体为以下步骤：
(1)选取4月份采摘的幼嫩叶片为外植体；
(2)对外植体进行消毒，消毒方法为20％过氧化氢浸泡4min之后，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的升汞浸泡6min,用无菌水冲洗至少4次，然后保存于添加50mg/LAC+200mg/LVC+100mg/LPVP的无菌抗氧化溶液中，储存时间不超过24小时。
(3)初代培养，所用初代培养基为MS+NAA0.6mg/L+TDZ3mg/L+1g/LAC。
初代培养获得愈伤组织，其继代培养，以及生根培养，可以采用实施例1中的配比，也可以参考，蔷薇科植物的一些植物组培配比，如专利CN201010518032.2在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法。
实施例3
一种桗栘离体快繁方法，包括外植体的选取、消毒、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽，具体为以下步骤：
(1)选取4月份采摘的幼嫩叶片为外植体；
(2)对外植体进行消毒，消毒方法为20％过氧化氢浸泡4min之后，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的升汞浸泡6min,用无菌水冲洗至少4次，然后保存于添加50mg/LAC+200mg/LVC+100mg/LPVP的无菌抗氧化溶液中，储存时间不超过24小时。
(3)初代培养，所用培养基为MS+6-BA3mg/L+ZBA0.2mg/L+1g/LAC。
本实施例，初代培养即可获得愈伤组织与不定芽，可进一步进行继代培养，也可以将不定芽移植进行生根培养，继代培养以及生根培养，可以采用实施例1中的配比，也可以参考，蔷薇科植物的一些植物组培配比，如专利CN201010518032.2在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法。
实验验证
1.1材料
供试材料来自西南林业大学树木园(103.04°N、23.96°W)云南桗栘资源收集圃，来自楚雄的云南桗栘的幼嫩茎段和叶片为材料。
1.2试验方法
1.2.1外植体消毒
1.2.1.1茎段外植体消毒试验
选取健康无病害的云南桗栘幼嫩茎段，将其放入密封袋中，迅速带回实验室，置于4℃冷藏2小时。将采取的云南桗栘的幼嫩茎段进行去叶处理，并保留叶柄基部0.3cm，用小刀将茎段切成2～3cm小段，确保中间段至少两个腋芽，然后用流水冲洗50-60min。将冲洗好的茎段置于无菌烧杯，放到超净工作台中。首先使用75％酒精进行消毒处理，再使用0.1％升汞消毒，75％酒精设10、20、30s三个梯度，0.1％升汞设8、10、12min三个梯度，共9个搭配对茎段进行消毒灭菌处理。消毒期间充分摇晃烧杯，确保茎段充分接触消毒液，消毒之后，用无菌水冲洗至少三次，用纸将多余水分擦净，用小刀将茎段的褐化部位和顶芽去掉，并确保每个茎段保留至少两个腋芽，最后将茎段垂直接种于不含植物生长调节剂的MS培养基中，每种处理10瓶，每瓶接种2个外植体，重复3次，每隔5d观察外植体的污染情况及生长状态，20d后统计污染率、褐化率、存活率等指标，筛选出最佳的消毒体系。
1.2.1.2叶片外植体消毒试验
将采取的云南桗栘的幼嫩叶片用流水冲洗50～60min，将冲洗好的叶片置于超净工作台中，进行消毒处理，研究不同的消毒处理对云南桗栘叶片培养的影响。20％过氧化氢设2、3、4min三个梯度，0.1％升汞设6、8、10min三个梯度，共9种消毒处理方式。消毒时充分摇晃烧杯，最后用无菌水将残留的升汞冲洗干净，用无菌纸将多余水分擦净。使用无菌小刀将叶片的边缘去掉，切成1.0cmx1.0cm大小的方块，每种处理10瓶，每瓶接种3个，重复3次，每隔5d观察外植体的污染情况及生长状态，20d后统计污染率、褐化率、存活率等指标，筛选出最佳的消毒体系。
1.2.2抑制外植体褐化
1.2.2.1取样时间对云南桗栘褐化的影响
在筛选出最适消毒处理的基础上，分别于4、6、8、10、12月采取一次云南桗栘的叶片，采样时间均在下午2点，同样利用2.1中的方法将叶片进行处理，最后接种到添加3mg/L6-BA、0.6mg/LIBA的MS培养基中，统计不同采样时间外植体的污染率、褐化率、愈伤诱导率，筛选出最适采样时间。
1.2.2.2基本培养基对云南桗栘褐化的影响
将经过消毒处理的外植体分别接种到添加3mg/L6-BA、0.6mg/LIBA的MS、1/2MS、WPM三种不同的基本培养基上进行培养。暗培养20d后转接到新的培养基上进行光照培养。每种处理10瓶，每瓶接种3个，重复3次，每隔5d观察记录一次，30d后统计外植体的生长状态，筛选出最佳的基本培养基。
1.2.2.3不同抗褐化剂对云南桗栘褐化的影响
在叶片的初代培养过程中，伴随着褐化现象的发生。采用以下方式以减缓桗栘叶片褐化。
第一步：外植体消毒后保存于添加了
50mg/LAC+200mg/LVC+100mg/LPVP的无菌抗氧化溶液中。
第二步：将外植体分别接种于1g/LAC、200mg/LVC、300mg/LPVP培养基中。
设对照试验CKl与CK2，分别进行不进行任何防褐化处理与只进行第一步防褐化处理两组试验。每种处理10瓶，重复3次，每隔5d观察记录一次，接种30d后统计叶片的褐化率与愈伤率。
1.2.3茎段初代培养
根据已报道文章，选择MS、WPM、B5三种基本培养基和6-BA、NAA两种激素，采用三因素三水平L9(33)的正交试验设计，共进行9个处理。将消毒后的茎段分别接种于不同配方的初代培养基进行诱导，每种处理接种10瓶，每瓶3个茎段，3次重复，观察45d内不同配方培养基上外植体的生长情况，筛选出最适培养基。
1.2.4继代培养
待腋芽诱导培养基中的外植体长至约2～4cm左右时，用小刀将生长状况较好且相近的小芽切下，转接至不同浓度激素配比的继代培养基中。本阶段试验选择6-BA、NAA,分别设3个浓度梯度，共9个处理。每种处理接种5瓶，每瓶2个茎段，3次重复，每隔几天进行记录观察，45d后统计不同激素配比培养基中组培苗的生长与增殖情况，筛选出最适增殖培养基。
1.2.5壮苗与生根培养
待芽增殖到一定数量时，将高度在2～3cm，生长健壮且生长状况较为相近的不定芽切下，接种到不同6-BA、NAA浓度配比的MS培养基上进行壮苗培养，待稍微木质化后将其接种到生根培养基中。生根培养基选择添加0.2g/L活性炭的1/2MS培养基，不同浓度组合的NAA和IBA。每种处理接种5瓶，每瓶2个茎段，3次重复，40d后统计组培苗的生根率，筛选出最适壮苗和生根培养基。
1.2.6愈伤组织的诱导
以MS为基本培养基，添加不同浓度的植物细胞分裂素和生长素，探究不同组合及浓度的植物生长调节对云南桗栘叶片愈伤诱导及再生不定芽的影响。将采取的云南桗栘叶片经过消毒处理后，接种到初代培养基上，在暗培养20d后转接到新的培养基上进行光照培养。每种处理10瓶，每瓶接种3个，重复3次，每隔5d观察记录一次，45d后统计外植体的愈伤诱导率、不定芽再生率，筛选出最适的激素配方。
1.2.7培养条件
培养基满足蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L,pH值5.8～6.0,121℃高压灭菌20min。培养温度为(25±2)℃，光照强度2000～3000lx,光照时间12h/d。在没有特殊说明的情况下，所有的试验的组培苗均在该培养条件下进行的。
1.2.8数据统计与分析
试验数据按照常规计算方式，采用Excel.2007和SPSS22.0等软件进行统计分析。
2.1外植体消毒
2.1.1不同消毒处理对茎段外植体的影响
75％酒精和0.1％升汞的不同消毒时间搭配对云南桗栘茎段的影响很大，观察发现污染的云南桗栘茎段在接种第3d,在腋芽处出现了真菌性污染。污染持续出现至第15d,其中在第4、5天外植体污染的数量最多，第8d之后污染数量逐渐减少。
如表2.1可知，当75％酒精消毒时间一定时，随着0.1％升汞消毒时长的增加，污染率显著降低，褐化率显著升高，同样当0.1％升汞消毒时间一定时，随着75％酒精消毒时长的增加，污染率呈现降低的趋势，褐化率出现升高的趋势，当0.1％升汞消毒时间为12min,75％酒精浸泡时间为30s时，外植体污染率为最低为1.11％,褐化率最高为58.89％，当0.1％升汞消毒时间为8min,75％酒精浸泡时间为10s时，外植体的污染率最高为62.22％,褐化率最低，仅有3.33％。当外植体先用75％酒精浸泡20s,再用0.1％升汞浸泡12min与先用75％酒精浸泡10s,再用0.1％升汞浸泡10min外植体的存活率均为63.33％,前者的污染率低，褐化率高，后者褐化率高、污染率低。从外植体的存活率来看，最佳消毒方为75％酒精浸泡10s、0.1％升汞浸泡12min,此时存活率最高为78.89％。
表2.1不同消毒处理对云南桗栘茎段的影响
注：不同小写字母表示差异显著(LSD分析，P<0.05)。下同。
2.1.2不同消毒处理对叶片外植体的影响
在组织培养过程中，不同消毒处理对外植体的影响很大，在筛选出茎段消毒处理的基础上，对叶片进行消毒处理，发现叶片褐化程度严重。因此，调整了消毒方法，经过预试验选择采用20％的过氧化氢和0.1％的升汞对云南桗栘叶片进行不同时间组合的消毒处理，如表2.2可知，当20％过氧化氢消毒时间一定时，随着0.1％升汞消毒时间的延长，污染率呈现下降的趋势，褐化率呈现上升的趋势。综合来看，当20％过氧化氢消毒4min,0.1％的升汞消毒8min时，消毒效果最好，外植体存活率最高。当0.1％升汞消毒时间为6min时，外植体的褐化率均较低，但此时污染率均较高，此时，当20％过氧化氢消毒时间为2min时，污染率高达56.67％。当0.1％升汞消毒时间一定时，随着20％过氧化氢消毒时间延长，存活率呈现上升的趋势，而当0.1％升汞消毒时间超过8min时，外植体褐化率显著增加。说明0.1％升汞消毒时间过长对云南桗栘叶片伤害较高，而20％过氧化氢消毒时间的对叶片褐化率的影响不显著，说明过氧化氢对云南桗栘叶片伤害较低。
表2.2不同消毒处理对云南桗栘叶片的影响
2.2外植体褐化的抑制
由于云南桗栘叶片含有大量酚类物质，在进行叶片再生的组培试验中出现了严重的褐化问题，尤其是初代培养时，严重的褐化现象阻碍了愈伤组织及不定芽的形成。因此探究一种有效抑制云南桗栘叶片褐变的方法是进行组培试验的前提。
本研究在得出的最佳消毒方法的基础上，探索取样时间、基本培养基、抗褐化剂对云南桗栘叶片初代培养中褐化的影响。
2.2.1取样时间对外植体褐化的影响
不同对云南梯移的灭菌效果、褐化程度以及愈伤组织的诱导率的影响不同，由图1可知，不同时间取样外植体的污染率为：8月＞6月＞10月＞12月＞4月，褐化率为10月＞12月＞8月＞6月＞4月，存活率为4月＞10月＞6月＞12月＞8月。本试验云南梯移采自云南昆明，其6月、8月为雨季，空气潮湿，细菌易繁殖，因此外植体污染率较高，而4月、12月为旱季，空气干燥，细菌较少，污染率低。外植体的褐化率随着时间的推移呈逐渐上升的趋势，到12月略为下降。说明春季萌发的新叶褐化率低，而随着云南梯移叶片生理年龄的增长，组织内的酚类化合物的含量逐渐增加，以及高温天气的影响提高了多酚氧化酶的活性，导致外植体褐化率逐渐增加。云南梯移叶片的最适取样时间在4月份，此时叶片污染率最低，褐化率最低，愈伤组织诱导率最高，取样时应避免高温以及阴雨天气。2.2.2基本培养基对云南桗栘叶片褐化的影响的选择是整个组织培养体系建立的关键因素。本试验根据前人的研究，选择了MS、WPM和1/2MS3种基本培养基。由表2.3可知，在MS培养基中云南桗栘叶片的褐化率最高，WPM次之，1/2MS最低。但研究发现，在培养后期1/2MS与WPM的愈伤诱导率较低，而MS培养基中，愈伤诱导率高达93.33％因此综合来看，最适基本培养基为MS,但需对基本培养基的选择进行进一步的筛选试验。
表2.3基本培养基对外植体的影响
2.2.3不同抗褐化剂处理对外植体褐化的影响
在筛选出最佳消毒方法、最佳采样时间、最适培养基的基础上，根据前人报道，探究不同抗褐化剂对外植体的影响。如表2.4所知，M2外植体的褐化率明显低于M1,说明将外植体消毒后保存于添加了50mg/LAC+200mg/LVC+100mg/LPVP的无菌抗氧化溶液中可以抑制外植体的褐化。且M3、M4、M5相较M2外植体的褐化率有所降低，并且M4即在第二步处理时向培养基中添加1g/LAC对云南桗栘叶片褐化的抑制作用最强，褐化率为13.33％,M5与M2相比褐化率降低，且差异不显著，说明在第二步中向培养基中添加PVP抑制外植体褐变的作用不大。添加抗褐化剂对外植体的愈伤率有一定的影响，所有的处理相较CK1愈伤率均有所下降，且M3、M4、M5处理与CK1相比，愈伤组织的诱导率显著降低，说明抗褐化剂在一定程度上影响了叶片愈伤组织的形成，若仅将外植体保存于抗氧化溶液中，对叶片愈伤组织的诱导率影响较小，但若进一步抗褐化剂添加在培养基中，叶片愈伤率会显著下降。其中在培养基中添加PVP,对叶片伤害最大，叶片的愈伤诱导率最低。
二步抑褐法可以有效抑制云南桗栘叶片的褐变，其中，第一步处理即将外植体保存于抗氧化溶液中在控制外植体褐变过程中起着十分重要的作用，在此基础上在培养基中添加抗褐化剂能进一步降低外植体褐化率，其中在培养基中添加1g/LAC效果最明显，外植体褐化率最低。综合分析，最佳防褐化方法为：将叶片冲洗消毒后保存于添加了50mg/LAC+200mg/LVC+100mg/LPVP的无菌抗氧化溶液中，然后将外植体接种到添加了1g/LAC的培养基中。
表2.4不同抗褐化剂处理对外植体褐化的影响
| 编号 | 处理方法 | 愈伤率(％) | 褐化率(％) |
| M1 | CK1 | 65.56±1.93a | 45.56±1.93a |
| M2 | CK2 | 61.11±1.92a | 27.78±1.92b |
| M3 | AC,1g/L | 52.22±1.92b | 11.11±1.92c |
| M4 | VC,100mg/L | 47.78±1.92d | 22.22±1.92bd |
| M5 | PVP,200mg/L | 22.22±1.92c | 18.89±1.92d |
注：CKl为没有进行抑褐化处理的对照组；CK2为只进行第一步抑褐处理。
2.3茎段初代培养
将经过消毒灭菌处理的茎段接种到不同浓度组合的NAA和6-BA的不同基本培养基上，不同处理对云南桗栘茎段腋芽诱导的影响不同。如表2.5,根据K值可知，最适激素配方为MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA,此时茎段萌芽率最高，为86.67％,茎段腋芽在10d左右叶片明显变大，15d左右茎轴伸长，新芽萌发(图2。对影响外植体萌芽率的三因素进行极差分析，根据r值可以看出对萌发率的影响依次是：6-BA>NAA>基本培养基。
由表2.6可知，在同一培养基中，萌芽率差异显著，而在不同培养基中，当6-BA浓度相同时，萌芽率差异不显著，进一步说明了基本培养基对萌芽率影响较小，而6-BA对萌芽率影响较大。且随着6-BA浓度的增加，萌芽率逐渐呈上升趋势，当6-BA浓度3mg/L时，外植体在基部萌发出侧芽，且茎轴明显伸长。NAA与基本培养基对萌芽率的影响较小，当NAA为0.1mg/L时，腋芽相对较小，启动较慢。
表2.5不同处理对萌芽率影响的极差分析
表2.6不同处理对萌芽的影响
| 编号 | 萌芽率(％) | 生长状况 |
| B1 | 22.22±1.92a | 叶小，启动慢，畸形，绿色，细弱 |
| B2 | 62.22±1.92b | 叶大，启动较早，粗壮 |
| B3 | 87.78±1.92c | 叶大，启动早，茎轴增长,基部萌发侧芽 |
| B4 | 65.56±1.93b | 叶小，启动慢，黄绿色， |
| B5 | 81.11±1.92cd | 叶大，黄绿色，基部萌发侧芽 |
| B6 | 24.44±1.93a | 叶小，黄绿色，细弱 |
| B7 | 75.56±1.93d | 叶小，启动慢，绿色，基部萌发侧芽 |
| B8 | 27.78±1.92a | 叶小，绿色，细弱 |
| B9 | 64.44±1.93b | 叶小，绿色 |
2.4继代培养
6-BA和NAA均对组培苗增殖过程中芽的增殖和伸长有一定的影响，如表2.7可知，芽的增殖系数随着6-BA浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，而与NAA的浓度成正比，6-BA较NAA对芽增殖的影响更显著。当在6-BA浓度为2-4mg/L范围内时，NAA对芽的伸长起着主效作用，平均苗高呈现随着NAA浓度的增加而显著增高，而当在6-BA浓度为6mg/L时，平均芽高显著降低，且NAA对芽高的影响不再显著，说明6-BA浓度过高不利于芽的伸长。就增殖过程中组培苗的生长情况来看，NAA的浓度与茎轴的生长质量有关，当NAA为0.3mg/L,茎相对较壮，浓度过高茎段会出现愈伤组织，但整体来说对组培苗影响不大。当6-BA浓度在2-4mg/L时，芽生长比较健壮，叶片较翠绿，然而当6-BA浓度达到6mg/L时，芽生长较缓慢且密集，叶片微黄且出现畸形。说明6-BA浓度偏高时，组培苗生长过密且矮小，不利于进行生根培养。综合增殖系数、平均苗高、生长状况三种表现来看，继代培养最适激素配方为：MS+4mg/L6-BA+0.3mg/LNAA(图3)。研究发现，将密集或长势不好的芽苗切下接种到新的培养基上，进行新一周期的继代培养，会促进芽苗的长势，增殖系数也明显提高(图4、5)。
表2.76-BA、NAA对云南桗栘增殖培养的影响
2.5壮苗与生根
在继代培养后，将密集的高约2-3cm的丛生芽切下进行壮苗培养，研究发现，壮苗培养基激素浓度不同，对组培苗的影响不同。如表2.8可知，编号Zl、Z2,细胞分裂素6-BA浓度相同为1mg/L,茎轴整体趋向粗壮发展，当NAA浓度为0.3mg/L时，组培苗长势健壮(图7),当NAA浓度为0.6mg/L时，基部出现愈伤。而编号Z3、Z4,6-BA浓度均为2mg/L,茎轴整体趋向细高发展，当NAA浓度为0.3mg/L,组培苗整体较高大，叶片繁茂(图6),当NAA浓度为0.6mg/L时，靠近培养基的叶片出现枯萎。
表2.8不同激素配方对壮苗的影响
在进行壮苗40d后，将培养基中长势较好的组培苗接种到生根培养基中进行生根培养。生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度IBA进行培养。接种45d后对生根情况初步统计发现(表2.9)，不添加IBA的1/2MS培养基没有诱导组培苗形成不定根，而添加IBA生根培养基均诱导组培苗产生不定根，提高IAB浓度可显著提高生根率，但同时对根的伸长有一定的抑制作用。最适生根培养基为：1/2MS+IBA2.0mg/L，此时生根率最高为38.89％(图8)。
表2.9IBA对生根的影响
| 生根 | 培养基配方 | 生根率(％) | 根平均长度 |
| G1 | 1/2MS | 0a | 0a |
| G2 | 1/2MS+IBA1.0mg/L | 16.67±3.34b | 3.48±0.09c |
| G3 | 1/2MS+IBA2.0mg/L | 38.89±1.92c | 2.25±0.04b |
2.6植物生长调节剂对云南桗栘叶片诱导的影响
2.6.1NAA和TDZ浓度组合对愈伤诱导的影响
不同植物调节剂对外植体的影响不同，如表2.10所示，在一定浓度范围内的NAA和TDZ的组合均可以诱导云南桗栘叶片产生愈伤组织。在0.2-0.6mg/L的范围内时，愈伤组织诱导率随着IBA浓度的增加呈现上升的趋势，愈伤组织的颜色也率随着IBA浓度的增加由浅黄色向深绿色逐渐转变。而随着TDZ浓度的增加,愈伤组织诱导率呈先上升后下降的趋势。尤其当TDZ浓度达到5mg/L时，愈伤组织诱导率显著下降，并且愈伤组织出现褐化现象。说明TDZ浓度过高，不适合云南桗栘愈伤组织的诱导，会使愈伤组织质地变的紧密，从而出现褐化现象。综合分析，愈伤组织最适激素配比为NAA0.6mg/L+TDZ3mg/L,愈伤诱导率为98.89％。
表2.10NAA和TDZ对叶片诱导的影响
2.6.2NAA和6-BA浓度组合对愈伤诱导的影响
研究发现，不同浓度组合的NAA和6-BA，也对云南桗栘叶片有较高的诱导率。如表2.11所示，在一定范围内，愈伤诱导率随着6-BA浓度的增加而呈现先上升后下降的趋势，当激素配比为：6-BA2mg/L+NAA0.6mg/L时，愈伤组织诱导率最高。在6-BA浓度2mg/L,NAA浓度为0.2-0.4mg/L时，发现有分化不定芽的趋势，然而6-BA浓度过高时，愈伤组织结构过于紧密，不适合不定芽的分化。
表2.11NAA和6-BA对叶片诱导的影响
2.6.3愈伤组织分化不定芽
本试验过程中碍于其他客观因素问题，并没有将云南桗栘外植体产生的愈伤组织进一步诱导分化不定芽。将初代培养基中产生的愈伤组织，接种到新的培养基中，通过调节生长素和分裂素的配比，来诱导愈伤组织分化不定芽。研究发现，愈伤组织在培养基中有一定程度的增殖，质地变的紧实。
2.6.4叶片直接分化不定芽
由于在NAA和6-BA的浓度组合中，云南桗栘叶片有直接分化不定芽的趋势，因此围绕6-BA展开了进一步研究。研究发现，6-BA与IBA的组合可以较好的诱导外植体直接分化不定芽。云南桗栘的叶片在接种10d左右时切口处有绿色芽点出现，20-30d时丛芽数量出现明显的增加，逐渐成簇。如表2.12所示，在一定范围内，随着6-BA浓度的增加，不定芽诱导率呈现逐步上升的趋势，而愈伤诱导率呈现先增加后降低的趋势。激素配方为6-BA3mg/L+lBA0.2mg/L时，不定芽诱导率最高，达43.33％,此时愈伤组织诱导率较低，仅为33.33％。当6-BA1mg/L+lBA0.6mg/L时，不定芽诱导率为0,说明当低浓度6-BA搭配高浓度IBA不适合不定芽的分化。
表2.126-BA和IBA对叶片诱导的影响
3结论与讨论
3.1结论
本研究以云南桗栘的茎段和叶片为材料，对云南桗栘离体快繁和再生体系的展开研究，得到结论如下：
在云南桗栘的茎段离体快繁的组培试验中发现，云南桗栘茎段的最佳消毒方式为：先用75％酒精浸泡10s,再用0.1％升汞浸泡12min。茎段初代培养最适配方为:MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。茎段继代培养的最适配方为:MS+4mg/L6-BA+0.3mg/LNAA。将长势不好的组培苗进行再次继代培养，可以明显改善组培苗的生长状况。高大型壮苗培养配方：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L,粗壮型壮苗培养配方：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L。生根培养最适配方为：1/2MS+IBA2.0mg/L。
抑制云南桗栘叶片褐化的最适方法:于4月份采取幼嫩的云南桗栘叶片，消毒时用20％过氧化氢浸泡4min之后，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的升汞浸泡6min，用无菌水冲洗至少4次，确保将残留在叶片表面的升汞冲洗干净。然后将其保存于添加了50mg/LAC+200mg/LVC+100mg/LPVP的无菌抗氧化溶液中，然后将外植体接种到添加了1g/LAC的培养基中。
云南桗栘叶片愈伤组织最适诱导配方：MS+NAA0.6mg/L+TDZ3mg/L。不定芽最适诱导配方为：MS+6-BA3mg/L+IBA0.2mg/L。
Claims (7)
1.一种桗栘离体快繁方法，包括外植体的选取、消毒、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽，初代培养基、增殖培养基和生根培养基均用MS培养基，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取茎段为外植体；
（2）对外植体进行消毒；
（3）初代培养，所用培养基为MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA；
（4）继代培养，所用培养基为MS+4-6mg/L 6-BA+0.3-0.5mg/L NAA；
（5）壮苗培养，所用培养基为MS+1-2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA；
（6）生根培养，所用培养基为1/2MS+2.0mg/L IBA。
2.根据权利要求1所述的一种桗栘离体快繁方法，其特征在于，所述步骤（2）中外植体消毒的方法为茎段先用75%酒精浸泡10s，再用0.1%升汞浸泡12min消毒。
3.根据权利要求1所述的一种桗栘离体快繁方法，其特征在于，所述步骤（1）中，选取的外植体为4月或12月采集的带腋芽茎段。
4.一种桗栘离体快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取外植体为幼嫩叶片；
（2）对外植体进行消毒，然后保存于添加50mg/L AC+200mg/L VC+100mg/L PVP的无菌抗氧化溶液中；
（3）初代培养，所用初代培养基为MS+NAA 0.6mg/L+TDZ 3mg/L或MS+6-BA 3mg/L+IBA0.2mg/L。
5.根据权利要求4所述的一种桗栘离体快繁方法，其特征在于，所述步骤（2）中外植体的消毒方法为20%过氧化氢浸泡4min之后，用无菌水冲洗2次，再用0.1%的升汞浸泡6min,用无菌水冲洗至少4次。
6.根据权利要求4所述的一种桗栘离体快繁方法，其特征在于，所述外植体的采摘时间为4月份。
7.根据权利要求4所述的一种桗栘离体快繁方法，其特征在于，所用培养基还包括1g/LAC。
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