CN115633640B - 一种美人蕉试管苗叶鞘不定芽再生的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种美人蕉试管苗叶鞘不定芽再生的方法及其应用，属于植物组织培养及生物技术领域。本发明以美人蕉种子萌发的无菌苗叶鞘为外植体，进行1‑3叶龄的叶鞘切取，然后接种在培养基中进行愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、不定芽的分化、不定芽的增殖、优化试管苗的生根培养以及试管苗的驯化移栽，最终不仅成功建立了大花美人蕉“墨红”试管苗叶鞘不定芽再生体系，而且取得了较高的再生率、较快的再生速度以及较好的移栽效果等。使用本发明的方法可以加速大花美人蕉“墨红”育种进程，为大花美人蕉“墨红”基因功能研究及转基因工作开展奠定基础，在美人蕉种质创新和新品种选育方面具有重要的应用价值。

Description

一种美人蕉试管苗叶鞘不定芽再生的方法及其应用

技术领域

本发明属于植物组织培养及生物技术领域，尤其涉及一种美人蕉试管苗叶鞘不定芽再生的方法及其应用。

背景技术

大花美人蕉(Canna×generalis Bailey)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的多年生草本植物，原产于美洲热带和亚热带地区，现已成为园林景观配植中应用广泛的花卉，因其花朵硕大、色泽艳丽，具有极高观赏价值。目前，我国大花美人蕉栽培品种多从国外引进，品种古老且较为单一，且大花美人蕉品种选育主要采用芽变选种、杂交选育和辐射育种等传统育种方法，这些传统的育种方法不仅影响了产量，还导致了品种退化现象明显，影响大花美人蕉的观赏价值，造成大花美人蕉育种现状难以满足日益增长的花卉市场的需求。组织培养技术是目前常用的高效繁殖手段，随着现代生物技术的快速发展，利用基因工程技术对植物性状进行改良从而实现定向育种已成为一种快速、高效的育种手段，被广泛应用于多种植物。目前应用于植物上的基因导入法主要是农杆菌介导的叶盘法，利用该法时由于共培养中农杆菌侵染、选择再生培养基中选择压、抗生素的作用以及继代培养等因素会导致转化外植体和非转化外植体的再生频率有不同程度的降低。因此，以叶盘法获得转基因大花美人蕉新品种的前提条件就是要建立一个高效稳定的叶盘再生受体系统，只有建立了稳定，高频的再生体系，才能构建较好的遗传转化体系，提高转化效率，获得转基因植株，进而对培育优良性状的大花美人蕉新品种具有重要意义。

目前，国内外许多研究学者有对大花美人蕉组培培养方面的报告，但在有关大花美人蕉进行愈伤诱导与增殖及分化不定芽植株再生的组织培养体系一直未真正建立，因而影响了以此技术为基础的大花美人蕉转基因技术体系的发展。同时大花美人蕉组织培养中离体繁殖存在的技术问题及缺陷有：幼胚培养存在后代分离、根茎培养愈伤难于分化、带芽根茎培养易褐化污染等问题，且涉及到美人蕉叶盘再生的研究未见报道，上述培养难以用于遗传转化体系的构建和基因工程育种中，限制了大花美人蕉遗传改良的应用。另外，农杆菌介导的叶盘法遗传转化技术为植物遗传转化研究的重要方法之一，且离体叶片经过脱分化再分化后形成的再生植株病毒少，生长健壮，可以为优良品种的筛选及遗传转化奠定一定的研究基础。虽然国内外研究者在美人蕉叶片离体高效再生方面鲜有报告，Mishra等（2015）报道了美人蕉以叶片为外植体愈伤组织诱导、分化再生的体系，但是该体系在含2.0mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA的BM培养基中诱导出少量叶片愈伤组织，愈伤经分化不定芽生根等环节，美人蕉再生植株的存活率为72.22%，但大约23%的叶片发黄，无法生长正常植株，发育正常植株再生率仅为49.22%，再生率仍低，无法满足后续的遗传转化需求。因此，建立大花美人蕉高效再生体系迫在眉睫，建立大花美人蕉“墨红”试管苗叶鞘不定芽再生对遗传转化研究具有重大意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种美人蕉试管苗叶鞘不定芽再生的方法及其应用。本发明以美人蕉种子萌发的无菌苗叶鞘为外植体，进行1-3叶龄的叶鞘切取，然后接种在培养基中进行愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、不定芽的分化、不定芽的增殖、优化试管苗的生根培养以及试管苗的驯化移栽，最终不仅成功建立了大花美人蕉“墨红”试管苗叶鞘不定芽再生体系，而且取得了较高的再生率、较快的再生速度以及较好的移栽效果等。使用本发明的方法可以加速大花美人蕉“墨红”育种进程，为大花美人蕉“墨红”基因功能研究及转基因工作开展奠定基础，在美人蕉种质创新和新品种选育方面具有重要的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种美人蕉试管苗叶鞘不定芽再生的方法，所述方法以美人蕉种子萌发的1-3叶龄无菌苗叶鞘为外植体，使用的不定芽增殖培养基组成为MS + 1.0-7.0 mg/L6-BA + 0.5-2.0 mg/L NAA + 0.1-0.5 mg/L TDZ/L+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖。

优选的，所述方法具体包括以下步骤：

（1）无菌苗叶鞘的准备：将消毒后的美人蕉种子播种于无菌苗萌发培养基中培养14-16d获得美人蕉无菌苗叶鞘；所述无菌苗萌发培养基的组成为MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.5mg/L NAA+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（2）愈伤组织的诱导：选取1-3叶龄的所述无菌苗叶鞘，切割成（0.8-1.2）cm×（0.8-1.2）cm大小，然后接种于愈伤组织诱导培养基中培养25-30d；所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS+6.0-8.0 mg/L 6-BA + 0-1.5 mg/L NAA+0.2-0.4 mg/L TDZ+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（3）愈伤组织的增殖：将所述诱导获得的愈伤组织切成（0.4-0.6）cm×（0.4-0.6）cm小块，然后转入愈伤组织增殖培养基中培养21-30d；所述愈伤增殖培养基的组成为：MS+1.5-3.5 mg/L 6-BA + 0.5-2.5 mg/L TDZ+0-0.5 mg/L IAA+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（4）不定芽的分化：将所述增殖获得的愈伤组织接种到分化培养基中诱导25-30d形成不定芽；所述愈伤组织分化培养基的组成为MS+0.5-2.0 mg/L 6-BA + 0-0.5 mg/LIAA+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（5）不定芽的增殖；将所述带有不定芽的愈伤组织切块放入不定芽增殖培养基中培养25-30d；所述不定芽增殖培养基的组成为MS + 1.0-7.0 mg/L 6-BA + 0.5-2.0 mg/LNAA + 0.1-0.5 mg/L TDZ+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（6）优化试管苗的生根培养：将所述增殖得到的不定芽接于优化生根培养基中培养25-30d得到生根苗；所述生根诱导培养基的组成为1/2MS + 0.5 mg/L NAA+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（7）试管苗的驯化移栽：将所述生根苗驯化5-7 d，然后移栽到温室中培养；所述驯化移栽的基质由草炭、有机肥和土按照（0.8-1.2）：（0.8-1.2）：（0.8-1.2）的重量比混合制成；所述有机肥为市售有机肥。

优选的，所述步骤（1）中选取的美人蕉种子是在9月下旬取自美人蕉种质资源圃的饱满成熟种子；所述无菌苗叶鞘的培养天数为15d。

优选的，所述步骤（2）中无菌苗叶鞘的叶龄是2叶龄，切割大小为1.0 cm×1.0 cm；所述愈伤组织诱导培养基中6-BA、NAA和TDZ的浓度分别为7.0 mg/L、0.5 mg/L以及0.25mg/L；所述培养具体为先暗培养13-15d，然后转入光/暗周期培养。

优选的，所述步骤（3）中愈伤组织的切割大小为0.5cm×0.5 cm；所述愈伤增殖培养基中6-BA、TDZ和IAA的浓度分别为3.0mg/L、1.5 mg/L以及0.1 mg/L；所述培养具体为先暗培养13-15d，然后转入光/暗周期培养。

优选的，所述步骤（4）中愈伤组织分化培养基中6-BA和IAA的浓度分别为1.0mg/L和0.1 mg/L。

优选的，所述步骤（5）中不定芽增殖培养基中6-BA、NAA和TDZ的浓度分别为6.0mg/L、1.5 mg/L 以及0.2 mg/L。

优选的，所述步骤（7）中生根苗的驯化时间为6 d；所述驯化移栽的基质由草炭、有机肥和土按照1：1：1的重量比混合制成；所述有机肥由贵州博施生物有机肥有限公司生产，肥料登记证号为黔农肥（2018）准字号1133号。

优选的，所述培养基的pH都为5.8-6.0，培养温度都为25±2℃，光照强度都为2000lx，光照周期都为光16h/暗8h。

本发明还提供了一种所述方法在美人蕉种质创新和/或新品种选育中的应用。

所述美人蕉为大花美人蕉，更有选的，所述美人蕉为大花美人蕉“墨红”。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

（1）本发明建立的大花美人蕉“墨红”试管苗叶鞘不定芽再生体系可应用于大花美人蕉“墨红”的遗传转化、新品种选育及优良品种繁殖之上。本发明中所选择品种大花美人蕉“墨红”的种子均可采摘于美人蕉种质资源圃。使用本发明中的方法，大花美人蕉“墨红”叶鞘愈伤组织诱导率为71.42%以上，愈伤组织的增殖率高达97.50%，增殖系数为3.75，分化率达88.00%，不定芽增殖率为100%，增殖系数可达18.00，生根率达100%，驯化成活率达98.33%。

（2）本发明中的方法取材方便，利用种子培养获得无组培苗菌材料，不受季节限制，可全年取材，且以种子作为外植体培养进行初代培养污染率远低于其他外植体，细胞分裂活跃，愈伤组织诱导率高，可达71.42%以上，可有效解决以大花美人蕉“墨红”外植体诱导愈伤低及污染率高的问题。本发明采用培养15d的叶鞘做为外植体进行愈伤诱导，在高浓度细胞分裂素刺激下，很快形成愈伤组织，愈伤组织均可分化不定芽，达到快速繁殖育苗的目的。

（3）在植物组织培养中，因为不同部位所含内源细胞分裂素与生长素的绝对含量和相对比例不同所致，所以在愈伤组织的诱导过程中，选择合适的外植体是非常重要的。在美人蕉组织培养中，根茎芽、茎尖、叶片作为外植体材料，取材方便，但这些外植体在诱导过程中出现褐化、污染严重及分化率低的问题，而且愈伤组织培养和分化需要分开采用不同的培养基分步培养，培养时间长，效率低。而本发明建立的大花美人蕉“墨红”试管苗叶鞘不定芽再生方法，利用叶鞘作为外植体，接种前无需消毒处理等繁琐步骤且不易污染，保障了试验结果成功率，能有效解决在诱导愈伤过程种外植体褐化严重等问题，且新鲜的嫩叶鞘能较好诱导出愈伤，提高愈伤诱导率并减少培养时间，提高繁殖效率。

（4）本发明于大花美人蕉“墨红”植物，利用均匀设计对6-BA、NAA和TDZ的配比进行了优化筛选，大花美人蕉愈伤组织的增殖率高达97.50%，可为后期遗传转化体系建立提供大量的侵染材料。本发明将1mg/L的6-BA、0.1 mg/L的IAA应用到愈伤组织不定芽分化中，分化率高达并且分化率达88.00%，解决了大花美人蕉“墨红”愈伤分化困难的问题，而且得到的分化的不定芽均可增殖，苗生长状态良好，可为美人蕉属植物其它品种提供技术参考。本发明将0.1 mg/L的IAA应用到愈伤组织不定芽分化中，有效降低了大花美人蕉植物的生产成本，且降低了再生苗变异的概率，可为后期美人蕉属其它品种的愈伤组织的分化研究提供一定的技术参考。本发明不定芽增殖培养基中，不定芽增殖系数高达18.00，可有效解决大花美人蕉“墨红”不定芽增殖系数低的问题，提高了大花美人蕉不定芽的增殖系数，可为后期美人蕉属植物不定芽增殖提供一定的参考价值。本发明方法操作步骤简便、快速、高效，不仅解决了大花美人蕉组织培养时愈伤分化困难、外植体褐化严重及增殖系数较低的技术瓶颈，而且利用均匀设计方法极大地缩短了配方筛选的时间及植株再生时间和育苗周期，对于大花美人蕉的遗传转化及基因工程育种具有重要意义，应用前景广阔。

（1）本发明用于大花美人蕉“墨红”的遗传转化、新品种选育及优良品种繁殖的应用上，可解决大花美人蕉“墨红”品种单一与退化严重现象及病害干扰等问题，有效缓解花卉市场的供需求矛盾，且为后期新品种选育研究奠定基础，培育的大花美人蕉新品种具有极高观赏价值和市场价值，开发利用前景广阔。

（2）本发明建立大花美人蕉“墨红”试管苗叶鞘不定芽高效再生体系，解决了大花美人蕉“墨红”愈伤分化困难的问题，分化的不定芽均可增殖，增殖系数高，可为后期美人蕉属植物不定芽增殖提供一定的参考价值，可以加速大花美人蕉“墨红”遗传改良育种进程，利用均匀设计筛选愈伤组织增殖配方大大缩减大花美人蕉配方摸索周期，对大花美人蕉的遗传转化和新品种选育具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中大花美人蕉“墨红”试管苗叶鞘不定芽再生体系建立过程，其中（A）为叶鞘愈伤组织诱导情况；（B）为愈伤组织增殖情况；（C-D）为愈伤组织分化产生不定芽增殖情况；（E-F）为不定芽在生根培养基上生长成苗的情况；

图2为本发明实施例1中大花美人蕉“墨红”再生苗驯化移栽10d时的生长情况。

实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。

实施例

本实施例中使用的大花美人蕉品种为“墨红”，参见文献：[1]黄国涛,欧阳底梅,向其柏,等.美人蕉属品种分类研究[J].南京林业大学学报(自然科学版),2005(04):20-24.[2]黄国涛,美人蕉属（Canna）植物引种与品种分类研究[D].南京林业大学,2005.）；本实施例提供的大花美人蕉“墨红”试管苗叶鞘不定芽再生方法包括以下步骤：

1）大花美人蕉“墨红”无菌苗材料的准备：

在超净工作台中，将于9月下旬取自美人蕉种质资源圃的饱满成熟种子经过表面消毒后播种于无菌苗萌发培养基中，在25±2℃培养室中培养15天，获得美人蕉无菌幼苗叶鞘待用；

所述无菌苗萌发培养基的组成为MS+1 mg/L 6-BA + 0.5mg/LNAA+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖，pH为5.8-6.0。

2）愈伤组织的诱导

将1）中获得的2叶龄无菌幼苗叶鞘切割成1.0 cm×1.0 cm大小，接种于附加不同浓度6-BA、NAA、TDZ的MS固体培养基上进行愈伤组织诱导，以MS为基础培养基，每个处理接种30个外植体，3次重复，培养温度为25±2℃，先避光培养14d，然后进行光/暗周期培养，其中光16h/暗8h，总培养时间为25-30 d。愈伤组织诱导培养的结果如表1所示。

表1 不同6-BA、TDZ和NAA浓度配比对叶鞘愈伤诱导的影响

注：小写字母代表P<0.05水平上差异显著

由表1可知，当6-BA、NAA和TDZ浓度分别为7.0 mg/L、0.5 mg/L和0.25mg/L时，愈伤组织诱导率为71.42%，显著高于其他组合。结果表明：MS+7.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L TDZ+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖是大花美人蕉叶鞘部位诱导愈伤组织的最佳培养基。

3）愈伤组织的增殖

取2）叶鞘诱导得到的大花美人蕉“墨红”愈伤组织，将生长健壮的愈伤组织切成约0.5 cm×0.5 cm大小，接种于附加不同浓度6-BA、TDZ、IAA的MS固体培养基上进行愈伤增殖，以MS为基础培养基，每次接种30块愈伤组织，重复3次，培养室温度为25±2℃，光/暗周期为光16h/暗8h，培养21-30天。愈伤组织增殖培养的结果如表2所示。

表2不同植物生长调节6-BA、TDZ和IAA浓度配比对愈伤增殖的影响

注：小写字母代表P<0.05水平上差异显著

比较不同浓度的6-BA和TDZ、IAA对大花美人蕉“墨红”愈伤组织增殖的效果，进行方差分析，结果表明：3.0 mg/L 6-BA +1.5 mg/LTDZ + 0.1mg/LIAA 的组合愈伤组织增殖率达到97.50％，增殖倍数达到最高为3.75，显著高于其它组合，且增殖较快，增殖效果较好，说明MS+3.0mg/L 6-BA + 0.1mg/L IAA+1.5mg/L TDZ+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖是大花美人蕉愈伤组织增殖的最佳培养基。

4)不定芽的分化

将3）中愈伤组织增殖得到的大花美人蕉“墨红”愈伤组织，切为0.5 cm×0.5 cm大小，接种于添加不同浓度的6-BA、IAA的分化培养基中进行培养，以MS为基础培养基，每次接种30块愈伤组织，重复3次，培养室温为25±2℃，光照强度为2000lx，光/暗周期为16/8 h，培养时间为25-30 d。不定芽分化培养的结果如表3所示。

表3不同植物生长调节6-BA和IAA浓度配比对愈伤分化的影响

比较不同浓度的6-BA、IAA对大花美人蕉“墨红”愈伤组织不定芽分化的效果，进行方差分析，结果表明：1.0 mg/L 6-BA + 0.1mg/L IAA的组合愈伤组织不定芽分化率达到88.00％，显著高于其它组合，且相互差异显著。其中单独添加6-BA时，愈伤组织分化率均为0，说明6-BA对分化率不显著，6-BA和IAA组合可显著促进愈伤组织分化不定，形成的愈伤组织分化的不定芽生长健壮，色泽鲜绿，叶片伸展，长势旺盛，可进行后续的生根壮苗培养。

5）不定芽的增殖

将4）中愈伤分化的不定芽，挑选生长健壮、长势一致的不定芽，接种于附加不同植物生长调节剂组合的培养基上，用于不定芽的增殖，以MS为基础培养基，每个处理10瓶，每瓶接种1株不定芽，重复3次，培养室温度25±2℃，光照强度2000lx，光周期16/8 h，培养25-30 d，不定芽的增殖结果如表4所示。

表4不同植物生长调节6-BA、NAA和TDZ对不定芽增殖响影响

注：小写字母代表P<0.05水平上差异显著

比较不同浓度的6-BA和TDZ、NAA对大花美人蕉“墨红”不定芽增殖的效果，进行方差分析，6-BA浓度对大花美人蕉“墨红”的不定芽增殖率和增殖系数存在显著差异，NAA、TDZ浓度对不定芽的增殖率和增殖系数差异不显著，当6-BA浓度为6.0 mg/L、NAA浓度为1.5mg/L、TDZ浓度为0.2mg/L时，不定芽增殖系数最高为18.00，显著高于其它处理，且各时期不定芽的增殖生长状况良好。综上，MS +6 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L TDZ为不定芽增殖的最佳配方。

6）试管苗的生根壮苗

将5）中得到的不定芽接于优化生根培养基，25±2℃，光照强度2000lx，光照周期16 h/8d，培养25-30 d，生根培养的实验结果如表5所示。

表5不同不同培养基配方对美人蕉生根的影响

其中，MS培养基生根率为99%，1/2 MS+0.5mg/LIBA生根率为92%，1/2 MS+ 0.5mg/LNAA生根率为100%，pH均为5.8-6.0，统计后发明优选的生根培养基生根率达100%，生根数达到5.7，平均根长8.0 cm，且根系生长最为旺盛，效果最好。

7）试管苗驯化移栽

首先将6)中得到的生根苗驯化6 d，然后将驯化后的小苗直接移栽到温室装营养土的花盆进中行培养，其中营养土由土草炭、有机肥以及土按照1：1：1的重量比混合制成。

最终驯化成活率达98.33%。

观察美人蕉生长状态，10 d后的生长结果如图2所示。

由图2可知，使用本发明的方法移栽的美人蕉，10 d后开始发新叶，叶绿，生长状态良好。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种美人蕉（Canna L.)试管苗叶鞘不定芽再生的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

（1）无菌苗叶鞘的准备：

将消毒后的美人蕉种子播种于无菌苗萌发培养基中培养14-16d获得美人蕉无菌苗叶鞘；

所述无菌苗萌发培养基的组成为MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（2）愈伤组织的诱导：

选取1-3叶龄的所述无菌苗叶鞘，切割成（0.8-1.2）cm×（0.8-1.2）cm大小，然后接种于愈伤组织诱导培养基中培养25-30d；

所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS+6.0-8.0 mg/L 6-BA +0.5-1.5 mg/L NAA+0.2-0.4 mg/L TDZ+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（3）愈伤组织的增殖：

将所述诱导获得的愈伤组织切成（0.4-0.6）cm×（0.4-0.6）cm小块，然后转入愈伤组织增殖培养基中培养21-30d；

所述愈伤组织增殖培养基的组成为：MS+1.5-3.5 mg/L 6-BA + 0.5-2.5 mg/L TDZ+0.1-0.5 mg/L IAA+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（4）不定芽的分化：

将所述增殖获得的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基中诱导25-30d形成不定芽；

所述愈伤组织分化培养基的组成为MS+0.5-2.0 mg/L 6-BA + 0.1-0.5 mg/L IAA+7g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（5）不定芽的增殖；

将步骤（4）中诱导形成不定芽的愈伤组织切块放入不定芽增殖培养基中培养25-30d；

所述不定芽增殖培养基的组成为MS + 1.0-7.0 mg/L 6-BA + 0.5-2.0 mg/L NAA +0.1-0.5 mg/L TDZ+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖，其中不包含培养基MS + 1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA + 0.1 mg/L TDZ+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（6）优化试管苗的生根培养：

将所述增殖得到的不定芽接于优化生根培养基中培养25-30d得到生根苗；

所述优化生根培养基的组成为1/2MS + 0.5 mg/L NAA+7 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖；

（7）试管苗的驯化移栽：

将所述生根苗驯化5-7 d，然后移栽到温室中培养；

所述驯化移栽的基质由草炭、有机肥和土按照（0.8-1.2）：（0.8-1.2）：（0.8-1.2）的重量比混合制成；所述有机肥为市售有机肥。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中选取的美人蕉种子是在9月下旬取自美人蕉种质资源圃的饱满成熟种子；所述无菌苗叶鞘的培养天数为15d。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中无菌苗叶鞘的叶龄是2叶龄，切割大小为1.0 cm×1.0 cm；所述愈伤组织诱导培养基中6-BA、NAA和TDZ的浓度分别为7.0 mg/L、0.5 mg/L以及0.25 mg/L；所述培养具体为先暗培养13-15d，然后转入光/暗周期培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中愈伤组织的切割大小为0.5cm×0.5 cm；所述愈伤组织增殖培养基中6-BA、TDZ和IAA的浓度分别为3.0mg/L、1.5mg/L 以及0.1 mg/L；所述培养具体为先暗培养13-15d，然后转入光/暗周期培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中愈伤组织分化培养基中6-BA和IAA的浓度分别为1.0mg/L和0.1 mg/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中不定芽增殖培养基中6-BA、NAA和TDZ的浓度分别为6.0 mg/L、1.5 mg/L 以及0.2 mg/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中生根苗的驯化时间为6 d；

所述驯化移栽的基质由草炭、有机肥和土按照1：1：1的重量比混合制成；所述有机肥由贵州博施生物有机肥有限公司生产，肥料登记证号为黔农肥（2018）准字号1133号。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述培养基的pH都为5.8-6.0，培养温度都为25±2℃，光照强度都为2000lx，光照周期都为光16h/暗8h。

9.权利要求1-8任一所述的方法在美人蕉（Canna L.)种质创新和/或新品种选育中的应用。

Images