CN112042532B - 一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基及其在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基及其在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用，涉及植物组培快繁技术领域。本发明所述培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6‑BA 2.4～2.8mg/L、NAA 0.5～1.0mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L。本发明所述培养基可以诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织，由愈伤组织诱导出丛生芽，建立起彩色马蹄的再生体系，约需要9～10个月的时间；经由愈伤组织诱导出的丛生芽数量多，芽生长速度快，可大幅度的提高其繁殖系数，同时加快了其繁殖的速度，极大的降低彩色马蹄莲组培苗的成本。
Description
技术领域
本发明属于植物组培快繁技术领域，具体涉及一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基及其在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用。
背景技术
彩色马蹄莲又名慈菇花、水芋、观音莲等，为天南星科(Araceae)马蹄莲属(Zantedeschia)多年生草本球根花卉，原产非洲。彩色马蹄莲花、叶雅致大方，有切花品种与盆栽品种等不同生长类型。并以其奇特的花形、艳丽的花色、高雅的花姿被喻为2l世纪的“彩色百合”。近年来，作为一种新兴的花卉，已在世界范围内迅速发展起来。在新西兰、荷兰、日本、美国、以色列等国家已建立起完善的生产繁殖技术体系。在我彩色马蹄莲的引种栽培也越来越多，许多盆花和切花的生产者已初见成效。做为“世纪的花卉之星”彩色马蹄莲有着巨大的发展潜力和喜人的发展前景。
但是目前尚未见到彩色马蹄莲再生体系建立的报道。而现有的彩色马蹄莲组培快繁的方式是几乎均以带芽块茎为外植体，诱导产生丛生芽，进而状芽、诱导生根，从而建立其快繁技术体系。此技术的缺点是繁殖系数低。由于快繁的过程中不产生愈伤组织，因此繁殖系数不高；没有愈伤组织，无法建立石蒜属的再生体系，更无法建立其遗传转化体系，无法实现对其进行分子生物学水平的遗传改良。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基及其在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用，经由愈伤组织诱导出的丛生芽数量多，芽生长速度快，可大幅度的提高了其繁殖系数，同时加快了其繁殖的速度，极大的有利于降低彩色马蹄莲组培苗的成本。而且利用愈伤组织，有望建立彩色马蹄莲高效的遗传转化体系，从而可以对彩色马蹄莲进行多种遗传操作或生物工程研究，从分子生物学水平对其进行遗传改良，培育新的彩色马蹄莲品种。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基，所述培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA2.4-2.8 mg/L、NAA0.5～1.0mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L。
本发明还提供了所述培养基在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用。
本发明还提供了一种建立彩色马蹄莲再生体系的方法，包括以下步骤：
(1)以消毒后的已萌芽彩色马蹄莲块茎为外植体，将所述外植体接种于芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得分化不定芽；所述芽诱导培养基以 MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA2.5～3.5 mg/L、NAA0.2～0.4mg/L和碳纳米管3.0～5.0mg/L；
(2)将所述分化不定芽接种至壮芽培养基上进行进行第一壮芽培养，得带块茎的幼苗；所述壮芽培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.8～2.2mg/L、NAA0.2～0.3mg/L和碳纳米管 1.0～2.0mg/L；
(3)分离所述带块茎的幼苗上的块茎，将所述块茎接种于所述诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基上进行愈伤诱导培养，得愈伤组织；
(4)将所述愈伤组织接种于增殖培养基上进行增殖培养，获得大量愈伤组织；所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.5～2.5mg/L、NAA0.2～0.3mg/L和碳纳米管1.0～2.0mg/L；
(5)将所述大量愈伤组织接种于所述芽诱导培养基上进行分化培养，得愈伤不定芽；
(6)将所述愈伤不定芽接种于不定芽壮芽培养基上进行第二壮芽培养，得带块茎的愈伤分化苗；所述不定芽壮芽培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.5～2.0mg/L、NAA0.1～0.2mg/L 和碳纳米管0.5～1.0mg/L；
(7)将所述带块茎的愈伤分化苗接种于壮苗和生根共培养培养基上进行共培养，得彩色马蹄莲再生苗；所述壮苗和生根共培养培养基以MS为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.8～2.2mg/L、NAA0.4～0.8 mg/L和IBA2.0～3.0mg/L。
优选的，步骤(1)所述芽诱导培养的温度为25±1℃，光照强度为100～300 μmol·m-2·s-1，光照时间为12～16h/d，所述芽诱导培养的时间为30～40d。
优选的，步骤(2)所述第一壮芽培养的温度为25±1℃，光照强度为 100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d；所述第一壮芽培养的时间为60～90 d。
优选的，步骤(3)所述愈伤诱导培养的温度为25±1℃，光照强度为 100～300μmol·m-2·s-1，光照时间12h/d；所述愈伤组织增殖的时间为30～60 d。
优选的，步骤(4)所述愈伤增殖培养的温度为25±1℃，暗培养。
优选的，步骤(5)所述分化培养的温度为25±1℃，光照强度为100～300 μmol·m-2·s-1，光照时间为16h/d；所述分化培养的时间为20～25d。
优选的，步骤(6)所述第二壮芽培养的温度为25±1℃，光照强度为 100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d；所述第一壮芽培养的时间为30～60 d。
优选的，步骤(7)所述共培养的温度为25±1℃，光照强度100～300 μmol·m-2·s-1，光照时为16h/d；所述共培养的时间为29～35d。
本发明提供了一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基，所述培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA2.4～2.8 mg/L、NAA0.5～1.0mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L。本发明所述培养基可以诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织，可将其用于彩色马蹄莲再生体系的建立。
本发明还提供了一种建立彩色马蹄莲再生体系的方法，以块茎为外植体诱导丛生芽长成无菌子球，再由无菌子球诱导出愈伤组织，由愈伤组织再次诱导出丛生芽，建立起彩色马蹄的再生体系，约需要9～10个月的时间；经由愈伤组织诱导出的丛生芽数量多，芽生长速度快，可大幅度的提高了其繁殖系数，同时加快了其繁殖的速度，极大的有利于降低彩色马蹄莲组培苗的成本。而且利用愈伤组织，有望建立彩色马蹄莲高效的遗传转化体系，从而可以对彩色马蹄莲进行多种遗传操作或生物工程研究，从分子生物学水平对其进行遗传改良，培育新的彩色马蹄莲品种。
具体实施方式
本发明提供了一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基，所述培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA2.4～2.8 mg/L、NAA0.5～1.0mg/L和碳纳米管0.5～1.5mg/L。
本发明所述培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度优选为2.5mg/L。本发明中所述6-BA可促进细胞分裂进而形成愈伤组织。本发明对所述6-BA 的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.8mg/L。本发明中所述NAA可促进细胞分裂和体积膨大。本发明对所述NAA的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述培养基中包括碳纳米管，所述碳纳米管优选包括多壁碳纳米管和单壁碳纳米管，所述多壁碳纳米管的浓度优选为1.5mg/L，单壁碳纳米管的浓度优选为1.0mg/L。本发明中所述碳纳米管可促进细胞对养分和水分的吸收，进而促进细胞分裂和生长。本发明对所述碳纳米管的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可，但应为碳纳米管分散液。
在本发明所述培养基中，添加了碳纳米管，同时在初代培养中使用了较高浓度的细胞分裂素6-BA，促进了块茎细胞的脱分化，从而诱导产生了愈伤组织。
本发明还提供了所述培养基在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用。
本发明还提供了一种建立彩色马蹄莲再生体系的方法，包括以下步骤： (1)以消毒后的已萌芽彩色马蹄莲块茎为外植体，将所述外植体接种于芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得分化不定芽；所述芽诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA2.5～3.5mg/L、 NAA0.2～0.4mg/L和碳纳米管3.0～5.0mg/L；
(2)将所述分化不定芽接种至壮芽培养基上进行进行第一壮芽培养，得带块茎的幼苗；所述壮芽培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.8～2.2mg/L、NAA0.2～0.3mg/L和碳纳米管 1.0～2.0mg/L；
(3)分离所述带块茎的幼苗上的块茎，将所述块茎接种于所述诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基上进行愈伤诱导培养，得愈伤组织；
(4)将所述愈伤组织接种于增殖培养基上进行增殖培养，获得大量愈伤组织；所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.5～2.5mg/L、NAA0.2～0.3mg/L和碳纳米管1.0～2.0mg/L；
(5)将所述大量愈伤组织接种于所述芽诱导培养基上进行分化培养，得愈伤不定芽；
(6)将所述愈伤不定芽接种于不定芽壮芽培养基上进行第二壮芽培养，得带块茎的愈伤分化苗；所述不定芽壮芽培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.5～2.0mg/L、NAA0.1～0.2mg/L 和碳纳米管0.5～1.0mg/L；
(7)将所述带块茎的愈伤分化苗接种于壮苗和生根共培养培养基上进行共培养，得彩色马蹄莲再生苗；所述壮苗和生根共培养培养基以MS为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.8～2.2mg/L、NAA0.4～0.8 mg/L和IBA2.0～3.0mg/L。
在本发明所述方法中，以消毒后的已萌芽彩色马蹄莲块茎为外植体，将所述外植体接种于芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得分化不定芽；所述芽诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、 6-BA2.5～3.5mg/L、NAA0.2～0.4mg/L和碳纳米管3.0～5.0mg/L。本发明所述消毒的方法，优选包括：用软毛刷将块茎刷洗干净，避免损伤顶芽，削去块茎表皮，在洗涤剂溶液中振荡洗涤20～30min，再用2g/L多菌灵溶液浸泡 1.0～1.5h，自来水冲洗35～45min，转入超净台，切除块茎表层，保留直径约 1.5cm的带芽块茎，75％酒精浸泡30～60s，无菌水冲洗1次，再用0.1％的 HgCl2进行15～20min的消毒，无菌水冲洗6～8次，无菌吸水纸吸干水分。本发明以经过所述消毒后的已萌芽彩色马蹄莲块茎为外植体，所述彩色马蹄莲块茎的萌芽方法优选包括：选取直径约2cm的健康的彩色马蹄莲块茎，用 2g/L多菌灵水溶液浸泡15-20min后，浅埋于经高压灭菌处理的湿润的细沙基质中，在光照100～300μmol·m-2·s-1、12h/d、(25±1)℃的条件下进行萌芽，7～10d后，选取芽长约1cm的种球进行消毒。
本发明将所述外植体接种于芽诱导培养基中进行芽诱导培养，所述诱导培养的温度优选为25±1℃。本发明所述诱导培养的光照强度优选为100～300 μmol·m-2·s-1，更优选为250μmol·m-2·s-1。本发明所述诱导培养的光照时间优选为12～16h/d，更优选为12h/d。本发明所述芽诱导培养的时间优选为30～40d，至分化出芽。本发明所述芽诱导培养基中包括6-BA，所述6-BA 的浓度优选为3.0mg/L，可使细胞脱分化、促进细胞分裂。本发明所述芽诱导培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.3mg/L。本发明所述NAA 可促进细胞生长。本发明所述芽诱导培养基中包括碳纳米管，所述碳纳米管优选包括多壁碳纳米管或单壁碳纳米管，当所述碳纳米管为多壁碳纳米管时，所述多壁碳纳米管的浓度优选为5.0mg/L；当所述碳纳米管为单壁碳纳米管时，所述单壁碳纳米管的浓度优选为3.0mg/L。本发明所述碳纳米管可促进细胞对养分和水分的吸收，进而促进细胞分裂和生长的作用。本发明对所述芽诱导培养基中的各原料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。
得分化不定芽后，本发明将所述分化不定芽接种至壮芽培养基上进行进行第一壮芽培养，得带块茎的幼苗；所述壮芽培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.8～2.2mg/L、NAA0.2～0.3 mg/L和碳纳米管1.0～2.0mg/L。本发明所述壮芽培养基中包括6-BA，所述 6-BA的浓度优选为1.8mg/L，所述6-BA可促进细胞分裂和增殖。本发明所述壮芽培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.3mg/L，所述NAA 可促进细胞生长和分化。本发明所述壮芽培养基中包括碳纳米管，所述碳纳米管优选的包括多壁碳纳米管或单壁碳纳米管，当所述碳纳米管为多壁碳纳米管时，所述多壁碳纳米管的浓度优选为2.0mg/L；当所述碳纳米管为单壁碳纳米管时，所述单壁碳纳米管的浓度优选为1.0mg/L。本发明所述碳纳米管可发挥促进水分和养分的吸收，进而促进细胞生长的作用。本发明对所述壮芽培养基中各原料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述第一壮芽培养的温度优选为25±1℃，光照强度优选为100～300 μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。本发明所述第一壮芽培养的时间优选为60～90d。在本发明中，每30d继代一次，共培养60～90d，直至丛生芽长成直径3～5mm的块茎的小苗。
得带块茎的幼苗后，本发明分离所述带块茎的幼苗上的块茎，将所述块茎接种于所述诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基上进行愈伤诱导培养，得愈伤组织。本发明对所述分离的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述愈伤诱导培养优选为暗培养，所述愈伤诱导培养的温度优选为25±1℃。在本发明中，经所述愈伤诱导培养3周后，小块茎的周围出现白色的突起，此为愈伤组织的萌动，20d可见白色的突起周围出现淡绿色的组织，4周后可见淡绿色的愈伤组织团块，此时再次进行上述继代培养，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。
得愈伤组织后，本发明将所述愈伤组织接种于增殖培养基上进行增殖培养，获得大量愈伤组织；所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.5～2.5mg/L、NAA0.2～0.3mg/L和碳纳米管1.0～2.0mg/L。本发明所述增殖培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度优选为2.0mg/L。本发明所述6-BA可发挥促使细胞脱分化、促进细胞分裂的效果。本发明所述芽增殖培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为 0.25mg/L。本发明所述NAA可发挥促进细胞生长的效果。本发明所述芽增殖培养基中包括碳纳米管，所述碳纳米管优选的包括多壁碳纳米管或单壁碳纳米管，当所述碳纳米管为多壁碳纳米管时，所述多壁碳纳米管的浓度优选为2.0mg/L；当所述碳纳米管为单壁碳纳米管时，所述单壁碳纳米管的浓度优选为1.0mg/L。本发明所述碳纳米管可发挥促进细胞对养分和水分的吸收，进而促进细胞分裂和生长的作用的效果。本发明对所述芽增殖培养基的各种原料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述增殖培养的温度优选为25±1℃。本发明所述增殖培养的光照强度优选为100～300 μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1。本发明所述增殖培养的光照时间优选为16h/d。本发明所述增殖培养的时间优选为40d。本发明所述芽增殖培养基可使分化不定芽的增殖系数达到80～100倍。
得大量愈伤组织后，本发明将所述大量愈伤组织接种于所述芽诱导培养基上进行分化培养，得愈伤不定芽。本发明将所述愈伤组织进行分化培养前，优选还包括对愈伤组织的处理，具体包括：将愈伤组织切下，分成直径1.5cm 左右的小块，转接到上述芽诱导培养基上进行分化。本发明所述分化培养的温度优选为25±1℃，光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为 250μmol·m-2·s-1。本发明所述分化培养的光照时间优选为16h/d。本发明所述分化培养的时间优选为20～25d，淡黄色的愈伤组织分化出绿色的小芽。
得愈伤不定芽后，本发明将所述愈伤不定芽接种于不定芽壮芽培养基上进行第二壮芽培养，得带块茎的愈伤分化苗；所述不定芽壮芽培养基以MS 培养基为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.5～2.0mg/L、 NAA0.1～0.2mg/L和碳纳米管0.5～1.0mg/L。本发明在进行所述第二壮芽培养前，优选还包括将所述愈伤不定芽切成约0.5*0.5的小块后，再进行所述第二壮芽培养。本发明所述不定芽壮芽培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度优选为1.8mg/L。本发明所述6-BA可发挥促进细胞分裂和增殖的作用。本发明所述壮芽培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.3mg/L。本发明所述NAA可发挥促进细胞生长和分化的作用。本发明所述壮芽培养基中包括碳纳米管，所述碳纳米管优选的包括多壁碳纳米管或单壁碳纳米管，当所述碳纳米管为多壁碳纳米管时，所述多壁碳纳米管的浓度优选为1.0 mg/L；当所述碳纳米管为单壁碳纳米管时，所述单壁碳纳米管的浓度优选为0.5mg/L。本发明所述碳纳米管可发挥促进水分和养分的吸收，进而促进细胞生长的作用。本发明对所述不定芽壮芽培养基中各原料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述第二壮芽培养的温度优选为 25±1℃，光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为250μmol·m-2·s-1。本发明所述第二壮芽光照时间优选为16h/d；所述第一壮芽培养的时间优选为30～60d。
得带块茎的愈伤分化苗后，本发明将所述带块茎的愈伤分化苗接种于壮苗和生根共培养培养基上进行共培养，得彩色马蹄莲再生苗；所述壮苗和生根共培养培养基以MS为基本培养基，还包括：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA1.8～2.2mg/L、NAA0.4～0.8mg/L和IBA2.0～3.0mg/L。本发明所述壮苗和生根共培养培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度优选为2.0mg/L。本发明所述6-BA可发挥促进细胞分裂和增殖的作用。本发明所述壮苗和生根共培养培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.5mg/L。本发明所述 NAA可发挥促进细胞分裂和增殖的作用的作用。本发明所述壮苗和生根共培养培养基中包括IBA，所述IBA的浓度优选为2.5mg/L。本发明所述IBA 可发挥促进小球茎根系萌发和延伸的作用。本发明对所述壮苗和生根共培养培养基中各原料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述共培养的温度优选为25±1℃，光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为250μmol·m-2·s-1。本发明所述共培养的光照时优选为16h/d；所述共培养的时间优选为29～35d。在本发明中，经过所述共培养29～35d后，即可长成直径3-5mm根系3-5条的彩色马蹄莲再生苗。
本发明得所述彩色马蹄莲再生苗后，优选还包括炼苗和移栽，所述炼苗优选在室内进行，具体包括将组培瓶从培养室取出，在缓冲间有自然光的地方放置2-3d后，将瓶盖打开，行有菌条件驯化3～5d。本发明所述移栽优选为用镊子将所述再生苗从瓶中取出，洗净块茎周围的培养基，500～800倍多菌灵浸泡20m，移栽到基质(泥炭土：珍珠岩：沙＝2：2：1)中进行栽培，之后进行正常的水肥管理。
下面结合实施例对本发明提供的一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基及其在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
彩色马蹄莲‘Prafait’的无菌子球的培养
(1)外植体的准备选取直径约3.0cm的健康的彩色马蹄莲‘Prafait’块茎，用2g/L多菌灵水溶液浸泡15min后，浅埋于经高压灭菌处理的湿润的细沙基质中，在光照200μmol·m-2·s-1、12h/d、(25±1)℃的条件下进行预培养，令种球萌发，8d后，选取芽长约1cm的种球，经表面消毒后接种。具体消毒方法为：用软毛刷将块茎刷洗干净，避免损伤顶芽，削去块茎表皮，在洗涤剂溶液中振荡洗涤25min，再用2g/L多菌灵溶液浸泡1.0h，自来水冲洗30min，转入超净台，切除块茎表层，保留直径约1.5cm的带芽块茎， 75％酒精浸泡45s，无菌水冲洗1次，再用0.1％的HgCl2进行20min的消毒，无菌水冲洗6次，无菌吸水纸吸干水分。备用。
(2)不定芽的诱导将已灭菌的带芽块茎，以基盘向下的方式接种到芽诱导培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.2mg/L 6-BA+0.4mg/LNAA+3.0mg/L多壁碳纳米管。经过35d的培养后，从外植体的芽眼长出小芽。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间12h。
(3)壮芽培养将不定芽切下培养40d后进行壮芽培养，培养基为：蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.5mg/L多壁碳纳米管，每30d继代一次，共培养60d，不定芽长成直径4mm的小块茎。培养温度25±1℃，光照强度200μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(4)愈伤组织的诱导将壮芽培养后长出的小块茎转接到蔗糖30 g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1.5mg/L多壁碳纳米管培养基上。2周后，小块茎的周围出现白色的突起，此为愈伤组织的萌动， 20d可见白色的突起周围出现淡黄色的组织，25d后可见淡黄色的愈伤组织团块，30d后再次进行继代培养，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。培养温度25±1℃，暗培养。
(5)愈伤组织的增殖培养将愈伤组织转接到增殖培养基上进行增殖培养。培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.5mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+2.0mg/L多壁碳纳米管。培养温度25±1℃，光照强度200 μmol·m-2·s-1，光照时间16h。经过40d的培养，在愈伤组织逐渐膨大，可增殖成直径 超过2.0cm的团块。
(6)大量愈伤组织的分化将增殖后的大块愈伤组织切下，分成直径 1.0*1.0cm的小块，转接到上述芽诱导培养基上进行分化。培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(7)壮芽培养将愈伤组织分化出的丛生芽接种到蔗糖40g/L+琼脂 7.5g/L+MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/L多壁碳纳米管培养基上，每30d继代一次，共培养90d，直至丛生芽长成块茎直径3mm的小苗。培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(8)壮苗和生根培养壮芽和生根培养可以一次完成。具体方法是将上述3mm块茎转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+2.0mg/LIBA培养基上，进行壮芽和生根共培养，即可长成直径4-5 mm、重约0.5-1.0g、根系5-6条的试管苗。培养温度25±1℃，光照强度 100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(9)炼苗移栽炼苗在室内进行。将组培瓶从培养室取出，在缓冲间有自然光的地方放置3d后，将瓶盖打开，行有菌条件驯化3d后，用镊子将组培苗从瓶中取出，洗净块茎周围的培养基，800-1000倍多菌灵浸泡20min，移栽到基质(泥炭土：珍珠岩：沙＝2：2：1)中进行栽培。之后进行正常的水肥管理。
利用上述方法，一个直径约3.0cm的‘Prafait’种球可切成4-5块进行初代培养，即不定芽的诱导；每块外植体可诱导不定芽2-3个，共可诱导不定芽12-15个；将不定芽壮芽后进行愈伤组织的诱导，根据本方法愈伤组织的诱导率为50-60％，则可产生愈伤组织6-7块，在不进行愈伤组织增殖培养的情况下，直接将诱导培养30-40d的愈伤组织进行分化培养，每块愈伤组培可分化出芽80-100个，每个种球的繁殖倍数可达500-700倍。
实施例2
彩色马蹄莲‘LemonDrop’的愈伤组织的诱导
(1)外植体的准备选取直径约3.5cm的健康的彩色马蹄莲‘Lemon Drop’块茎，用2g/L多菌灵水溶液浸泡20min后，浅埋于经高压灭菌处理的湿润的细沙基质中，在光照200μmol·m-2·s-1、12h/d、(25±1)℃的条件下进行预培养，令种球萌发，10d后，选取芽长约1cm的种球，经表面消毒后接种。具体消毒方法为：用软毛刷将块茎刷洗干净，避免损伤顶芽，削去块茎表皮，在洗涤剂溶液中振荡洗涤30min，再用2g/L多菌灵溶液浸泡1.5 h，自来水冲洗45min，转入超净台，切除块茎表层，保留直径约1.5cm的带芽块茎，75％酒精浸泡60s，无菌水冲洗1次，再用0.1％的HgCl2进行 25min的消毒，无菌水冲洗7次，无菌吸水纸吸干水分。备用。
(2)不定芽的诱导将已灭菌的带芽块茎，以基盘向下的方式直接接种到芽诱导培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.5 mg/L6-BA+0.4mg/LNAA+1.0mg/L多壁碳纳米管。经过40d的培养后，从外植体的芽眼长出小芽。培养温度25±1℃，光照强度200μmol·m-2·s-1，光照时间12h。
(3)壮芽培养丛生芽增殖培养40d后进行壮芽培养，将从生芽接种到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/L多壁碳纳米管培养基上，每30d继代一次，共培养90d，丛生芽长成直径3mm 的小块茎。培养温度25±1℃，光照强度200μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(4)愈伤组织的诱导将壮芽培养后长出的小块茎转接到蔗糖30g/L+ 琼脂7.5g/L+MS+2.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1.0mg/L多壁碳纳米管培养基上。2周后，小块茎的周围出现白色的突起，此为愈伤组织的萌动，20d 可见白色的突起周围出现淡黄色的组织，30d后可见淡黄色的愈伤组织团块，此时再次进行继代培养，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。培养温度25±1℃，暗培养。
(5)愈伤组织的增殖培养将愈伤组织转接到增殖培养基上进行增殖培养。培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+1.8mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+1.0mg/L单壁碳纳米管。培养温度25±1℃，光照强度200 μmol·m-2·s-1，光照时间16h。经过40d的培养，愈伤组织不断膨大，最终可形成直径超过2.5cm的团块。
(6)愈伤组织的分化将愈伤组织切下，分成直径1.5cm左右的小块，转接到上述芽诱导培养基上进行分化。培养温度25±1℃，光照强度250 μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(7)壮芽培养将愈伤组织分化出的丛生芽接种到蔗糖40g/L+琼脂 7.5g/L+MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/L多壁碳纳米管培养基上，每30d继代一次，共培养90d，直至丛生芽长成块茎直径3mm的小苗。培养温度25±1℃，光照强度280μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(8)壮苗和生根培养壮芽和生根培养可以一次完成。具体方法是将上述3mm块茎转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+2.0mg/LIBA培养基上，进行壮芽和生根共培养，即可长成直径4-5 mm、重约0.5-1.0g、根系5-6条的试管苗。培养温度25±1℃，光照强度250 μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(9)炼苗移栽炼苗在室内进行。将组培瓶从培养室取出，在缓冲间有自然光的地方放置3d后，将瓶盖打开，行有菌条件驯化4d后，用镊子将组培苗从瓶中取出，洗净块茎周围的培养基，500～800倍多菌灵浸泡20min，移栽到基质(泥炭土：珍珠岩：沙＝2：2：1)中进行栽培。之后进行正常的水肥管理。
利用上述方法，一个直径约3.5cm的‘LemonDrop’种球可切成4～6块进行初代培养，即不定芽的诱导；每块外植体可诱导不定芽2～3个，共可诱导不定芽12～16个；将不定芽壮芽后进行愈伤组织的诱导，根据本方法愈伤组织的诱导率为50～60％，则可产生愈伤组织6～8块，在不进行愈伤组织增殖培养的情况下，直接将诱导培养30-40d的愈伤组织进行分化培养，每块愈伤组培可分化出芽80～100个，每个种球的繁殖倍数可达500～800倍。同时建立起彩色马蹄的再生体系，从而可以对彩色马蹄莲进行多种遗传操作或生物工程研究，从分子生物学水平对其进行遗传改良，培育新的彩色马蹄莲品种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种建立彩色马蹄莲再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以消毒后的已萌芽彩色马蹄莲块茎为外植体，将所述外植体接种于芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得分化不定芽；所述芽诱导培养基由MS培养基、蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA 3.2～3.5mg/L、NAA 0.4mg/L和多壁碳纳米管5.0mg/L组成；
(2)将所述分化不定芽接种至壮芽培养基上进行第一壮芽培养，得带块茎的幼苗；所述壮芽培养基由MS培养基、蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA 2.0mg/L、NAA 0.2mg/L和多壁碳纳米管1.0～1.5mg/L组成；
(3)分离所述带块茎的幼苗上的块茎，将所述块茎接种于诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基上进行愈伤诱导培养，得愈伤组织；所述诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基由MS培养基、蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA 2.5mg/L、NAA 0.5mg/L和多壁碳纳米管1.0～1.5mg/L组成；
(4)将所述愈伤组织接种于增殖培养基上进行增殖培养，获得大量愈伤组织；所述增殖培养基由MS培养基、蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6-BA 1.8～2.5mg/L、NAA 0.2～0.3mg/L和多壁碳纳米管1.0～2.0mg/L组成；
(5)将所述大量愈伤组织接种于所述芽诱导培养基上进行分化培养，得愈伤不定芽；
(6)将所述愈伤不定芽接种于不定芽壮芽培养基上进行第二壮芽培养，得带块茎的愈伤分化苗；所述不定芽壮芽培养基由MS培养基、蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA 2.0mg/L、NAA0.2mg/L和多壁碳纳米管1.0mg/L组成；
(7)将所述带块茎的愈伤分化苗接种于壮苗和生根共培养培养基上进行共培养，得彩色马蹄莲再生苗；所述壮苗和生根共培养培养基由MS基本培养基、蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、6-BA 2.0mg/L、NAA 0.5mg/L和IBA 2.0mg/L组成。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述芽诱导培养的温度为25±1℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为12～16h/d，所述芽诱导培养的时间为30～40d。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述第一壮芽培养的温度为25±1℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d；所述第一壮芽培养的时间为60～90d。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述愈伤诱导培养的温度为25±1℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间12h/d；所述愈伤组织增殖的时间为30～60d。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述愈伤增殖培养的温度为25±1℃，暗培养。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(5)所述分化培养的温度为25±1℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为16h/d；所述分化培养的时间为20～25d。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(6)所述第二壮芽培养的温度为25±1℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d；所述第一壮芽培养的时间为30～60d。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(7)所述共培养的温度为25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时为16h/d；所述共培养的时间为30～35d。
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