CN115606502B - 一种梭梭离体再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梭梭离体再生的方法，包括：待梭梭无菌苗长至3～5cm时，截取0.5～1cm子叶节迅速接种至诱导愈伤激素培养基中，接种14d后陆续出愈；待无菌苗长至3～5cm时，截取约0.5～1cm大小的子叶节迅速地接种至诱导出芽培养基中，接种14d后陆续出芽；待不定芽生长至1～2cm时，将不定芽转接至含有植物激素的诱导生根培养基中，接种14d后陆续生根；将根系发达、健壮的再生幼苗在人工气候箱内打开瓶口，炼苗一周左右，再从培养瓶中取出再生苗，用无菌水冲洗附着在根表面的培养基，移栽至灭菌种植基质中，置于设定培养条件的培养室中培养。本发明愈伤组织出愈率达100％、出芽率61.90％、出芽指数为2.90、生根率为50％，且生根快。
Description
技术领域
本发明属于植物快速繁殖技术领域，尤其涉及一种梭梭离体再生的方法。
背景技术
梭梭属于国家二级保护植物，是一种具有耐旱、耐寒、抗盐碱等特点的植物，能起到防风固沙、遏制土地沙化、改良土壤、恢复植被重要作用，在维护生态平衡上起着不可比拟的作用；此外，梭梭是温带荒漠中生物产量最高的植被类型之一，其本身可以作为牲畜的饲料草，并且梭梭的根部为中药肉苁蓉提供寄生环境。因此，在干旱、沙化地区推广普及梭梭的种植，具有非常重要的生态意义和经济意义。
现有技术中梭梭苗木的培育方法为种子育苗，但是，梭梭种子的寿命很短，保存期仅为1年左右，第二年其种子生活力就会大幅下降；另外，通过扦插的方式繁殖梭梭存在生根难的问题，严重影响了梭梭苗木的培育效率。
梭梭再生体系是梭梭遗传转化的基础，也是梭梭遗传改良和抗逆分子机制研究的基础，在梭梭生态适应机制研究领域具有非常重要的地位。现有的梭梭离体再生技术采用的外植体通常为梭梭带腋芽茎段或梭梭同化枝等，存在出芽率低、生根率较低、生根时间较长等问题。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种梭梭离体再生的方法。
本发明是这样实现的，本发明公开了一种梭梭离体再生的方法，该方法包括以下步骤：
(1)待梭梭无菌苗长至3～5cm时，截取0.5～1cm子叶节迅速接种至诱导愈伤激素培养基中，接种14d后陆续出愈；
(2)待无菌苗长至3～5cm时，截取约0.5～1cm大小的子叶节迅速地接种至诱导出芽培养基中，接种14d后陆续出芽；
(3)待不定芽生长至1～2cm时，将不定芽转接至含有植物激素的诱导生根培养基中，接种14天后陆续生根；
(4)将根系发达、健壮的再生幼苗在人工气候箱内打开瓶口，炼苗6～8天，再从培养瓶中取出再生苗，用无菌水冲洗附着在根表面的培养基，移栽至灭菌种植基质中，置于设定培养条件的培养室中培养。
优选地，在步骤(1)中，所述诱导愈伤激素培养基为MS(MS培养基)+0.5mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+0.5mg/L KT(激动素)。
优选地，在步骤(2)中，所述诱导出芽培养基为MS+0.5mg/LNAA(萘乙酸)+0.5mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤)。
优选地，在步骤(3)中，所述诱导生根培养基为MS+1mg/L IAA(吲哚乙酸)+1mg/LIBA+1mg/L NAA。
优选地，在步骤(4)中，所述种植基质为按质量比1:1:1的蛭石、草炭以及沙子。
优选地，在步骤(4)中，所述培养条件为：培养室温度为25±2℃，空气相对湿度为60～65％，光照时间为16h/d，光照强度为1500～2000LX。
本发明克服现有技术的不足，提供一种梭梭离体再生的方法。植物组织培养又叫做离体培养，指的是从植物体中分离出所需要的组织、器官、细胞或原生质体等，通过无菌的操作，在无菌条件下转移在含有各种植物营养物质和植物激素的培养基中进行培养，从而获得再生完整植株或者生产具有其他经济价值的产品的技术。植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织—经过脱分化(去分化)形成愈伤组织—再经过再分化形成组织或器官—经过培养发育成一颗完整的植株。
本发明以梭梭子叶节为外植体，通过诱导愈伤组织、诱导不定芽、不定芽生根和移栽等步骤建立一套梭梭组织培养与植株再生体系。本发明采用梭梭子叶节诱导愈伤组织，然后再进行梭梭子叶节诱导出芽和诱导梭梭不定芽生根获得组培苗。通过本发明方法所得的梭梭组培苗品质好，褐化和黄化现象明显较低；所诱导的梭梭不定芽增殖系数高，出芽率为61.90％，出芽指数为2.90。本发明所获得的梭梭组培苗能够为遗传转化提供技术参考。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)现有的梭梭离体再生技术采用的外植体通常为梭梭带腋芽茎段或梭梭同化枝等，本发明采用的是梭梭子叶节；
(2)本发明采用的梭梭子叶节诱导出的愈伤组织出愈率达100％且质量较好；
(3)现有的出芽率低于本发明出芽率61.90％，且本发明的出芽指数为2.90；
(4)现有的生根率较低，生根时间较长，需30d后才出现白色根点，本发明生根率为50％，在14d后便可陆续出根。
附图说明
图1是本发明梭梭离体再生实施过程各阶段的实物展示图；其中，A：梭梭种子，B：无菌苗，C：梭梭子叶节，D～F：子叶节诱导愈伤组织，G～J：子叶节诱导出芽，K～N：不定芽诱导生根，O：梭梭再生苗，P～R：移栽后1d、3d、5d。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、梭梭离体再生实施过程
(1)种子处理及无菌苗的获得
选取颗粒饱满均匀的梭梭种子(采自新疆昌吉州吉木萨尔县北部古尔班通古特沙漠，-20℃保存)，75％乙醇，涡旋清洗3min，弃去液体；无菌水冲洗3遍，涡旋清洗；100％次氯酸钠浸泡种子10～15min，无菌水漂洗6遍；无菌水浸泡8h，点种于MS固体培养基上使其萌发，约30d后获得梭梭无菌苗(图1B)，切下梭梭子叶节(图1C)用于愈伤组织诱导。
(2)愈伤组织的诱导
待梭梭无菌苗长至3～5cm时，截取约0.5～1cm子叶节迅速接种至诱导愈伤激素培养基(MS+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT)中，接种14d后陆续出愈，子叶节切口处两端开始膨大(图1D)，15～20d后，形成致密紧凑的绿色或黄绿色的愈伤组织(图1E)。
计算公式：愈伤组织诱导率＝(形成愈伤组织外植体数/接种外植体数×100％。
(3)不定芽的诱导
待无菌苗长至3～5cm时，截取约0.5～1cm大小的子叶节迅速地接种至诱导出芽培养基中(MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA)中，在14d可以看见子叶节的一端出现芽点，另一端产生愈伤(图1G)，继续生长一段时间后长出更多的不定芽(图1H)。
计算公式：出芽率＝(形成出芽的外植体个数/接种外植体个数)×100％；
出芽指数＝外植体的出芽总数/出芽的外植体总数。
(4)不定根的诱导
待不定芽生长至1～2cm时，将不定芽转接至含有植物激素的诱导生根培养基(MS+1mg/L IAA+1mg/L IBA+1mg/L NAA)中，接种14d后，不定芽底部与培养基接触面形成愈伤组织，继续培养后，幼根从不定芽基部长出，须根逐渐增多(图1K、L)。
计算公式：生根率＝(生根的芽数/接种的芽数)×100％。
(5)炼苗移栽
将根系发达，健壮再生幼苗在人工气候箱内打开瓶口，炼苗一周(6～8天)左右，再从培养瓶中取出再生苗，用无菌水冲洗附着在根表面的培养基，移栽至灭菌的蛭石:草炭:沙子＝1:1:1中，置于培养室培养。
(6)培养条件
培养室温度为25±2℃，空气相对湿度为60～65％，光照时间为16h/d，光照强度为1500～2000LX。
二、效果
诱导梭梭子叶节愈伤组织的最佳培养基为MS+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L KT，出愈率可达到100％；诱导子叶节分化不定芽的最佳培养基为MS培养基中加入0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA时诱导出芽率较高，达到61.90％，出芽指数为2.90；生根培养基为MS+1mg/LIBA+1mg/L NAA+1mg/L IAA，生根率达50％(表1)，本发明采用的梭梭离体培养和植株再生的方法整个周期需要150d左右。
表1梭梭组培体系所需培养基配方(mg/L)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种梭梭离体再生的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)待梭梭无菌苗长至3～5cm时，截取0.5～1cm子叶节迅速接种至诱导愈伤激素培养基中，接种14d后陆续出愈；
(2)待无菌苗长至3～5cm时，截取0.5～1cm大小的子叶节迅速地接种至诱导出芽培养基中，接种14d后陆续出芽；
(3)待不定芽生长至1～2cm时，将不定芽转接至含有植物激素的诱导生根培养基中，接种14天后陆续生根；
(4)将根系发达、健壮的再生幼苗在人工气候箱内打开瓶口，炼苗6～8天，再从培养瓶中取出再生苗，用无菌水冲洗附着在根表面的培养基，移栽至灭菌种植基质中，置于设定培养条件的培养室中培养；
在步骤(1)中，所述诱导愈伤激素培养基为MS+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/LKT；
在步骤(2)中，所述诱导出芽培养基为MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述诱导生根培养基为MS+1mg/L IAA+1mg/L IBA+1mg/L NAA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述种植基质为按质量比1:1:1的蛭石、草炭以及沙子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述培养条件为：培养室温度为25±2℃，空气相对湿度为60～65％，光照时间为16h/d，光照强度为1500～2000LX。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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