CN101810144B - 瓜叶菊的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了瓜叶菊(Senecio cruentus)的快速繁殖方法，属于植物组织培养领域。本发明方法包括以下步骤：1)以瓜叶菊种子作为外植体；2)丛生芽的诱导培养；3)壮苗培养；4)愈伤组织诱导培养；5)愈伤组织增殖培养；6)将不定芽分化培养；7)不定根诱导培养；8)炼苗移栽；其中，每个培养阶段所采用的基本培养基都是MS培养基，各个培养阶段所添加的生长调节剂，皆是采用正交设计实验后选择的最适宜的用量及配比。本发明方法所培育的瓜叶菊试管苗生长健壮，繁殖系数高，平均诱导生根率达到94.68％，移栽成活率达到100％，可进行规模化、工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的组织培养方法，特别涉及瓜叶菊(Senecio cruentus)种子离体快速繁殖方法，属于植物组织培养领域。
背景技术
瓜叶菊(Senecio cruentus)又名千日莲、瓜叶莲，是菊科(Compositea)千里光属(Senecio)多年生草本植物，全株密布柔毛，叶片每三片一轮，成三角形，叶似黄瓜叶片，故名瓜叶菊。原产于西班牙加那利群岛，性喜冷寒，不耐高温和霜冻，好肥，喜疏松、排水良好的土壤。适宜生长的温度为10℃～20℃，高于25℃，低于10℃，生长缓慢，0℃以下极易受冻害。
瓜叶菊株丛紧密，盛开时花朵覆盖全株，花顶生，头状花序多数聚合成伞房花序，花序密集覆盖于枝顶，常呈锅底形，花色丰富艳丽，观赏价值很高。瓜叶菊的花期为每年12月至次年4月，正值少花的冬春季节，极具经济价值，是冬、春季盆栽用于布置居室、客厅、会议室及花坛装饰的理想花卉。目前市场上的瓜叶菊中，较著名的品种有“完美”、“小丑”、“惑星”、“礼品”等，颜色有红、粉红、蓝、紫以及许多复色。
用于大规模生产的瓜叶菊，全部采用种子繁殖。对于重瓣品种，为防止自然杂交或品质退化，也可采用分株法繁殖。瓜叶菊种子价格昂贵，寿命较短，发芽率低，系列变异率高，播种繁殖难以得到性状一致的种苗，从而限制了其产业化和商品化生产；而分株繁殖也普遍存在繁殖系数低，容易退化和传播病害的缺陷。
传统的育种方法虽然取得了一些成果，但还存在着很大的局限性。利用基因工程技术将目的基因定向导入植物细胞或组织中，培育成植株，可获得人们预期的新品种，为花卉的定向育种提供技术支持。目前，瓜叶菊花青素合成途径中的很多重要结构基因克隆已经完成，如CHS、CHI、F3H、ANS、F3’H、F3’5’H、DFR等，其中F3’5 ’H是重要的控制蓝色花形成的基因，这些基因工程技术为创造更多新奇花卉提供了可能。
然而，育种过程都需要一个稳定、高效的再生体系，这是决定遗传转化成败的关键。而一个稳定、高效的再生体系，必须具备以下条件：(1)外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和完整植株的能力；(2)具有较高的芽分化率；(3)易于离体培养，具有高度可重复性；(4)体细胞无性系统变异小。
公开号为CN 101578959A的发明公开了一种离体培养除虫菊再生植株的方法及专用培养基，其步骤包括：1)将除虫菊的种子灭菌及离体培养后得到无菌苗，然后在MS基本培养基中继代培养；2)培养30天后，取顶端幼嫩叶片作为外植体，接种于含有2.0mg/L的6-BA、2.0mg/L的IBA及2.0mg/L的硝酸银的MS培养基中，先暗培养后光照培养，约30天后获得再生芽；3)将再生芽转移至MS基本培养基中继代培养，得到完整植株，但是，该方法的除虫菊的再生体系稳定性差，幼苗的成活率低。
公开号为CN 1653879A的发明公开了一种非洲菊切花种苗快繁方法，该方法将非洲菊花蕾的花托作为外植体，将其切成小块后置于含有0-2.0mg/L的AKT、0-0.2mg/L的NAA、0-1.0mg/L的BA以及0-0.5mg/L的IAAO的MS培养基中，在1000Lux、22-28℃下诱导出不定芽；再将不定芽切下置于含有0.2-2.0mg/L的BAO及0.2mg/L的NAA的MS培养基中，增殖培养形成丛芽；将丛芽切成单株芽苗后置于含有0.5mg/L的IBA的1/2MS培养基中，诱导其生根；最后将生根苗移栽到苗床。
上述两种方法虽然在一定程度上克服了传统育种所存在的缺陷，但其均采用直接再生方法，将外植体诱导发芽，而没有经过愈伤组织的诱导及分化途径。直接诱导法所得的体细胞胚胎发芽率低，并且由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，会导致外植体停止生长，甚至老化变黑以及死亡，从而降低外植体的再生率，从而不利于离体组织的再生以及大规模培养。
湖南农业大学的于晓英等人，以瓜叶菊5个不同花色母株的单芽茎段为外植体进行了离体培养与快速繁殖研究，结果表明：1)以来自母株M1的外植体在含有0.1mg/LNAA+2mg/LBA的A5培养基的诱导率最高，芽萌动早且数目多；2)在继代培养中，在0～2.0mg/L范围内，随BA质量浓度的增加，瓜叶菊芽的增殖倍数增大，但当BA为3.0mg/L时，外植体茎叶随着时间推移逐渐变厚变脆，成愈伤组织状；3)C6培养基(1/2MS+0.5mg/LIBA+2％蔗糖)是瓜叶菊离体生根培养比较合适的培养基，培养到第16天时根系诱导率为100％，平均根数为18条，平均根粗为0.09cm；来自C6的试管苗移栽成活率可达95％，但是该繁殖方法没有经过脱分化过程、再分化得到再生苗(即没有愈伤组织的诱导及不定芽的获得)，再生体系的稳定行性差，繁殖系数低，不利于产业化生产，也无法用于分子育种研究。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种繁殖速度快、生根率高的瓜叶菊种子离体快速繁殖方法。该方法可以在短期内形成大量优良瓜叶菊试管苗，可进行规模化、工厂化生产，也可以用于分子育种研究。
为实现上述目的，本发明一方面提供一种瓜叶菊的快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)以瓜叶菊种子作为外植体，接种于种子萌发培养基上萌生为无菌苗；
2)将去根无菌苗接种于丛生芽诱导培养基上诱导培养丛生芽；
3)将丛生芽切下后接种于壮苗培养基上进行壮苗培养；
4)将经过壮苗培养的芽苗的叶片、叶柄剪切后接种于愈伤组织诱导培养基上诱导生成愈伤组织；
5)将诱导的愈伤组织剪切后接种于愈伤组织增殖培养基上进行愈伤组织的增殖培养；
6)将增殖后的愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养；
7)将不定芽接种于不定根生根培养基上诱导培养不定根；
8)炼苗移栽，即得。
其中，步骤1)中的种子萌发培养基是：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH值为6.1。
步骤2)中丛生芽诱导培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-2.0mg/L+萘乙酸(NAA)0-0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。丛生芽诱导培养基优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+萘乙酸(NAA)0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
步骤3)中壮苗培养基是：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH值为6.1。
步骤4)中愈伤组织诱导培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-3.0mg/L+萘乙酸(NAA)0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。愈伤组织诱导培养基优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-3.0mg/L+萘乙酸(NAA)2.0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。愈伤组织诱导培养基进一步优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸(NAA)2.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
步骤5)中愈伤组织增殖培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-1.0mg/L+萘乙酸0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。愈伤组织增殖培养基优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L+萘乙酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
步骤6)中不定芽分化培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-3.0mg/L+萘乙酸(NAA)0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。不定芽分化培养基优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-3.0mg/L+萘乙酸(NAA)2.0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。不定芽分化培养基进一步优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+萘乙酸(NAA)2.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
步骤7)中不定根生根培养基是：大量元素减半的1/2MS基本培养基+萘乙酸(NAA)0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1；或大量元素减半的1/2MS基本培养基+3-吲哚丁酸(IBA)0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。不定根生根培养基优选为：大量元素减半的1/2MS基本培养基+萘乙酸0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1；或大量元素减半的1/2MS基本培养基+3-吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
特别是，步骤1)中接种之前先将瓜叶菊种子浸泡在质量百分比浓度为10％的过氧化氢溶液中消毒10-20分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。
其中，步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)、步骤5)、步骤6)和步骤7)中的无菌苗培养、丛生芽诱导培养、壮苗培养、愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养、不定芽分化培养和不定根诱导培养在以下条件下进行：培养温度为25士1℃，光照强度为2000勒克斯(lux)，光照时间为10-16小时/天。
特别是，步骤2)中去根无菌苗在丛生芽诱导培养基中培养至诱导生成的丛生芽高度为1-2cm；
步骤3)中丛生芽在壮苗培养基中培养至植株高度达3-4cm，植株上的叶片、叶柄的长度为1-2cm；
步骤6)中愈伤组织在不定芽分化培养基中培养至不定芽长度达到1-1.5cm；
步骤7)中不定芽在不定根生根培养基中培养至不定根长度达到1-1.5cm。
其中，步骤8)中所述的炼苗移栽为：待生长健壮的无菌苗的不定根长至长约1-1.5cm时，打开培养瓶的封口膜，在组培室内炼苗2-3天，然后将生根的小苗取出，用自来水洗去根部残留的琼脂培养基，移栽于装有蛭石基质的容器内，保持基质和空气中的相对湿度为40-50％，一周以后进行常规培养，一个月后移栽至草炭与蛭石等体积的混合基质中培养，至植株生长健壮；最后定植在泥炭基质中。
本发明的瓜叶菊“小丑”的繁殖方法具有以下优点：
1、本发明利用瓜叶菊成熟种子进行离体快速繁殖，每个培养阶段所采用的基本培养基的都是MS基本培养基(除生根培养基外，生根培养的基本培养基是1/2MS)，具有无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾和铵的含量高，可以为组织生长提供所需矿质营养和促进愈伤组织生长，MS培养基的无机养分的数量和配比适当，不需额外添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分，节约了生产成本。
2、本发明的繁殖方法中瓜叶菊繁殖效率高，培养基中添加植物生长调节剂利于外植体的愈伤组织的诱导、增殖，不定芽的分化和生根，本发明中使用的瓜叶菊培养基中营养物质组成合理，用量和配比适宜，培育结果重复性高，再生体系稳定。
3、本发明方法培育的瓜叶菊苗生长健壮、繁殖系数高，诱导生根率高，达到79.17-100％，移栽成活率高(达到100％)，是工厂化大规模生产瓜叶菊幼苗的简便、快捷的技术体系。
附图说明
图1为瓜叶菊无菌苗；
图2为瓜叶菊丛生芽；
图3为瓜叶菊叶片诱导的愈伤组织；
图4为瓜叶菊叶片分化的不定芽；
图5为瓜叶菊不定根；
图6为第一次移栽的瓜叶菊穴盘苗；
图7为第二次移栽后的瓜叶菊小苗；
图8为瓜叶菊已开花的组培苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中数据采用Microsoft Excel和SPSS10.0软件进行方差分析与多重比较(邓肯式检验，P＝0.01)；百分数经反正弦(y＝arcsin x1/2)转换后再进行分析和比较，邓肯式显著性检验结果存在显著差异。
实施例1
一、试验材料
1、成熟瓜叶菊‘小丑’种子来自于美国Gold Smith公司。
本发明实施例所用瓜叶菊‘小丑’5个花色品种分别为：蓝色、白色、粉色、猩红色及黄色。
2、植物生长调节剂
本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。
3、培养基的配制：
(1)“MS基本培养基”的组成或配制方法；
表1MS培养基(Murashige and Skoog，1962)
| MS大量元素母液成分 | 含量(g/L) | MS微量元素母液成分 | 含量(g/L) | 有机化合物母液成分 | 含量(g/L) |
| NH4NO3 | 33 | H3BO3 | 1.24 | 肌醇 | 20 |
| KNO3 | 38 | ZnSO4·7H2O | 1.72 | 烟酸 | 0.1 |
| CaCl2·2H2O | 8.8 | MnSO4·4H2O | 4.46 | 维生素B6 | 0.1 |
| MgSO4·7H2O | 7.4 | Na2MoO4·2H2O | 0.05 | 维生素B1 | 0.02 |
| KH2PO4 | 3.4 | KI | 0.166 | 甘氨酸 | 0.4 |
| CuSO4·5H2O | 0.005 | ||||
| CoCl2·6H2O | 0.005 | ||||
| FeSO4·7H2O | 2.78 | ||||
| Na-EDTA | 1.865 |
上述MS培养基母液配好后，储存于4℃冰箱待用。根据配置培养基的数量，称量所需琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的无菌水中，顺序加入所需的大量元素母液、微量元素母液和有机成分母液，每加入一种都充分搅拌，最后加水定容至培养基最终体积，用pH计测试培养基酸碱度，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl将pH值调整至6.1。
(2)种子萌发培养基：MS基本培养基添加蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1，培养基在118℃下恒温灭菌18分钟。
(3)丛生芽诱导培养基：MS基本培养基添加6-BA0.5-2.0mg/L、NAA0-0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1，培养基在118℃下恒温灭菌18分钟。
(4)愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基添加6-BA0.5-3.0mg/L、NAA0-3.0mg/L、2，4-DO-2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1，培养基在118℃下恒温灭菌18分钟。
(5)愈伤组织增殖培养基：MS基本培养基添加6-BA0.5-1.0mg/L、NAA0.5-1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1，培养基在118℃下恒温灭菌18分钟。
(6)不定芽分化培养基：MS基本培养基添加6-BA 0.5-3.0mg/L、NAA 0-3.0mg/L、2，4-D 0-2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1，培养基在118℃下恒温灭菌18分钟。
(7)壮苗培养基：MS基本培养基添加蔗糖蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1，培养基在118℃下恒温灭菌18分钟。
(8)不定根生根培养基：大量元素减半的1/2MS基本培养基添加NAA 0.1-0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L或大量元素减半的1/2MS基本培养基添加IBA 0.1-0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1，培养基在118℃下恒温灭菌18分钟。
4、培养条件
培养条件采用以日光灯为光源的人工光照，封闭式组织培养室，光照强度为2000Lux，光照时间10-16h/d，温度(25士1)℃。
二、试验方法
1、无菌苗培养
将白色瓜叶菊‘小丑’的种子浸泡质量百分比浓度为10％的过氧化氢溶液中，不断摇动，浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗数次(3-5次)，将处理好的种子放在无菌干燥的滤纸上吸干表面水分，备用；
将消毒后的种子接种于种子萌发培养基上，进行无菌苗的培养，培养温度(25士1)℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-16h/d；此阶段无菌苗在原外植体上伸长，长势旺盛、颜色嫩绿、具有明显可辨茎段、根(如图1所示)，种子在培养基上萌发，生长成无菌苗；
2、丛生芽诱导培养
将高度为2-3cm的无菌苗去根后，接种于丛生芽诱导培养基中，进行丛生芽的诱导培养，培养温度(25士1)℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-16h/d；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为0mg/L，此阶段去根无菌苗在生长调节剂的作用下从茎节或底部萌发侧芽，整个丛生芽呈团状，呈绿色、嫩绿色或深绿色(如图2所示)，丛生芽增殖倍数见表2；
芽增殖倍数＝分离得到的芽数目/接种无菌苗的数目
3、丛生芽壮苗培养
将培养30天左右高度为1-2cm的丛生芽用手术刀逐个切下后接种于壮苗培养基中，进行壮苗培养，培养温度(25士1)℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-16h/d；
4、愈伤组织诱导培养
将壮苗培养至高度为3-4cm的植株上的长度为1.5-2cm的叶片及叶柄，在超净工作台中，将叶片剪成0.5cm×0.5cm的小块，将叶柄切成厚度为0.1cm的薄片，分别接种于愈伤组织诱导培养基中，进行愈伤组织诱导培养，培养温度(25士1)℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-16h/d；其中，愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L，此阶段接种14天左右，接种的叶片或叶柄周围开始膨大，形成愈伤组织(如图3所示)，颜色为黄绿色、黄白色、绿色，大约25天后，愈伤组织不再生长。统计愈伤组织诱导率，数据分析结果见表2。
诱导率＝形成愈伤组织的外植体数目/接种的外植体数目×100％
5、愈伤组织增殖培养
在超净工作台中，将诱导获得的黄绿色疏松的愈伤组织用手术刀切成0.2cm×0.2cm左右的小块，然后转接到愈伤组织增殖培养基上，进行增殖培养，培养温度(25士1)℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-16h/d；其中，愈伤组织增殖培养基所使用6-BA为1.0mg/L、NAA为1.0mg/L，此阶段接种14天左右，愈伤组织明显增大，呈黄绿色、疏松状态，25天左右停止生长，增殖后的愈伤组织大小约为1cm×1cm，愈伤组织增殖倍数和愈伤组织形态见表3所示；
增殖倍数＝愈伤组织增殖后的面积/接种的愈伤组织面积
6、不定芽分化培养
将上述增殖后的愈伤组织接种于不定芽分化培养基中，进行分化培养，培养温度(25士1)℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-16h/d；其中，不定芽分化培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L，此阶段接种后25天左右不定芽开始分化，不定芽高1～1.5cm，有2～3片叶长出(如图4所示)，愈伤组织分化率见表2所示；
分化率＝分化的不定芽的数目/接种的愈伤组织的数目×100％
7、生根培养
将长度为1-1.5cm的不定芽在超净工作台中用手术刀分离后，接种于不定根诱导培养基中，进行不定根的诱导生根培养，培养温度(25士1)℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-16h/d；其中，不定根的生根培养基中所用NAA为0.5mg/L，此阶段接种不定芽约20天左右，不定根开始萌发，为乳白色，直径小于0.1cm，分布于切口处到离切口1cm之间，25天后当不定根长至1-1.5cm，株高在3～4cm(如图5所示)，诱导生根率和生根数见表2；
生根率＝生根的外植体数目/接种的外植体的数目×100％
8、炼苗、移栽
待生长健壮的无菌苗的不定根长至长约1-1.5cm时，打开瓶盖，将其在组培室炼苗2天，然后将植株取出后，用水洗去根部残留的琼脂培养基，移栽于装有蛭石基质的容器内，形成瓜叶菊穴盘苗(如图6所示)，保持温度为(25士1)℃，相对湿度为40-50％。一周以后进行常规培养(相对湿度40-50％，环境温度20-22℃，气候室光源)，一个月后进行第二次移栽，移栽至草炭与蛭石等体积的混合基质中培养，植株生长健壮(如图7所示)，成活率为100％。
实施例2
除无菌苗培养采用猩红色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为0.5mg/L、NAA为0mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为3.0mg/L、2，4-D为0.5mg/L；愈伤组织增殖培养基所使用6-BA为0.5mg/L、NAA为0.5mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为3.0mg/L、2，4-D为0.5mg/L；不定根的生根培养基中所用IBA为0.1mg/L外，其它均与实施例1相同。
实施例3
除无菌苗培养采用蓝色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为1.0mg/L、NAA为0.1mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为3.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0.5mg/L；愈伤组织增殖培养基所使用6-BA为1.0mg/L、NAA为0.5mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为3.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0.5mg/L；不定根的生根培养基中所用NAA为0.1mg/L外，其它均与实施例1相同。
实施例4
除无菌苗培养采用粉色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为0.1mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为1.0mg/L、NAA为3.0mg/L、2，4-D为1.0mg/L；愈伤组织增殖培养基所使用6-BA为0.5mg/L、NAA为1.0mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为1.0mg/L、NAA为3.0mg/L、2，4-D为1.0mg/L；不定根的生根培养基中所用IBA为0.5mg/L外，其它均与实施例1相同。
实施例5
除无菌苗培养采用黄色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为0.5mg/L、NAA为0mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为1.0mg/L、NAA为3.0mg/L、2，4-D为1.0mg/L；愈伤组织增殖培养基中所用的6-BA为0.5mg/L、NAA为0.5mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为1.0mg/L、NAA为3.0mg/L、2，4-D为1.0mg/L；不定根的生根培养基中所用IBA为0.1mg/L之外，其它均与实施例1相同。
实施例6
除无菌苗培养采用粉色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为0mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为2mg/L、NAA为2mg/L、2，4-D为0mg/L；愈伤组织增殖培养基中所用的6-BA为1.0mg/L、NAA为1.0mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L；不定根的生根培养基中所用NAA为0.5mg/L之外，其它均与实施例1相同。
实施例7
除无菌苗培养采用白色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为1.0mg/L、NAA为0mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为0.5mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为1.0mg/L；愈伤组织增殖培养基中所用的6-BA为1.0mg/L、NAA为0.5mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为0.5mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为1.0mg/L；不定根的生根培养基中所用NAA为0.1mg/L之外，其它均与实施例1相同。
实施例8
除无菌苗培养采用蓝色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为0mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L；愈伤组织增殖培养基中所用的6-BA为1.0mg/L、NAA为1.0mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L；不定根的生根培养基中所用NAA为0.5mg/L之外，其它均与实施例1相同。
实施例9
除无菌苗培养采用黄色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为0.5mg/L、NAA为0mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L；愈伤组织增殖培养基中所用的6-BA为1.0mg/L、NAA为1.0mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L；不定根的生根培养基中所用NAA为0.5mg/L之外，其它均与实施例1相同。
实施例10
除无菌苗培养采用猩红色瓜叶菊‘小丑’的种子；丛生芽诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为0mg/L；愈伤组织诱导培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L；愈伤组织增殖培养基中所用的6-BA为1.0mg/L、NAA为1.0mg/L；不定芽分化培养基中所用6-BA为2.0mg/L、NAA为2.0mg/L、2，4-D为0mg/L；不定根的生根培养基中所用IBA为0.5mg/L之外，其它均与实施例1相同。
表2瓜叶菊繁殖过程中的性能检测结果
注：邓肯式显著性检验，存在显著差异。
表1结果表明：
(1)丛生芽的诱导培养，芽增殖效果明显，尤其是以添加2.0mg/L的6-BA的MS培养基为最佳的丛生芽诱导培养基，增值倍数为4.67-11.10；
(2)在没有添加植物生长调节剂的诱导培养基中，以叶片及叶柄为外植体进行诱导，均没有形成愈伤组织，诱导率为0；而添加植物生长调节剂后，以叶片及叶柄为外植体进行诱导，均能形成愈伤组织，其中，叶片在愈伤组织诱导中效果优于叶柄；以添加2.0mg/L的NAA和2.0mg/L的6-BA的MS培养基为最佳的诱导培养基，诱导率达到95％。
(3)愈伤组织放入添加了植物调节生长剂的分化培养基中进行培养，均能分化出不定芽，其中，叶片分化效果优于叶柄；以添加2.0mg/L的NAA和2.0mg/L的6-BA的MS培养基为最佳的诱导培养基，分化率达到65.6％。
表3愈伤组织形态及增殖倍数结果
| 实施例 | 愈伤组织块数 | 增殖倍数 | 愈伤形态 |
| 实施例1 | 22 | 28.81 | 多数为黄绿色、疏松的愈伤组织 |
| 实施例2 | 20 | 16.52 | 多数为绿色、致密的愈伤组织 |
| 实施例3 | 17 | 16.81 | 黄白色、疏松的愈伤组织 |
| 实施例4 | 18 | 18.74 | 1/3为黄白色、疏松的，2/3为绿色、致密的愈伤组织 |
| 实施例5 | 20 | 19.25 | 半数为绿色、致密的，半数为黄绿色、疏松的愈伤组织 |
| 实施例6 | 18 | 18.74 | 多数为黄绿色、疏松的愈伤组织 |
| 实施例7 | 20 | 22.44 | 半数为绿色、致密的，半数为黄白色、疏松的愈伤组织 |
| 实施例8 | 18 | 20.61 | 多数为黄绿色、疏松的愈伤组织 |
| 实施例9 | 20 | 22.56 | 多数为黄绿色、疏松的愈伤组织 |
| 实施例10 | 20 | 21.72 | 多数为黄绿色、疏松的愈伤组织 |
注：邓肯式显著性检验，存在显著差异。
表3结果表明：添加了NAA和6-BA的培养基对愈伤组织的增殖效果明显，增殖倍数在18.74～28.81之间，其中，以获得疏松的黄绿色愈伤组织为好；本发明的愈伤组织增殖培养基培养瓜叶菊愈伤组织，增殖倍数大且获得的多数为疏松的黄绿色愈伤组织，愈伤组织的分化能力强。
Claims (3)
1.瓜叶菊（Senecio cruentus）的快速繁殖方法，包括以下步骤：
1）以瓜叶菊种子作为外植体，接种于种子萌发培养基上萌生为无菌苗；
2）将去根无菌苗接种于丛生芽诱导培养基上诱导培养丛生芽；
3）将丛生芽切下后接种于壮苗培养基上进行壮苗培养；
4）将经过壮苗培养的芽苗的叶片、叶柄剪切后接种于愈伤组织诱导培养基上诱导生成愈伤组织；
5）将诱导的愈伤组织剪切后接种于愈伤组织增殖培养基上进行愈伤组织的增殖培养；
6）将增殖后的愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养；
7）将不定芽接种于不定根生根培养基上诱导培养不定根；
8）炼苗移栽，即得；
其中，步骤1）中所述的种子萌发培养基是：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH值为6.1；
步骤2）中所述丛生芽诱导培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-2.0mg/L+萘乙酸0-0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1；
步骤3)中所述壮苗培养基是：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH值为6.1；
步骤4）中所述愈伤组织诱导培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-3.0mg/L+萘乙酸0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1；
步骤5）中所述愈伤组织增殖培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-1.0mg/L+萘乙酸0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1；
步骤6）中所述不定芽分化培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-3.0mg/L+萘乙酸0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1；
步骤7）中所述不定根生根培养基是：大量元素减半的1/2MS基本培养基+萘乙酸0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1，或大量元素减半的1/2MS基本培养基+3-吲哚丁酸0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
2.如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是：步骤1）中所述接种之前先将瓜叶菊种子浸泡在质量百分比浓度为10%的过氧化氢溶液中消毒10-20分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。
3.如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是：步骤8）中所述的炼苗移栽包括顺序进行的步骤：移栽前打开培养瓶的封口膜在组培室内炼苗2-3天，然后将生根的小苗取出，用自来水洗去根部残留的琼脂培养基，移栽于装有蛭石基质的容器内，保持基质和空气中的相对湿度为40-50%，一个月后移栽至草炭与蛭石等体积混合的栽培基质中培养。
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