CN102907318B

CN102907318B - 一种利用生物反应器培养体细胞胚快繁三七再生植株的方法

Info

Publication number: CN102907318B
Application number: CN201110217125.6A
Authority: CN
Inventors: 由香玲; 詹亚光; 李玉花; 谭啸; 代金玲; 陶雷; 尹静
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2011-08-01
Filing date: 2011-08-01
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2031-08-01
Also published as: CN102907318A

Abstract

本发明主要提供一种高效无性快繁三七再生植物的方法利--用生物反应器大量培养三七体细胞胚。从不定根诱导获得的三七胚性愈伤组织增殖后，在含有0.5mg/L 2，4-D的MS条件下，100％的愈伤组织都产生了球形体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多。10.0g(约1.65×10⁴个)球形胚培养在3L生物反应器内，反应器内装有1.5L不加任何植物生长调节剂的1/2MS液体培养基，空气通入量为0.15vvm。4周后球形胚都发育为子叶体细胞胚，且生物生长量增加约为原来的8倍。液体或固体培养获得的子叶体细胞胚在含加有2.0mg/LGA₃的1/2MS培养基中萌发成正常体细胞胚苗，继而在不含任何植物生长调节剂的1/2MS培养基中继代。生长良好的幼苗移栽入装有人工土壤(泥煤苔和泥质岩(3∶1，v∶v))的营养杯中，温室训化成活率较高。

Description

一种利用生物反应器培养体细胞胚快繁三七再生植株的方法

技术领域

本发明涉及一种利用小型生物反应器大量培养体细胞胚，简单快速无性繁殖三七再生植株的方法。本发明属于农业生物技术领域。

背景技术

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)又名田七、金不换、三七参等，为五加科人参属植物，三七为我国传统名贵中药材，主要以块根入药。三七性温，味甘、苦，具有止血镇痛、活血化瘀、滋补强壮和消除疲劳增强体力之功效，传统上常用于治疗咳血、吐血、月经过多、皮下出血及跌打和刀枪损伤等症，具有多方面的药理作用和保健功能，开发前景广阔。由于三七同为人参属植物，而它的有效活性物质又高于或多于人参，因此又被现代中药药物学家称为“参中之王”。

三七从播种至收获，要经三年以上时间(王淑琴等，《中国三七》，1993)，种子又有休眠，需要经过3-6个月的层积处理期才能发芽。因此，利用现代生物技术一诱导体细胞胚发生途径对其进行快速繁殖和种质保存一直是人们研究的问题。刘瑞驹等于1991年首次报道了三七组培苗的再生，他们以幼苗为材料，将茎、叶柄和叶分别进行离体培养，最后均从胚性愈伤组织中分化出胚状体，进而发育成完整植株(刘瑞驹，植物生理学通讯，1991，27(3)：210)。次年，陈伟荣等利用三七花序诱导了胚性愈伤组织，通过体细胞胚发生途径获得再生植株(陈伟荣，华南农业大学学报，1992，13(3)：69)。许鸿源等用叶片和叶柄作为外植体诱导获得了体细胞胚再生植株(中国中药杂志，2007，32：481)。尽管对三七体细胞胚发生及其植株再生的研究较多，但是利用生物反应器大量培养三七体细胞胚还未有报道。本发明介绍的是利用一种生物反应器培养体细胞胚，快速生产体细胞胚及其小苗的方法。该发明为试管苗在生产中的利用打下了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种更快、更高效无性繁殖三七再生植物的方法--利用小型生物反应器培养三七体细胞胚快繁再生植株的方法。该发明也为三七的分子育种、规模化生产苗木提供技术支持。

本发明主要是涉及诱导三七体细胞胚发生、发育、苗木移栽等过程中组织培养方法以及利用小型生物反应器(3L)培养大量培养体细胞胚的技术方法等。

具体的发明内容的技术路线包括以下几个部分的内容：

(1)三七胚性愈伤组织的诱导和增殖

首先三七种子进行发芽处理，用发芽的无菌小苗诱导出不定根后，再将不定根切成约1cm的根段，接种到添加有1.0mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖和3.0g/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养。5周后诱导出胚性愈伤组织，并进行继代增殖。

(2)体细胞胚发生的诱导和体细胞胚发育

诱导增殖的胚性愈伤组织接种到含有不同浓度2，4-D的分化培养基中培养。4周后，在含有0.5mg/L2，4-D处理的条件下，有100％的愈伤组织都产生了体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多。

(3)小型生物反应器高效培养体细胞胚

将诱导和增殖的胚性愈伤组织转到添加有0-1.0mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖和3.0g/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养，诱导体细胞胚发生。当球形胚形成后，将其接种到装有不加2，4-D的1/2MS液体培养基的三角瓶(100ml)中培养3周，以确定初始接种量与培养基量比例。然后将10.0g(大约1.65×10⁴个)球形胚转入3L生物反应器内培养，该反应器内装有1.5L不加任何植物生长调节剂1/2MS液体培养基，空气通入量为0.15vvm。4周后球形胚都发育为子叶体细胞胚，且生物生长量增加约为原来的8倍。

(4)体细胞胚的萌发和驯化

上述液体或固体培养获得的子叶体细胞胚转入含有一系列浓度的GA₃的1/2MS培养基中促进体细胞胚正常萌发成体细胞胚苗。然后三七体细胞胚幼苗转入不加任何植物生长调节剂的1/2MS培养基中培养。之后，将生长良好的幼苗移栽入装有人工土壤(泥煤苔和泥质岩(3∶1，v∶v))的营养杯中，温室(18～25℃)训化3个月后，成活率为66.7％。

本发明中所用的培养基都是按常规处理(调整pH值为5.8，经过高温高压灭菌(121℃、1.5个大气压、15分钟))后使用的，培养环境为常规组织培养室(温度24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％)。

本发明的特征：

能更快更高效的繁殖三七再生植株：1)生物反应器的工作量非常大，3L的小型生物反应器一个培养周期就可以生产约1.65×10⁴个体细胞胚；2)由于本发明中三七植株再生方式是体细胞胚途径，再生植株能直接萌发成小苗，相对像器官发生途径样，节省了生根过程。

附图说明

图13L小型生物反应器大量培养三七体细胞胚。A，培养的不定根段(比例尺：2.0cm)；B，不定根在1.0mg/L 2，4-D的MS培养基中培养5周后诱导的胚性愈伤组织(比例尺：2.0cm)；C，继代扩增的愈伤组织(比例尺：2.0cm)；D，E，分别是胚性愈伤组织在不加2，4-D(D)和加有0.5mg/L 2，4-D(E)的MS培养基中培养4周后，分化的体细胞胚(比例尺：1.0cm)；F，E中分化的球形体细胞胚发育到鱼雷和子叶体胚(比例尺：1.0cm)；G，悬浮培养E中分化的球形体细胞胚(比例尺：1.0cm)；H，在不加任何植物生长调节剂的培养基中发育成熟的子叶体细胞胚(比例尺：1.7cm)；I，通过悬浮培养获得的体细胞胚培养在固体培养基(比例尺：3.0mm)；J，3L生物反应器悬浮培养4周E中的球形体细胞胚(比例尺：1.0cm)；K，J中生物反应器培养的体细胞胚(比例尺：5.0mm)；L，J中生物反应器培养的子叶体细胞胚(比例尺：1.5cm)。

图2体细胞胚萌发、植株转化和土壤移栽。A，在不含激素的1/2MS培养中培养的子叶体细胞胚根形成但顶芽生长不好(比例尺：5mm)；B，体细胞胚在含有2.0mg/L GA₃1/2MS培养基中培养2周后根端和顶芽生长(比例尺：1.2cm)；C，在1/2MS培养基中培养2个月后顶芽和根端发育良好的体细胞胚幼苗(比例尺：1.2cm)；D，幼苗移栽入人工土壤中生长3个月后幸存的幼苗(比例尺：7mm)；

具体实施方式

实例1诱导三七体细胞胚发生、发育

1)诱导三七胚性愈伤组织并进行增殖

首先三七种子进行发芽处理，用发芽的无菌小苗诱导出不定根后，再将不定根切成约1cm的根段，接种到添加有1.0mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖和3.0g/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养。5周后有大约50％的不定根诱导出了愈伤组织。愈伤组织都是从不定根的两端切口地方产生，且松散、乳白色。这些愈伤组织每隔3周在同样的培养基中继代一次，很快增殖。

2)诱导体细胞胚发生的和发育

诱导增殖的胚性愈伤组织接种到含有不同浓度2，4-D的分化培养基中培养。4周后，在含有0.5mg/L2，4-D处理的条件下，有100％的愈伤组织都产生了体细胞胚，有100％的愈伤组织都产生了体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多，为32.7个。黄色的球形体细胞胚形成于愈伤组织的表层细胞。其他处理体细胞胚的诱导率较低，平均每团愈伤组织产生的体细胞胚的数量较少(表1)。

表1不同浓度的2，4-D对体细胞胚分化的影响

注：运用Duncan多重比较。相同字母为相差不显著。

球形体细胞胚转入不加任何生长素的固体1/2MS培养基6周后，绝大多数发育到鱼雷胚和子叶胚。

实例2利用小型生物反应器高效培养体细胞胚

将诱导和增殖的胚性愈伤组织转到添加有0-1.0mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖和3.0g/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养，以诱导体细胞胚发生。每个玻璃三角瓶中接种5.0mm直径大小的胚性愈伤组织6-7个，每个处理接种7-8瓶。当球形胚形成后，0.2-0.6g(大约300-1000个)球形胚接种到装有30mL不加2，4-D的1/2MS液体培养基的三角瓶(100ml)中培养3周，0.2g初始接种量的体细胞胚生长发育最好，大部分发育到鱼雷胚。

根据该初始接种量与培养基量比例，10.0g(大约1.65×10⁴个)球形胚转入3L生物反应器内培养，反映其内装有1.5L不加有任何植物生长调节剂的1/2MS液体培养基，通入空气流量为0.15vvm。4周后，迅速长成平均79.7g的体细胞胚(表2)。这些体细胞胚都长成子叶体胚，而且从这些胚的胚轴处有许多次生体细胞胚产生。以上结果表明，生物反应器培养的体细胞胚发育相对一致。

本研究中次生体细胞胚形成，一方面对快速无形繁殖时有利的，另一方面对初生体细胞胚的进一步生长发育是不利的。因此应根据实际的研究目的进行三七次生体细胞胚的研究。

表2球形体细胞胚在3L生物反应器内培养4周的生长

初始接种的球形胚数量	收获量(鲜重，g)	生长量(鲜重，g)
			1.65×10⁴(10.0g)	89.7±3.70	79.7±3.70

实例3体细胞胚萌发和土壤移栽

(1)体细胞胚的萌发

上述液体或固体培养获得的子叶体细胞胚转入不加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基中培养2周，就会萌发成体细胞胚苗，但是它们的顶端伸长较难。我们用一系列浓度的GA₃处理子叶体细胞胚苗。选择约2.0cm的正常子叶体胚，用0-4.0mg/L的GA₃处理2周后，统计结果显示(表3)，GA₃的浓度显著影响了体胚苗的生长，2.0mg/L GA₃对体细胞胚苗的生长促进效果最好，顶端生长和根端生长最好。

表3不同浓度GA₃对体胚萌发的影响

注：运用Duncan多重比较。相同字母为相差不显著。

(2)体细胞胚苗的土壤移栽

当三七体细胞胚幼苗转入不加任何植物生长调节剂的1/2MS培养基中培养8周，小苗的根部逐渐减隆起变粗象块根。之后，将生长良好的幼苗移栽入装有人工土壤(泥煤苔和泥质岩(3∶1，v∶v))的营养杯中，温室(18～25℃)训化3个月，约66.7％的植株叶子保持绿色成活。

Claims

1.一种利用生物反应器培养体细胞胚快繁三七再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)利用无菌小苗的子叶、胚根、下胚轴为外植体，通过常规培养方法获得不定根后，将其切成1cm的根段，接种到添加有1.0mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖和3.0g/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养诱导获得胚性愈伤组织，并在同样的条件下继代增殖；

2)将胚性愈伤组织接种到含有0.5mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖和3.0g/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养，100％的愈伤组织都产生了球形体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多；将10.0g球形体细胞胚转入3L生物反应器内培养，该反应器内装有1.5L不加有任何植物生长调节剂的1/2MS液体培养基，通入空气流量为0.15vvm，4周后球形体细胞胚都发育为子叶体细胞胚，且生物生长量增加约为原来的8倍；

3)上述获得的子叶体细胞胚转入含加有2.0mg/LGA₃的1/2MS培养基培养2周萌发成体细胞胚苗，之后转入不加任何植物生长调节剂的1/2MS培养基中培养；

4)将生长良好的幼苗移栽入装有体积比为3∶1的泥煤苔和泥质岩的营养杯中，18～25℃温室驯化3个月后，成活率为66.7％；

步骤1)、2)、3)中所用的培养基都是按常规处理：调整pH值为5.8，经过121℃、1.5个大气压高温高压灭菌15分钟后使用，培养环境为常规组织培养室：温度24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％。