JPS63254982A - 毛状根薬用人参の誘導法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、薬用人参〇ｍ織培養物（カルス）から効果的
にサポニンを生産し得る毛状根薬用人参をｍＲする方法
に関する。

（従来の技術） 薬用人参９例えば、オタネ人参（Ｐａｎａｘ　　紅旦並
ＬＣ，Ａ、　Ｍｅｙｅｒ）、チクセツ人参（Ｐａｎａｘ
　　ｐ印μｍ旦リーＣす八、　Ｍｅｙｅｒ）、アメリカ
人参（Ｐａｎａｘ　　７ｆｏｌｉｕｍ　Ｌ、　）　＋三
七人参（Ｐａｎａｘ　　ｎｏｔｏ　１ｎｓｅｎＬ（Ｂｕ
ｒｋ）　Ｆ、Ｉｌ、　Ｃｈｅｎ）　、　　シベリア人参
（ｔｉｌｅｕｔｈｅｒｏ−ｃｏｃｃｕｓ　　５ｅｎｔｉ
ｃｏｓｕｓ）の根、は有用漢方薬として珍重され広く利
用されている。薬効としては、古くから強壮、長生など
が言われ、現在では鎮静。

興奮、利尿作用なども明らかにされている。薬用人参の
有効成分としては、サポニン、サボゲニン。

ビタミンＢ群、β−シトステロール−Ｄ−ｏ−グルコシ
ドなどが報告されており、このうち特にサポニンおよび
サポゲニンの薬効が顕著であることが明らかにされてい
る。サポニンもサポゲニンも薬用人参中に多種存在する
。薬用人参のサポニンはジンセッサイドと総称され、現
在までにジンセッサイドＲｏ、　　ジンセッサイドＲａ
、　　ジンセッサイドＲｂ、　　ジンセッサイドＲｃ、
　　ジンセッサイドＲｄ、　　ジンセッサイドＲｅ、　
　ジンセッサイドＲｆ、　　ジンセッサイドＲｇおよび
ジンセッサイドＲｈが知られている。これらのうちジン
セッサイドＲｈが鎮静作用を、ジンセッサイドＲｇが興
奮作用を示すことが報告されている（薬学雑誌８２巻１
２号１６３３〜１６３４頁；蛋白質。

核酸、酵素１２巻１号３２〜３８頁）。

薬用人参は、現在、野性ではほとんど存在せず。

栽培が行われている。栽培は非常に難しく、夏季冷涼な
高地で排水のよい土地を用いることが必要で、かつ日覆
やその他特別の配慮を要する。薬用人参を栽培すると収
穫までに４〜７年を必要とし。

同゛じ場所での連作は２０〜５０年の長期にわたり不能
となる。そのため、薬用人参は非常に高価である。

薬用人参もしくはその有効成分を安価に供給するために
、薬用人参の組織培養が行われている。

この方法によれば、薬用人参の組織から誘導した細胞塊
（カルス）を無菌の条件下で継代培養することが可能で
あり、天然の人参に比べて短期間のうちにサポニンなど
の有効成分を得ることができる（例えば、特開昭５８−
１７９８３６号公報、特開昭５９−１６９４８６号公報
）。しかし１例えばカルスの生長速度やカルス中のサポ
ニンの含有量にバラツキがあるため、高成長、高サポニ
ン生産株の選抜が必要であった。

他方、植物の有効成分を効果的に得るための方法として
、上記カルスを培養する方法の他に、ある種の細菌（毛
根病菌）を感染させて得られる毛状根（ｈａｉｒｙ　ｒ
ｏｏｔ）を培養する試みがなされている。例えば、ヒヨ
ス、ハシリドコロ、ベラドンナ。

ニチニチソウに上記毛根病菌（アグロバクテリウム　リ
ゾゲネス；　Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　劫１覗ｐ
μ胆）を感染させると毛状根が形成される。この毛状根
の形成は９毛根病菌の菌体内に存在するＲｉプラスミド
に起因すると考えられる。この毛状根は原種物体に含有
されるのと同じアルカロイドをほぼ同程度の割合で生産
する。上記植物から誘導されるカルスにおいてはアルカ
ロイドの生産がほとんど認められないこと；および毛状
根の生育速度が原種物体に比べて速いことを考慮すると
植物体に含有される有効成分を効果的に得る方法のひと
つとして注目される。

上記毛状根を薬用人参についても得ることができれば、
サポニンをはじめとする各種薬用人参の有効成分が効果
的に得られうると考えられる。薬用人参の上記カルスを
照光下で培養し、茎葉および根に再分化させて（特公昭
５４−３８１９９号公報）。

そこから根部のみを取り出して培養することは可能であ
る。しかし、根部のみを安定して分化するセルラインに
安定化させるには長期間にわたる継代培養を繰り返す必
要がある。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、薬用人参の有効成分を効果的
に得るための手段を提供することにある。

本発明の他の目的は、薬用人参の有効成分を高含量で含
有する毛状根を誘導する方法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段および作用）、本発明の
毛状根薬用人参の誘導法は、薬用人参カルスに毛根病菌
を感染させる工程を包含し、そのことにより上記目的が
達成される。

本発明方法に用いられる薬用人参カルスは通常の方法で
薬用人参植物体から誘導され得る。使用される薬用人参
としては１例えばオタネ人参、チクセツ人参、アメリカ
人参、三七人参、シベリア人参などが挙げられる。

薬用人参〇カルスを誘導するための培地、およびそれを
増殖させるための培地（基本培地）としては２通常の組
織培養用の培地が利用されうる。

このような培地には、炭素源、窒素源、ミネラル塩類、
微量の金属、ビタミンなどが含有される。

炭素源としては、炭水化物が脂肪酸誘導体が挙げられ、
好適な炭素源としては、グルコース、蔗糖。

コーンシロップ、澱粉、デキストロース、これらの類似
体などがある。窒素源としては、硝酸イオン、アンモニ
ウムイオン、グリシン、尿素などがある。ミネラル塩類
としては、リン酸塩類、塩化物、硫酸塩などがある。既
知の好適な培地としてはムラシゲ−スクーグ（Ｍｕｒａ
ｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）の培地。

ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）の培地、ホワイト（Ｗｈ
　ｉ　ｔｅ）の培地、リンスマイヤー−スクーグ（Ｌｉ
ｎｓｍａｉｅｒ−５ｋｏｏｇ）の培地、ヘラ−（Ｈｅｌ
ｌｅｒ）の培地などが挙げられる。

上記培地には必要に応じて植物ホルモンが含有される。

植物ホルモンとしては、２・４−ジクロロフェノキシ酢
酸、ナフタレン酢酸、インドール酢酸などのオーキシン
類；およびゼアチン、カイネチン、ベンジルアデニンな
どのサイトカイニン類が挙げられる。オーキシン類およ
び／またはサイトカイニン類は２通常、それぞれ０．０
０１〜１１００ｐｐの割合で培地中に添加される。

・培地は、固体培地または液体培地が用いられる。

固体培地の場合は１通常、寒天が０．５〜２重量％の割
合で含有される。

薬用人参カルスを得るには、まず、薬用人参植物体（根
、茎など）の切片をサラシ粉などで殺菌処理後、上記の
培地（寒天培地）上に置床する。

１０〜３０℃で数日間培養すると植物体切断面に不定形
の細胞塊（カルス）が形成される。形成されたカルスは
２通常、同組成の固体培地で継代培養を行い安定化させ
る。培養方法は特に限定されない。

例えば、フラスコを用いた振盪培養や寒天を用いる固体
培養などが行われる。培養条件は培養する薬用人参カル
スの種類などによっても異なるが。

通常、培養温度は約２０〜３０℃、そして培養の期間は
１〜４週間である。

得られる薬用人参カルスに感染させる毛根病菌としては
１毛状根を形成されることが知られているアグロバクテ
リウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ（転）−属に属する
細菌が用いられる。アグロバクテリウム　リゾゲネス（
ん「旦一旦幻■頂明−印圏皿並競）が好適に用いられる
。毛根病菌を上記薬用人参カルスに感染させるには９例
えば、この薬用人参カルスをセルラーゼなどで処理して
細胞壁を溶解し、これに上記毛根病菌を接触させる。毛
根病菌はカルス細胞内部に入り込み、このことにより毛
根病菌が有するＲｉプラスミドがカルス内に導入される
。Ｒｉプラスミドが導入された感染後のカルスを新たな
培地に移して培養を続けると９毛状根が形成される。

この毛状根は、カルスを再分化させて得られる細根に比
べ、短期間のうちに筒便かつ確実に得られる。この毛状
根薬用人参は１通常のカルスと同様に無菌的に継代培養
が可能であり、かつ、培地に植物ホルモンが添加されて
いない場合にもカルスに比べて良好な生育を示す。この
毛状根薬用人参中のサポニン含量は、後述の実施例に示
すように。

例えばホルモン培養培地においては薬用人参カルスとほ
ぼ同等である。生育速度は同条件において２倍以上であ
るため１毛状根薬用人参の培養によりサポニンが効果的
に生産され得る。

薬用人参カルスに細菌を感染させる方法としては２特公
昭４８−３１９１７号公報に植物カルスにアグロバクテ
リウム　ツメフエシエンスを接種する方法が開示されて
いる。しかし、これはクラウンゴールを得る方法であり
２本発明のようなサポニンを効果的生産する毛状根を得
ることはできない。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実施例および比較例における培養操作および感染処理は
すべて実質的な無菌条件下で行った。

大立開上 （Ａ）薬用人参カルスの調製−大根島（島根系）産（２
年半栽培）のオタネニンジン（Ｐａｎａｘ　　しＬ凹Ｃ
，Ａ、　Ｍｅｙｅｒ　）の根を用い、２．４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）　　ｉｐｐｍ　、カイネ
チン（Ｋｉｎｅｔｉｎ）０．１ｐｐＴ１．蔗＄３！　（
ｓｕｃｒｏｓｅ）　３％を含むムラシゲ−スクーグ（Ｍ
Ｓ）の基本培地でカルス化した。これを４週間ごとに３
ケ月間継代培養して得たカルスをＰｇ−４株とした。こ
のＰｇ−４株はインドール−３−酪酸（ＩＢＭ）　２　
ｐｐｍ　、カイネチン０．ｌｐｐｍ　、蔗糖３％を含む
ＭＳ基本培地で継代培養を続けている茶色のカルス塊で
、培地条件によっては一部太い根を分化するが細根の分
化は全く認められない株である。

（Ｂ）毛根病菌の培養：毛根病菌としてアグロバクテリ
ウム　リゾゲネス（ムエｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｒｈ
ｉｚｏ−脛吐し）Ａ−４株〔農林水産省指令５７−名植
第３８６号（昭和５７年３月８日）〕（アグロビン、マ
ンノピン生産株）を用いた。この菌は、Ｉｎ当り牛肉抽
出物５　ｇ、イースト抽出物１ｇ、ペプトン５ｇ。

蔗糖５　ｇ、　Ｍｇ５Ｏａ　２　ｘｉｏ−コＨを含む半
合成培地で３週間ごとに継代培養を行った。

（Ｃ）毛根病菌の感染：（Ａ）項で得られたＰｇ−４株
を［ＢＡ　２ｐｐ＋＊、　Ｋｉｎｅｔｉｎ　０．ｌｐｐ
ｍ、　５ｕｃｒｏｓｅ３％を含むＭＳ培地（８２に培地
）で３週間培養後、２０メツシユのナイロンクロスで濾
過し、小さな細胞および破片などを除いた。得られた細
胞塊を２％セルラーゼ　オノズカＲ−１０，０，５％マ
セロザイムＲ−１０゜０．３Ｍマンニトールを添加した
ＭＳ培地に懸濁し、２時間、３０℃でインキュベートし
た。ナイロンクロスで濾過し、数回水洗を行った。あら
かじめ５０〇−・のマイヤーフラスコに１２５−の培地
を入れ３日間２５℃で培養していたＡ、　　ｒｈｉｚ皿
剋競の懸濁培養液中に、上記のセルラーゼ処理を行った
Ｐｇ−４株の細胞塊を入れ、２５℃で１５時間培養を行
った。これを２０メツシユのナイロンクロスで濾過し、
水で数回洗浄した。次に、この細胞塊をバンコマイシン
（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）　　２５０ｇ、カルベニシリ
ン（Ｃａｒ−ｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）　２００　ｍｇお
よびテトラサイクリン（Ｔｅｔｒａ−ｃｙｃｌｉｎｅ）
　２００＋＋ｇを１１中に含有するＭＳ基本培地中で２
５℃、４日間インキユベートシ、除菌処理を行った。こ
れをナイロンクロスで濾過し、数回水洗した。

（Ｄ）感染カルスの培養および毛状根の分離＝（Ｃ）項
で得られた感染処理後のカルスを（１）ホルモン無添加
のＭＳ基本培地および（２）ＩＢＡ　２ｐｐ＋＋＋Ｋｉ
ｎｅｔｉｎ　Ｏ，１ｐｐＩＩ＋を含む耶基本培地（８２
に培地）にそれぞれ移植した。カルスからはいずれも細
根が生じた。４週間ごとの継代培養により３代目（約３
ケ月後）に伸長した細根のみを分離した。これを液体培
地にてさらに５ケ月培養した。

（Ｅ）サポニンの抽出および定１：（Ｄ）項で得られた
毛状根薬用人参から常法によりサポニンの抽出および定
量を行った０毛状根薬用人参〔旧培地で得られた毛状根
（ｌ）、および８２に培地で得られた毛状根（２）〕を
乾燥し、それぞれ１次の処理を行った。まず、乾燥物に
メタノール（ＭｅＯＨ）を加えて抽出を行った。メタノ
ール抽出液をエバポレートし、得られたメタノール抽出
物に水を添加してメタノール抽出物水溶液を得た。これ
にエチルエーテル（Ｅｔ、０）を加えて振盪後、エーテ
ル層を除去した。水層にｎ−ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ
）を加えて抽出し、得られたｎ−ブタノール層を水洗し
た。

得られたｎ−ブタノール層をエバポレートし、粗サポニ
ンを得た。

次に、得られた粗サポニンをｎ−ブタノール−酢酸エチ
ル−水（４：　１　：　５）またはクロロホルム−メタ
ノール−水（６５：　３５　：　１０）を展開溶媒とし
て、シリカゲルＦ２５４プレートを用いた薄層クロマト
グラフィーにかけた。１０％硫酸で発色させ。

二波長ＴＬＣスキャンナー（島原社製：　Ｃ５−９１０
）で測定を行った。測定サンプルの波長（λ３）は５３
０ｎｍ。

対照（λ８）は７００ｒ＋＋ｓとした。比較のために、
Ｐｇ−４カルスを用いて同様の方法でサポニン含量の測
定を行った。

上記抽出および定量の操作法の概略を次の」土および工
程２にそれぞれ示す、さらに、測定の結果を下表に示す
。表において、生長比は毛状根もしくはカルスの所定培
養期間における培養開始時と終了時の重量比を示す。サ
ポニン含量は毛状根もしくはカルス１００ｇ　（４重量
）あたりの含有量（■）を示す。

（以下余白） ＸＪＬ影 １０％１Ｉ２ｓＯ，発色 に 波長ＴＬＣスキャンナーで測定 （Ｆ）オパイン（アグロビン、マンノビン）の検出：（
Ｄ）項で得られた毛状ｍ薬用人参（ＭＳ培地使用（１）
〕からＮ、　Ｔａｎａｋａらの方法（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ
１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８５）　４．７４）に従い
、オバインの検出を行った。

まず２毛状根薬用人参に７０％エタノールを加え−ａｒ
ｉｎｇｂｌｅｎｄｅｒで破砕し、１〜２日間の冷浸を２
回繰り返した。吸引濾過して得られた濾液を濃縮乾固後
。

水に溶解させた。これをイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５
Ｈ（ｘ８）　Ｈ”型）カラムにかけ、まず０．２５Ｍピ
リジン−１ｒＩ酢酸を通液し９次いで０．５Ｍピリジン
−１Ｍ酢酸で溶出した。

上記イオン交換樹脂にかける前の粗抽出物（Ｐｇ４　ｒ
ｈｉ（１）　　ｌ）　、　０．２５Ｍピリジン−１Ｍ酢
酸溶出液から蒸発乾固して得られる試料（Ｐｇ　　４　
ｒｈｉ（１）−２）、０．５Ｍピリジン−１Ｍ酢酸溶出
液から蒸発乾固して得られる試料（Ｐｇ　−４ｒｈｉ（
１）　　３　）　、　（Ｄ）項で得られた毛状根薬用人
参（８２に培地使用（２））から同様の方法でカラム処
理して得られる試料〔Ｐｇ　−４ｒｈｉ　（２））　、
マンノピン標品（Ｍ）および、アグロピン標品（Ａ）を
それぞれ水溶液としてＷｈａ　ｔｍａｎｎ　３ＭＭ濾紙
にスポットし、溶媒として蟻酸：酢酸：水（３０：　６
０　：　９１０　）を用い高圧濾紙電気泳動を行った。

５０Ｖ／ｃｍで４０分間泳動後、乾燥し、アルカリ性硝
酸銀呈色法で発色させ（硝酸銀アセトン溶液、　０．５
Ｍ　ＮａＯＨ９５％エタノール溶液、希アンモニア水で
発色）、標品のアグロピンおよびマンノピンのスポット
とそれぞれ比較した。得られた高圧濾紙電気泳動のパタ
ーンを第１図に示す。アグロピンおよびマンノピンの構
造式を次に示す。

Ｏ アグロピン ＨＯＨｚＣ（ＣＨＯＨ）４ＧＨｚ Ｈ ＨＯＯＣＣＨ（ＣＨｚ）ｚｃＯＮＨｚ マンノピン 此Ｊｉｆ生り 感染処理時ににエ　負圏■並亜を含有しない同様の培地
液を用いたこと以外は実施例１に準じ、薬用人参カルス
の処理を行った。この薬用人参カルスからは毛状根が発
生しなかった。

止較■叉 オタネニンジンの葉柄を用い、　２＋　４−Ｄ　ｌｐｐ
ｍを含む旧培地でカルスの誘導を行った。４週間ごとに
１２ケ月間継代培養し、カルス（Ｐｇ−１０１株）を得
た。このカルスをＫｉｎｅｔｉｎ　１　ｐｐｍを含む旧
培地で光照射下にて分化させた。これをＩＢ＾１　ｐｐ
ｍを単独で添加したＭＳ培地上で培養し、根の部分のみ
を分離してさらに培養を続け、培養根（Ｐｇ　−ＩＩＢ
Ａ　Ｉ　’）を得た。

前記実施例１の毛状根がほぼ均一径を有しよく分枝した
細根であるのに対して１本比較例の培養根（所定のホル
モンを加えることによって得られる）は９部分的に芯状
を呈し、カルス塊が認められる不均一でやや太めの径の
細根である。培養液も実施例１が透明であるのに対して
本比較例の場合は白濁している。

本比較例で得られた培養根のサポニン含量を実施例１と
同様の方法で定量した。その結果を下表に示す。

（以下余白） 表から、薬用人参カルスから誘導された毛状根の生長比
は、ホルモンを含有しないＭＳ培地（２０フトについて
実施）においても、　　８２に培地にｈルモンを含有す
る）の場合の薬用人参カルスの生長比とほぼ同等である
ことがわかる。８２に培地においては毛状根の生長比は
さらに大きく、薬用人参カルスのほぼ２．８倍に達する
。サポニン含量については、ジンセッサイドＲｂおよび
Ｒｇの合計量が薬用人参カルスとほぼ同等（いずれも８
２に培地使用の場合）である。カルスに比較して生長速
度が上記のように約２．８倍であることを考慮すると１
毛状根の培養はサポニンの増収に役立つと考えられる。

この毛状根は２毛根病菌の処理を行わずカルスの再分化
により得られる培養根に比較しても約１．８倍の生長比
および約１．６倍のサポニン含量を示す。ジンセッサイ
ドＩ？ｂ群とＲｇ群との比率は培地組織により異なるが
、　Ｒｈ群の含量がＲｇ群よりも高いことがわかる。

第１図から、実施例１により得られる毛状根薬用人参に
はマンノピン（移動度５５ｍｎ）が含有されることが認
められる（Ｐｇ　−４ｒｈｉ（１１−１）　、アグロピ
ンの存在は粗抽出物においては確認されにくいが、カラ
ム精製されたＰｇ　−４ｒｈｉ（１１−３にアグロピン
のスポットが確認された。

このように、■アグロピンおよびマンノピンの生産株で
あるアグロバクテリウム　リゾゲネスの形質が発現され
、これらの化合物が生産されること；■アグロバクテリ
ウム　リゾゲネスを感染させたもののみにおいて毛状根
が得られること；および■ホルモン無添加培地における
生育がもとのカルスに比べて格別に優れること；を考慮
すると。

上記毛根病菌が有するＲｉプラスミドが薬用人参カルス
に導入され、このプラスミドを有する毛状根が得られた
と考えられる。

（発明の効果） 本発明方法によれば、このように、薬用人参カルスに毛
根病菌を感染させることにより毛根病菌が有するＲｉプ
ラスミドが該カルス中に導入され。

その結果５毛状根が誘導される。このＲｉプラスミドが
導入された毛状根を用いると１通常の薬用人参カルスや
薬用人参カルス再分化株から得られる毛根に比較して薬
用人参の有効成分であるサポニンを効果的に得ることが
可能である。

４、　ス　　の　　′　な昔゛■ 第１図は２本発明方法により得られる毛状根からの抽出
物および薬用人参カルスからの抽出物の電気泳動パター
ンである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、薬用人参カルスに毛根病菌を感染させる工程を包含
   する、毛状根薬用人参の誘導法。 ２、前記毛根病菌に由来するＲｉプラスミドが導入され
   た毛状根薬用人参が誘導される特許請求の範囲第１項に
   記載の誘導法。 ３、前記毛根病菌がアグロバクテリウム（￥Ａｇｒｏ−
   ｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）属に属する特許請求の範囲第１
   項に記載の誘導法。 ４、前記毛根病菌がアグロバクテリウム　リゾゲネス（
   ￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥　￥ｒｈｉｚｏｇｅｎ
   ｅｓ￥）である特許請求の範囲第１項に記載の誘導法。 ５、前記薬用人参カルスが、オタネ人参（￥Ｐａｎａｘ
   ｇｉｎｓｅｎｇ￥Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、チクセツ人参
   （￥Ｐａｎａｘｊａｐｏｍｉｃｕｓ￥Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅ
   ｒ）、アメリカ人参（￥Ｐａｎａｘｑｕｉｎｑｕｅｆｏ
   ｌｉｕｍ￥Ｌ．）、三七人参（￥Ｐａｎａｘ￥　￥ｎｏ
   ｔｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ￥〔Ｂｕｒｋ〕Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ
   ）およびシベリア人参（￥Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃ
   ｕｓ￥　￥ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ￥）でなる薬用人参の
   群から選択される少なくとも一種に由来する特許請求の
   範囲第１項に記載の誘導法。